使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

摘要

本文介绍了两种细胞外囊泡的分离方案：超滤离心法和密度梯度超速离心法，用于从小鼠支气管肺泡灌洗液样本中分离细胞外囊泡。通过这两种方法获得的小鼠支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡均进行了定量和表征。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类新近发现的亚细胞组分，在生理和病理状态下多种生物学信号传导功能中发挥重要作用。由于每种技术本身存在局限性，EVs 的分离纯化在该领域中仍是一个主要挑战。差速超速离心结合密度梯度离心法是一种常用方法，被公认为 EVs 分离的金标准操作流程。然而，该方法耗时较长、劳动强度大，且通常可扩展性较低，可能不适用于支气管肺泡灌洗液等小体积样本。我们证明，超滤离心分离法操作简便，节省时间和人力，同时可实现较高的回收率和纯度。我们建议，该分离方法可作为 EVs 分离的一种替代方案，尤其适用于小体积生物样本的 EVs 分离。

引言

外泌体是细胞外囊泡（EVs）中最小的亚群，直径为50–200 nm，在多种信号传导过程中具有多重生物学功能^1,2,3,4,5。它们主要通过脂质、蛋白质和核酸等 cargo 分子介导细胞间通讯，从而调控细胞和组织的稳态^6,7,8,9。EV 研究中的一个关键步骤是分离过程。差速超速离心法（UC），无论是否结合密度梯度离心（DGC），被认为是金标准方法，但该方法存在重大局限性，包括EV回收率低和可扩展性差^10,11,12，这限制了其最佳应用范围，仅适用于较大体积的样本，如细胞培养上清液或高产量外泌体样本。其他方法的优缺点已有充分描述，例如基于超滤或层析的尺寸排阻法、基于微珠或层....

方案

所有动物使用及相关操作程序均经西达斯-西奈医学中心（CSMC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集与制备

1. 支气管肺泡灌洗液采集
   1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（300 mg/kg）和赛拉嗪（30 mg/kg）混合物实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
   2. 将22 G套管针插入气管。连接含有1 mL冰冷无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的胰岛素注射器，通过套管针向双肺灌注1 mL DPBS。
   3. 缓慢回抽注射器活塞以收集支气管肺泡灌洗液（BALF），并将 BALF 滴入一个 50 mL 锥形管中。将 BALF 置于冰上保存。
   4. 重复步骤 1.1.2 和 1.1.3，共 3 次（每只小鼠总计 4 次）。
      注意：每毫升灌注液通常可回收约 0.8 mL。此外，以下步骤可对单只小鼠分别进行即，3 mL的BALF），但合并多个BALF样本可获得更大量的EVs，以确保后续实验的一致性。
2. 支气管肺泡灌洗液制备
   1. 将25只小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）混合，均分为两份（每份约35 mL）。
   2. 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟，去除BALF中的细胞及其他细胞碎片，收集上清液。
   3. 在4 °C、1,....

结果

我们于同一天采用超滤离心法（UFC）和超速离心密度梯度离心法（UC-DGC）从小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离细胞外囊泡（EV）。UFC 方法耗时约 2.5–3 小时，而 UC-DGC 技术需要 8 小时的处理时间。此时间不包括缓冲液和试剂的准备时间。需要注意的是，在长时间离心过程中可同时进行其他实验操作。尽管如此，UC-DGC 分离技术的整个流程几乎持续了一整天。

通过UFC法分离的正常小鼠BALF来源EVs表现出较小的粒径和更均一的粒径分布（148.8 ± 1.1 nM， 图1A）相较于 UC-DGC EVs（176.7 ± 7.8 nM， 图1B）。与UC-DGC分离法相比，UFC技术的总颗粒数显著高出65倍（29.4 ± 18.4 与 0.5 ± 0.1 × 10¹⁰ 颗粒；

讨论

在过去的几十年中，科学家们揭示了细胞外囊泡（EVs）在细胞稳态中的重要意义。更重要的是，EVs通过其生物活性货物分子调控邻近及远端细胞，在多种疾病过程中发挥关键作用^{1,21,22,26,27,28,29,30}。该领域的未来发展与进步在很大程度上依赖于可靠且高效的方法，这些方法不仅能够识别并分离出正确的EV亚群，还能保持其生物学功能以用于后续应用^10,11,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
Amicon Ultra-15 离心滤器 Ultracel-100K	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	UFC910024
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Corning Cellgro, Manassas, VA	21-031-CV
蔗糖	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	EMD8550
HEPES	Research Products International, Prospect, IL	75277-39-3
EDTA	Corning Cellgro, Manassas, VA	46-034-CI
氯化钠	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	S3014-1KG
OptiPrep	Sigma-Millipore, St. Louis, MO	MKCD9753	密度梯度介质
氯胺酮	VetOne, Boise, ID	13985-702-10
赛拉嗪	Akorn Animal Health, Lake Forest, IL	59399-110-20
1 mL 注射器	BD Syringe, Franklin Lakes, NJ	309656
20 G 血管导管	BD Syringe, Franklin Lakes, NJ	381703
15 mL 离心管	VWR, Radnor, PA	89039-666
50 mL 离心管	Corning Cellgro, Manassas, VA	430828
双辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒	Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL	23235
兔抗小鼠 TSG101 抗体	AbCam, Cambridge, MA	AB125011
大鼠抗小鼠 PE-CD63 抗体	Biolegend, San Diego, CA	143904
CD81
CD9
抗兔 IgG HRP 标记抗体	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	7074S
4x LDS
10x 还原剂（Bolt）
10x 裂解缓冲液（Bolt）	Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 丙烯酰胺凝胶	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	NW04120
iBlot 2 硝酸纤维素小型转印膜堆	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	IB23002
化学发光 HRP 抗体检测试剂 HyGLO	Denville Scientific, Holliston, MA	E2400
17 mL 超速离心管	Beckman Coulter, Pasadena, CA	337986
38.5 mL 超速离心管	Beckman Coulter, Pasadena, CA	326823
Corning SFCA 0.2 µm 孔径注射器滤器	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	09-754-13
设备
离心机	Eppendorf, Hamburg, Germany	-
超速离心机	Beckman Coulter, Pasadena, CA	-
Nanosight（NS300）	Malvern, Worcestershire, UK	-	用于测量颗粒大小分布和颗粒浓度
MACSQuant Analyzer 10 流式细胞仪	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	-
iBlot 转印装置	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA	-
Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统	Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10			分析软件