通过氧电极进行厌氧蛋白质纯化与动力学分析以研究DesB双加氧酶活性与抑制作用

摘要

本文介绍了一种在厌氧条件下进行蛋白质纯化、蛋白质浓缩以及后续利用氧电极系统进行动力学表征的实验方案。该方法以DesB酶为例进行说明，DesB是一种双加氧酶，在厌氧环境中纯化和保存时具有更高的稳定性与活性。

摘要

对于氧敏感性蛋白质，包括以氧气作为底物的酶类，在使用传统的有氧纯化方法进行纯化时，其稳定性可能降低。本文详细阐述了厌氧纯化过程中的各项技术细节，包括缓冲液和试剂的配制、在手套箱中进行柱层析的方法，以及在动力学实验前对蛋白质进行脱盐处理。此外，还描述了制备和使用氧电极以对利用氧气的酶进行动力学表征的方法。这些方法以双加氧酶DesB为例进行说明，DesB是一种来自细菌Sphingobium sp. 菌株SYK-6的没食子酸双加氧酶。

引言

利用铁或其他金属激活氧气的酶在纯化过程中常常容易失活，因为它们脱离了细胞内的还原环境。因此，为了确保这些蛋白质具有最佳的酶活性，必须将其以细胞裂解液的形式使用，或添加外源还原剂，或在厌氧条件下进行纯化^1,2,3,4。对于对氧气敏感的酶（特别是含铁酶），必须在维持厌氧条件的前提下完成所有的纯化和表征步骤，才能对其进行充分的表征。为此，研究人员已开发出在厌氧箱内完成整套实验操作的实验室系统，涵盖从蛋白质表达到晶体学分析的各类研究^5,6,7,8。

本文报道了利用氧电极系统对酶 DesB 进行厌氧纯化及其动力学表征的方法。DesB 来源于细菌 Sphingobium sp. 菌株 SYK-6，是一种没食子酸双加氧酶，与同种生物中的原儿茶酸双加氧酶 LigAB 相关。这两种酶均属于 II 型原儿茶酸双加氧酶（PCAD）超家族，该超家族迄今尚未被深入研究

方案

1. 一般材料与方法

1. 按照表1所述配制所有所需培养基。在120 ˚C下高压灭菌15分钟。在加入MgCl₂和葡萄糖后，将SOC溶液通过0.2 µm滤膜进行无菌过滤。在高压灭菌前调节Miller's Lysogeny Broth（LB培养基）溶液的pH值。高压灭菌后，在LB-Amp培养基溶液中补充无菌的0.2 mM L-半胱氨酸溶液，随后加入0.1 mM硫酸亚铁铵溶液，以增强蛋白表达和可溶性。
2. 按照表2所述配制聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）所用的Laemmli缓冲液和电泳缓冲液。在将各组分稀释至最终体积前，使用1 M HCl和Tris碱调节溶液的pH值。
3. 按照表3所述配制蛋白纯化所用的缓冲液。在将各组分稀释至最终体积前，使用1 M HCl和Tris碱调节溶液的pH值。
4. 将配制好的缓冲液转移至可使用单孔橡胶塞密封并装有玻璃管的瓶中。
   1. 使用软管将橡胶塞中的玻璃管连接至真空源。在中等速度搅拌的同时，使溶液在负压下脱气约30分钟。
   2. 首先打破真空密封，然后关闭真空泵。接着，用两根20G针头刺穿橡胶塞（一根足够长以到达瓶底，另一根较短的针头用作排气口）。在中等速度搅拌的同时，持续通入氮气30分钟。
   3. 取出针头，重复脱气和氮气鼓泡过程，共进行三个循环。完成后，用实心橡胶塞将瓶子密....

结果

图中显示了DesB-麦芽糖结合蛋白（MBP）融合构建体纯化过程中各组分的SDS-PAGE凝胶分析结果（图3）。凝胶结果显示该蛋白纯度较高（分子量 = 91.22 kDa），仅可见DesB（分子量 = 49.22 kDa）与MBP蛋白结构域（42 kDa）彼此分离的条带。选择E2和E3组分进行浓缩（步骤4.2）。

DesB 动力学测定结果的可重复性取决于正确的仪器组装、校准和实验技术。必须输入准确的环境温度和压力，因为这些变量决定了 O₂ 的百分比含量。₂ 预期在检测过程中溶于溶液中图 4A）。初始信号应在 1800 至 2000 nmol/mL 之间，并应产生接近零的稳定速率，表明溶液的氧饱和度变化极小（图 4B）。一旦加入连二亚硫酸钠并密封反应室，O₂.......

讨论

获得具有活性的纯化DesB蛋白的关键步骤在于形成并维持酶中还原态的Fe(II)活性位点。因此，正确执行诱导、纯化、浓缩和脱盐步骤对于成功获得有活性的酶至关重要。在含有1 mM硫酸亚铁铵的条件下诱导蛋白表达，可确保Fe(II)正确地整合到DesB的活性位点中。该方法借鉴了诸如酰胺水解酶类金属酶的相关研究，这类金属酶通常需要在培养基中添加金属离子，以实现正确的蛋白折叠并完全占据金属结合位点^6,41,42,43。

在手套箱中进行的厌氧纯化与浓缩可能是本实验方案中最关键且技术难度最高的步骤。必须维持手套箱内的无氧环境，这需要按照说明书要求保持除氧催化剂的活性，当连接的手套箱氮气罐压力不足时定期更换气罐，确保手套箱所附手套无破损，以及在手套箱内放置盛有新鲜干燥剂的托盘。氧气敏感试纸在接触环境氧气时会发生颜色变化₂ 可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷	Gold Bio Technologies	I2481C50
考马斯亮蓝 R-250	Bio-Rad	161-0400
过硫酸铵	Bio-Rad	161-0700
30% 丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0158
N,N'-四甲基乙二胺	Bio-Rad	161-0801
高流速淀粉树脂	新英格兰生物实验室	E8022S
BL21 (DE3) 感受态大肠杆菌细胞	新英格兰生物实验室	C2527I
L-半胱氨酸	Sigma Aldrich	C7352
没食子酸	Sigma Aldrich	G7384
4-硝基邻苯二酚	Sigma Aldrich	N15553
硫酸亚铁铵	Mallinckrodt	5064
连二亚硫酸钠	Alfa Aesar	33381-22
小麦草血清瓶	Fisher Scientific	06-406G
25 mm 带Supor膜的Acrodisc PF注射器滤器	Pall Corportation	4187
400 mL Amicon搅拌式超滤浓缩装置	EMD Millipore	UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa截留分子量再生纤维素膜滤器	EMD Millipore	PLGC07610
DL-二硫苏糖醇	Gold Bio Technologies	DTT50
Sephadex G-25粗脱盐柱	GE Healthcare	17-0033-01
2 mL 压盖小瓶	Fisher Scientific	03-391-38
Oxygraph Plus 电极控制单元	Hansatech Instruments	OXYG1 Plus
氧电极室	Hansatech Instruments	DW1
电极片	Hansatech Instruments	S1
聚四氟乙烯（0.0125 mm×25 mm）30 m卷	Hansatech Instruments	S4
电极清洁套装	Hansatech Instruments	S16
隔垫纸	Zig Zag	可在任意加油站购买
He系列Dri-Lab手套箱	真空/大气公司
HE-493 Dri-Train	真空/大气公司
双头微锥形不锈钢刮刀	Fisher Scientific	21-401-10
DWK生命科学Kimble Kontes Flex柱经济型层析柱	Fisher Scientific	k420400-1530
10 μL，型号701 N SYR，固定NDL 26s规格，2英寸，2号针尖样式注射器	Hamilton	80300
DWK生命科学Kimble Kontes Flex柱经济型层析柱	Fisher Scientific	K420401-1505
Emulsiflex-C5高压均质机	Avestin
B-PER 完全细菌蛋白提取试剂	Thermo Fisher Scientific	89821
来自鸡蛋清的溶菌酶	Sigma Aldrich	12650-88-3
十二烷基硫酸钠	Thermo Fisher Scientific	151-21-3
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	7177-48-2
胰蛋白胨	Fisher Scientific	BP-1421-500
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-2
氯化钠	Fisher Scientific	S271-10
氯化钾	Fisher Scientific	P217-3
氯化镁	Fisher Scientific	M33-500
右旋糖	Fisher Scientific	D16-3
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318-1
Tris盐酸盐	Fisher Scientific	BP153-500
麦芽糖	Fisher Scientific	BP684-500
甘氨酸	Fisher Scientific	G46-500