需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过氧电极进行厌氧蛋白质纯化与动力学分析以研究DesB双加氧酶活性与抑制作用

8.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58307

⸱

2018年10月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wesleyan University

本文内容

摘要

本文介绍了一种在厌氧条件下进行蛋白质纯化、蛋白质浓缩以及后续利用氧电极系统进行动力学表征的实验方案。该方法以DesB酶为例进行说明，DesB是一种双加氧酶，在厌氧环境中纯化和保存时具有更高的稳定性与活性。

摘要

对于氧敏感性蛋白质，包括以氧气作为底物的酶类，在使用传统的有氧纯化方法进行纯化时，其稳定性可能降低。本文详细阐述了厌氧纯化过程中的各项技术细节，包括缓冲液和试剂的配制、在手套箱中进行柱层析的方法，以及在动力学实验前对蛋白质进行脱盐处理。此外，还描述了制备和使用氧电极以对利用氧气的酶进行动力学表征的方法。这些方法以双加氧酶DesB为例进行说明，DesB是一种来自细菌Sphingobium sp. 菌株SYK-6的没食子酸双加氧酶。

引言

利用铁或其他金属激活氧气的酶在纯化过程中常常容易失活，因为它们脱离了细胞内的还原环境。因此，为了确保这些蛋白质具有最佳的酶活性，必须将其以细胞裂解液的形式使用，或添加外源还原剂，或在厌氧条件下进行纯化1,2,3,4。对于对氧气敏感的酶（特别是含铁酶），必须在维持厌氧条件的前提下完成所有的纯化和表征步骤，才能对其进行充分的表征。为此，研究人员已开发出在厌氧箱内完成整套实验操作的实验室系统，涵盖从蛋白质表达到晶体学分析的各类研究5,6,7,8。

本文报道了利用氧电极系统对酶 DesB 进行厌氧纯化及其动力学表征的方法。DesB 来源于细菌 Sphingobium sp. 菌株 SYK-6，是一种没食子酸双加氧酶，与同种生物中的原儿茶酸双加氧酶 LigAB 相关。这两种酶均属于 II 型原儿茶酸双加氧酶（PCAD）超家族，该超家族迄今尚未被深入研究9，部分原因可能在于，使用标准的有氧蛋白纯化方法纯化该超家族的酶时，酶容易失活。由于部分 PCAD 酶表现出底物广谱性，而另一些则具有底物特异性2,10，因此有必要对该超家族进行进一步表征，以鉴定其底物特异性决定因素。正如在多个酶超家族中所观察到的现象11,12,13,14,15，小分子可通过直接竞争性抑制，或结合到独立的别构位点，从而增强或抑制酶活性16。尽管仅凭动力学数据无法区分调节分子的结合位点，但确定酶活性变化的程度对于理解其效应至关重要。因此，本文展示了对天然 DesB 酶活性进行动力学表征的方法，以及在存在 4-硝基儿茶酚（4NC）——一种常用于表征和抑制双加氧酶的化合物2,17,18——条件下的酶活性测定方法。

DesB 能够通过邻位开环双加氧酶（EDO）反应降解没食子酸盐（一种源自木质素的芳香族化合物），该反应以氧气作为底物之一催化芳香环的开环10,19。这一酶促反应发生在木质素降解的背景下，木质素是一种存在于植物细胞壁中的芳香族杂聚物。木质素可被解聚，生成多种芳香族化合物，这些化合物可进一步被分解为中枢代谢物3,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33。邻位开环双加氧酶（EDO）催化二羟基化芳香族化合物的环开裂反应，其中裂解发生在与金属配位的二醇相邻的位置；相比之下，间位开环双加氧酶则在两个羟基之间裂解类似的芳香族化合物（图1）。与其他许多金属酶类似，EDO 具有一个由两个组氨酸和一个羧酸根组成的三联体结构，用于配位 Fe(II) 二价金属中心9,34,35。这些金属酶可通过自氧化或机制依赖性失活而被氧化，从而导致酶失活2,36,37,38。

在本论文所述的实验流程中，我们利用来自细菌Sphingobium sp. SYK-6 的 PCAD 超家族成员 DesB，催化氧气加成到没食子酸的 C4-C5 键上（图 2A）。该裂解反应的区域化学特性与原儿茶酸-4,5-双加氧酶 LigAB 类似（图 2B）。迄今为止，针对这种没食子酸双加氧酶的研究尚未见报道任何可抑制 DesB 的化合物10,19,39。采用有氧纯化方法时，DesB 的活性表现不稳定；而采用厌氧方法后，我们能够稳定地获得具有可重复活性的蛋白。本文所述的动力学研究展示了 DesB 的厌氧纯化方法、DesB 与没食子酸反应的动力学表征，以及 4-硝基邻苯二酚（4NC）对 DesB 的抑制作用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 一般材料与方法

  1. 按照表1所述配制所有所需培养基。在120 ˚C下高压灭菌15分钟。在加入MgCl2和葡萄糖后，将SOC溶液通过0.2 µm滤膜进行无菌过滤。在高压灭菌前调节Miller's Lysogeny Broth（LB培养基）溶液的pH值。高压灭菌后，在LB-Amp培养基溶液中补充无菌的0.2 mM L-半胱氨酸溶液，随后加入0.1 mM硫酸亚铁铵溶液，以增强蛋白表达和可溶性。
  2. 按照表2所述配制聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）所用的Laemmli缓冲液和电泳缓冲液。在将各组分稀释至最终体积前，使用1 M HCl和Tris碱调节溶液的pH值。
  3. 按照表3所述配制蛋白纯化所用的缓冲液。在将各组分稀释至最终体积前，使用1 M HCl和Tris碱调节溶液的pH值。
  4. 将配制好的缓冲液转移至可使用单孔橡胶塞密封并装有玻璃管的瓶中。
    1. 使用软管将橡胶塞中的玻璃管连接至真空源。在中等速度搅拌的同时，使溶液在负压下脱气约30分钟。
    2. 首先打破真空密封，然后关闭真空泵。接着，用两根20G针头刺穿橡胶塞（一根足够长以到达瓶底，另一根较短的针头用作排气口）。在中等速度搅拌的同时，持续通入氮气30分钟。
    3. 取出针头，重复脱气和氮气鼓泡过程，共进行三个循环。完成后，用实心橡胶塞将瓶子密封严实，并用石蜡膜和铜丝（20G）进一步固定，随后放入手套箱中。
      注意：所有材料均需放入手套箱，并对前室进行三次 purge 操作，随后抽真空除去氧气并重新充入氮气。用于纯化和浓缩的缓冲液可密封后长期保存于手套箱内。
  5. 在1.5 mL微量离心管中，将约一勺（0.31" x 2"，双端微锥形不锈钢药匙的小端）连二亚硫酸钠溶于约1 mL脱气水中，配制连二亚硫酸钠溶液。在从手套箱中取出前，用石蜡膜密封管口。
    注意：固体连二亚硫酸钠应储存于手套箱内，以防氧化。

2. 蛋白质纯化用淀粉柱的制备

  1. 将高流速直链淀粉树脂（15 mL）与5倍柱体积（75 mL）的直链淀粉柱缓冲液混合制成浆液。将树脂浆液转移至两个50 mL血清瓶中，并用橡胶隔垫密封每个瓶子。用20G、305 mm针头刺穿隔垫，向浆液中通入氮气约1分钟，以去除悬浮液中的氧气。将树脂和含蛋白溶液转移至手套箱中。
  2. 在手套箱内，将树脂倒入装有简易旋塞的2 × 30 cm硼硅酸盐玻璃柱中，让树脂自然沉降形成平整的柱床。排尽柱缓冲液，并使用加压氮气以约每秒1滴或5 mL/min的流速，将3倍柱体积（总计约30 mL）脱气的直链淀粉柱缓冲液通过树脂进行柱子平衡，直至液体液面刚好位于树脂床上方。
    注意：蛋白洗脱后（见下文步骤3.5），可通过以下步骤再生直链淀粉柱树脂：先用1倍柱体积（10 mL）水洗涤，再用1倍柱体积的1%十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤，最后用3倍柱体积（30 mL）水冲洗。此步骤可在手套箱外完成。柱树脂可保存在4 °C的20%乙醇中，最多可再生5次。

3. DesB蛋白的表达及厌氧纯化

注意：DesB 基因为商业合成，已通过 NdeI 和 BamHI 限制性克隆位点插入 pET-15b、pET-32a 和 pMAL-c5x 载体中。

  1. 根据制造商的说明完成蛋白质表达检测，以确定大规模表达的合适条件（简要描述如下）。
    1. 按照制造商的说明，将含有 DesB 的质粒转化至市售的化学感受态 E. coli BL21 (DE3) 细胞中。简要步骤如下：将细胞在冰上解冻 10 分钟，向细胞混合物中加入约 10–50 ng 质粒 DNA，在 42 °C 热激 10 秒，再于冰上孵育 5 分钟。加入 SOC 培养基至终体积为 1 mL，并在 37 °C 下振荡培养（约 200 rpm）60 分钟。取 100 µL 细胞溶液加入 LB-Amp 平板，涂布均匀后于 37 °C 过夜培养。
    2. 从过夜培养的平板上挑选单个菌落，用该菌落接种 10 mL LB-Amp 培养基，于 37 °C 振荡（约 200 rpm）过夜培养。
    3. 取 10 mL 培养基，加入 100 µL 过夜培养的菌液，按步骤 3.1.2 所述条件在 37 °C 振荡培养。当 600 nm 处的光密度（OD600）达到 0.4–0.8 时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使终浓度为 1 mM。
    4. 立即取 1 mL 溶液 aliquot，转移至标记为时间 = 0 小时的 1.5 mL 微量离心管中。在 15,000 × g 下离心 10 分钟以收集细胞沉淀。离心后弃去上清液，将细胞沉淀储存在 4 °C。
    5. 在加入 IPTG 后的不同时间点（通常为 5、10、12、18 和 24 小时）再分别取 1 mL aliquot。如步骤 3.1.4 所述，对每管样品进行离心，弃去上清液，并将细胞沉淀在 4 °C 下保存。
    6. 收集完所有 aliquot 后，将每个时间点的细胞沉淀重悬于 30 µL 细菌蛋白提取液中，室温孵育 10–15 分钟，然后在 15,000 × g 下离心 5 分钟，以分离可溶性与不溶性蛋白。
    7. 将可溶性蛋白溶液转移至新的微量离心管中，并用 30 µL 细菌蛋白提取液重悬剩余的不溶性沉淀。
    8. 将每个时间点的可溶性和不溶性组分各取 30 µL，分别与等体积的 Laemmli 缓冲液混合，随后在 SDS-PAGE 凝胶上进行检测40。选择可溶性组分中出现正确大小条带的条件，用于后续的大规模蛋白表达与纯化。
      注：由于上述条件下初始产生的可溶性蛋白较少，尝试添加多种补充物以测试其对可溶性蛋白表达的影响，发现 0.2 mM L-半胱氨酸和 0.1 mM 硫酸亚铁铵可增强蛋白表达。根据该蛋白表达筛选结果，适合 DesB 可溶性表达的载体为 pMAL-c5x 载体。
  2. 将 DesB/pMal-c5x 转化至 Escherichia coli BL21 (DE3) 后，取 900 µL 过夜振荡培养（37 °C，200 rpm）的菌液与 100 µL 80% 甘油混合，制备菌种保存液。将保存液置于冻存管中，于 -80 °C 保存。
    注：建议每 6–8 个月重新制备一次新的冷冻保存菌种。
  3. 用移液枪头刮取冷冻保存菌种中的细胞，接种于 5 mL LB-Amp 培养基中，在 37 °C 振荡培养过夜。取该过夜培养物接种至 2 L 锥形瓶中的 1.5 升 LB-Amp 培养基中，在 37 °C、200 rpm 条件下培养。
    注：由于该蛋白对氧气敏感，实验发现减小瓶内顶空体积并采用中等振荡速度可提高大规模表达时的蛋白产量。
  4. 当 600 nm 处的光密度（OD600）达到 0.4–0.8 时，加入 1 mM IPTG 诱导蛋白表达，并补充 0.2 mM L-半胱氨酸和 0.1 mM 硫酸亚铁铵。将培养温度降至 30 °C，继续以 200 rpm 振荡培养。诱导 24 小时后，在 4,700 × g 下离心 10 分钟收集细胞，弃去上清培养基。
  5. 每 1.5 L 培养物用 20 mL 淀粉柱缓冲液重悬细胞沉淀，并加入 1 mg 溶菌酶。在冰上搅拌 20 分钟。
    注：若溶液过于黏稠，可适量增加缓冲液体积，因过黏的蛋白溶液可能干扰后续的均质化步骤。
  6. 通过高压均质法裂解重悬的细胞溶液，压力约为 15,000 psi，进行 3–5 次循环。将裂解液转移至 50 mL 离心管中，用氮气冲洗顶空 1 分钟。随后在 20,000 × g 下离心 40 分钟，去除不溶性碎片。
    注：成功的均质化会使蛋白在流经管道进入收集瓶时形成微团，溶液呈半透明的灰褐色。整个过程中应将均质后的蛋白保持在冰上。
  7. 离心后，将上清液转移至 50 mL 管中（可能需要多个管），用橡胶隔垫封口，并用 20 号针头缓慢向溶液中通入氮气 2 分钟，以置换氧气。用石蜡膜包裹隔垫，并用铜丝进一步固定，随后将上清液连同层析柱材料一同带入手套箱中。
  8. 平衡层析柱（见步骤 2.3），将蛋白上清液上样至柱中。在中等氮气压力下（1 滴/秒或约 5 mL/min）收集流出液，每 5 mL 收集一管。随后用 3 倍柱体积的淀粉柱缓冲液洗涤层析柱，在中等氮气压力下（约 5 mL/min）手动收集玻璃试管中的 3 mL 流分。最后用 5 倍柱体积（约 50 mL）的洗脱缓冲液洗脱蛋白，并在中等氮气压力下（约 5 mL/min）手动收集 3 mL 流分。
    注：也可采用重力过滤方式收集流分。通常应收集约 12 个洗脱流分。
  9. 取各流分的 30 µL aliquot，将其移出手套箱，以便通过 SDS-PAGE 分析确定含蛋白的流分。
    注：在检测期间，其余收集的流分仍保留在手套箱内。纯化的 DesB 通常在第 3 至第 5 个洗脱流分中被洗脱出来。

4. 厌氧蛋白质浓缩/缓冲液置换

  1. 组装加压式搅拌池浓缩装置，并安装一个76 mm的再生纤维素膜滤器（截留分子量为10 kDa）。向浓缩装置中加入足量20%乙醇，以确保在将组装好的浓缩装置转移至手套箱过程中保持膜的湿润。
    注意：确保膜无破损，O型圈无褶皱。
  2. 将搅拌池浓缩装置带入手套箱后，用水冲洗掉膜上的乙醇溶液。盖紧盖子并对搅拌池加压，以清除管路和膜上残留的多余水分。
  3. 将根据SDS-PAGE（图3）确定含有蛋白质的所有组分加入浓缩装置中。加入足够的置换缓冲液，使蛋白质溶液总体积达到150 mL。
  4. 使用外部N2气源对搅拌池腔室加压，并在中等搅拌速度下将蛋白质浓缩至50 mL。
    注意：浓缩至50 mL约需20分钟。
  5. 在100 mL置换缓冲液中添加0.1 mM二硫苏糖醇（DTT）和0.1 mM硫酸亚铁铵，将该溶液加入搅拌池中，并在中等搅拌速度下将蛋白质浓缩至总体积50 mL。
  6. 当溶液体积达到50 mL后，再次加入上述添加了成分的置换缓冲液，但在中等搅拌速度下将溶液浓缩至总体积10 mL。
  7. 使用孔径为0.45 µm的注射器滤器过滤浓缩后的蛋白质溶液，并分装至各0.2 mL聚合酶链式反应（pcr）管中（每管约含150 µL蛋白质溶液）。将加盖的分装样品从手套箱中取出，并立即用液氮速冻。将分装样品于-80 °C保存。

5. DesB 脱盐

  1. 使用前，用氮气冲洗手套袋约1.5小时。
  2. 在手套袋内，将150 µL纯化的DesB蛋白置于冰上解冻。
  3. 蛋白解冻的同时，准备一个小型重力脱盐柱，内含3 mL粗颗粒Sephadex G-25脱盐凝胶，装于9 mL硼硅酸盐层析柱中。用2个柱体积（约6 mL）的脱气脱盐缓冲液洗涤该柱。
    注意：当脱盐凝胶颜色由白色变为黄色时（约使用7次后），应更换凝胶。
  4. 通过重力控制的方式将解冻后的DesB上样至柱中。弃去穿流液。用约5 mL脱盐缓冲液洗脱蛋白。
    注意：气体钢瓶持续向手套袋内充气所产生的压力会影响溶液从柱中滴下的速度。
  5. 为初步确定蛋白从柱中的洗脱情况，收集12管洗脱液（每管含3滴）。用橡胶隔垫密封后，将其从手套袋中取出，并直接（通过SDS-PAGE凝胶分析）或间接（通过检测各组分活性）检测蛋白的存在。
    注意：通常按照步骤7.1所述方法分别检测各组分的活性，活性最高者对应于活性蛋白浓度最高的组分。DesB通常从第7滴开始洗脱，随后收集接下来的9滴脱盐蛋白。在动力学测定期间（步骤7.1–7.4），蛋白分装样品需置于冰上保存。

6. 准备氧电极

  1. 使用电极清洁剂和湿润的棉签擦拭银阳极环和铂阴极，直至看不到黑色氧化物沉积物的痕迹。
  2. 用剪刀剪下一小块约1.5英寸见方的隔片纸（或卷烟纸，效果同样良好）。然后在正方形的每个面上剪出小三角形，并在四个角上剪出切口，以便于包裹电极。
  3. 在银阳极凹槽中加入5滴50%的KCl溶液，并使其连接成一个连续的液环。在铂电极顶部加入2滴50%的KCl溶液。小心地将隔片纸放置在铂电极上方，并轻轻抚平，确保无气泡产生。
    注意：操作时需小心，避免撕裂隔片纸。
  4. 剪取一段长约2英寸的S4 30m PTFE（聚四氟乙烯）膜，将其放置在隔片纸上。修剪膜的边缘，使其与电极的外环对齐。
  5. 使用O形圈安装工具，将小O形圈推入电极上，以固定隔片纸和膜。将较大的O形圈放入电极的圆形凹槽中，确保其下方没有膜。将电极的上部腔体滑入基座，并旋紧两者。
    注意：若腔体侧面无气泡附着，则表示已正确旋紧。
  6. 将组装好的电极置于基座上，并连接至监测系统。启动电极控制程序，执行液相校准流程（图4A）进行校准。温度变量应设为实验所在房间的温度，环境压力变量则根据所在地区及当前天气状况设定。
    注意：环境压力可从当地天气报告中获取。
  7. 向电极腔内加入1 mL 25 mM Tris缓冲液，插入活塞，开始对氧饱和溶液进行校准，并将搅拌速度调节至100。待电极稳定后，确定氧饱和溶液的校准设定值（图4B）。
  8. 不取出活塞，使用1.2 × 40 mm针头和1 mL注射器，小心地向腔内注入约1 mL连二亚硫酸钠溶液，注意避免引入气泡（图4C）。加入连二亚硫酸钠后，立即用橡胶塞密封电极腔。
  9. 继续校准过程，直至所有氧气被消耗，程序完成，并保存校准结果（图4D）。用去离子水反复冲洗活塞和腔体5–6次，以彻底清除连二亚硫酸钠。冲洗时使用连接有移液枪头的塑料管，并接入侧臂真空瓶。注意避免损坏膜。

7. 使用氧电极进行动力学测定

  1. 通过在含有25 mM Tris缓冲液（pH 7.5）和100 µM没食子酸盐的溶液中，逐次检测1 µL酶溶液的活性，确定含有活性蛋白的脱盐等分试样。在后续实验中使用活性最高的等分试样。（参见步骤5.5.1）
  2. 使用配备电极控制单元并经计算机集成的O2敏感型Clark电极，通过测量O2消耗量来确定酶促反应速率。
    1. 对于DesB的每个动力学数据点测量，向电极室中加入1 mL 25 mM Tris缓冲液（pH 7.5）。加入适量25 mM没食子酸盐储备液至Tris缓冲液中，以达到所需的最终底物浓度（0.05–25 mM）。
      注意：每天需用蒸馏水新鲜配制没食子酸盐及抑制剂化合物的储备液，必要时用0.1 mM NaOH调节pH至7.5。
    2. 搅拌10秒以充分混匀溶液后，缓慢插入活塞并旋紧顶盖密封电极室。可用洁净纸巾吸除从室中溢出的多余液体。让电极平衡至少1分钟，直至其能稳定测定溶液中的氧浓度（背景O2消耗速率在±0.5 µM/min范围内），然后进行酶的添加。
    3. 使用气密性10 µL注射器，通过活塞向电极室中加入约1 µL酶液（酶浓度约为3–7 µM）。
      注意：可根据特定等分试样的实测活性适当增减酶量，以确保反应速率足够。
    4. 根据加酶后前30秒线性数据的斜率计算反应速率，并利用加酶前30秒的数据校正背景O2消耗。催化速率等于O2消耗速率（图5A）。
    5. 在获得某一底物浓度下的速率数据后，通过连接侧臂真空瓶的塑料管抽吸清空电极室，并重复用水冲洗4–6次。按照步骤7.2.1所述方法，使用新的底物浓度重新配置电极室中的溶液。
    6. 以无序方式改变底物浓度，并在整个实验过程中进行重复测定，以校正随时间推移酶活性下降的影响（图5B）。
      注意：当某特定浓度的重复实验显示反应速率比早期结果下降超过30%时，应停止使用该批酶进行进一步测定。通常在进行30–40次测定后，酶活性会下降约30%。
    7. 使用GraphPad Prism软件，将各底物浓度下的数据按Michaelis−Menten方程进行最小二乘法拟合，确定动力学参数：kcat（底物转化为产物的催化常数）和Km（米氏常数，操作定义为初始反应速率达到最大速度一半时的底物浓度）（图6）。
  3. 加入4-硝基邻苯二酚（4NC）以测试其对双加氧反应动力学的影响，并测定其对DesB的抑制常数（Ki）。对于每种反应条件，将Tris（50 mM）、没食子酸盐（25 mM）和4NC（25 mM）的储备液混合后用水稀释，配制成2 mL含25 mM Tris缓冲液（pH 7.5）、1 mM没食子酸盐及不同浓度4NC的溶液。通过调整4NC的体积，获得所需的最终抑制剂浓度（0.05–20 mM）。
    1. 搅拌10秒使溶液充分混合后，缓慢将活塞插入电极室并旋紧顶盖。可用洁净纸巾吸除溢出的多余液体。让电极平衡至少1分钟，直至其能稳定测定溶液中的氧浓度（背景O2消耗速率在±0.5 µM/min范围内），然后进行酶的添加。
    2. 如前所述，加入蛋白（步骤7.2.3），测定反应速率（步骤7.2.4），并为下一个条件重置电极。
    3. 作为本系列实验的一部分，需多次测定无抑制剂条件下的反应速率。通过将含1 mM底物及不同浓度抑制剂条件下的氧气消耗速率与无抑制剂条件下的速率（v/vo）进行标准化，来确定抑制程度。
    4. 使用绘图软件，先将没食子酸盐双加氧反应的抑制数据按公式7.3A拟合，再将抑制数据按公式7.3B拟合（图7）。
  4. 在完成所有动力学测定后，通过Bradford法测定每次实验的精确酶浓度。
    注意：所有反应速率均已根据酶浓度进行校正。此步骤无需在手套箱或手套袋中进行。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图中显示了DesB-麦芽糖结合蛋白（MBP）融合构建体纯化过程中各组分的SDS-PAGE凝胶分析结果（图3）。凝胶结果显示该蛋白纯度较高（分子量 = 91.22 kDa），仅可见DesB（分子量 = 49.22 kDa）与MBP蛋白结构域（42 kDa）彼此分离的条带。选择E2和E3组分进行浓缩（步骤4.2）。

DesB 动力学测定结果的可重复性取决于正确的仪器组装、校准和实验技术。必须输入准确的环境温度和压力，因为这些变量决定了 O₂ 的百分比含量。2 预期在检测过程中溶于溶液中图 4A）。初始信号应在 1800 至 2000 nmol/mL 之间，并应产生接近零的稳定速率，表明溶液的氧饱和度变化极小（图 4B）。一旦加入连二亚硫酸钠并密封反应室，O₂...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

获得具有活性的纯化DesB蛋白的关键步骤在于形成并维持酶中还原态的Fe(II)活性位点。因此，正确执行诱导、纯化、浓缩和脱盐步骤对于成功获得有活性的酶至关重要。在含有1 mM硫酸亚铁铵的条件下诱导蛋白表达，可确保Fe(II)正确地整合到DesB的活性位点中。该方法借鉴了诸如酰胺水解酶类金属酶的相关研究，这类金属酶通常需要在培养基中添加金属离子，以实现正确的蛋白折叠并完全占据金属结合位点6,41,42,43。

在手套箱中进行的厌氧纯化与浓缩可能是本实验方案中最关键且技术难度最高的步骤。必须维持手套箱内的无氧环境，这需要按照说明书要求保持除氧催化剂的活性，当连接的手套箱氮气罐压力不足时定期更换气罐，确保手套箱所附手套无破损，以及在手套箱内放置盛有新鲜干燥剂的托盘。氧气敏感试纸在接触环境氧气时会发生颜色变化2 可...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

我们感谢卫斯理大学的 Camille Keller 博士提供的技术支持。特别感谢不列颠哥伦比亚大学的 Lindsay D. Eltis 教授和 Jenna K. Capyk，以及德克萨斯大学奥斯汀分校的 Christian Whitman，感谢他们在厌氧蛋白纯化方法及使用对 O2-敏感电极方面的建议。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷Gold Bio TechnologiesI2481C50
考马斯亮蓝 R-250Bio-Rad161-0400
过硫酸铵Bio-Rad161-0700
30% 丙烯酰胺Bio-Rad161-0158
N,N'-四甲基乙二胺Bio-Rad161-0801
高流速淀粉树脂新英格兰生物实验室E8022S
BL21 (DE3) 感受态大肠杆菌细胞新英格兰生物实验室C2527I
L-半胱氨酸Sigma AldrichC7352
没食子酸Sigma AldrichG7384
4-硝基邻苯二酚Sigma AldrichN15553
硫酸亚铁铵Mallinckrodt5064
连二亚硫酸钠Alfa Aesar33381-22
小麦草血清瓶Fisher Scientific06-406G
25 mm 带Supor膜的Acrodisc PF注射器滤器Pall Corportation4187
400 mL Amicon搅拌式超滤浓缩装置EMD MilliporeUFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa截留分子量再生纤维素膜滤器EMD MilliporePLGC07610
DL-二硫苏糖醇Gold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25粗脱盐柱GE Healthcare17-0033-01
2 mL 压盖小瓶Fisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus 电极控制单元Hansatech InstrumentsOXYG1 Plus
氧电极室Hansatech InstrumentsDW1
电极片Hansatech InstrumentsS1
聚四氟乙烯（0.0125 mm×25 mm）30 m卷Hansatech InstrumentsS4
电极清洁套装Hansatech InstrumentsS16
隔垫纸Zig Zag可在任意加油站购买
He系列Dri-Lab手套箱真空/大气公司
HE-493 Dri-Train真空/大气公司
双头微锥形不锈钢刮刀Fisher Scientific21-401-10
DWK生命科学Kimble Kontes Flex柱经济型层析柱Fisher Scientifick420400-1530
10 μL，型号701 N SYR，固定NDL 26s规格，2英寸，2号针尖样式注射器Hamilton80300
DWK生命科学Kimble Kontes Flex柱经济型层析柱Fisher ScientificK420401-1505
Emulsiflex-C5高压均质机Avestin
B-PER 完全细菌蛋白提取试剂Thermo Fisher Scientific89821
来自鸡蛋清的溶菌酶Sigma Aldrich12650-88-3
十二烷基硫酸钠Thermo Fisher Scientific151-21-3
氨苄青霉素Sigma Aldrich7177-48-2
胰蛋白胨Fisher ScientificBP-1421-500
酵母提取物Fisher ScientificBP1422-2
氯化钠Fisher ScientificS271-10
氯化钾Fisher ScientificP217-3
氯化镁Fisher ScientificM33-500
右旋糖Fisher ScientificD16-3
氢氧化钠Fisher ScientificS318-1
Tris盐酸盐Fisher ScientificBP153-500
麦芽糖Fisher ScientificBP684-500
甘氨酸Fisher ScientificG46-500

参考文献

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491(2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249(2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469(1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106(2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71(2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1(2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420(2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

通过氧电极进行厌氧蛋白质纯化与动力学分析以研究DesB双加氧酶活性与抑制作用
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。