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方法文章

使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/58310

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2018年11月9日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

本文内容

摘要

本文介绍了两种细胞外囊泡的分离方案：超滤离心法和密度梯度超速离心法，用于从小鼠支气管肺泡灌洗液样本中分离细胞外囊泡。通过这两种方法获得的小鼠支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡均进行了定量和表征。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类新近发现的亚细胞组分，在生理和病理状态下多种生物学信号传导功能中发挥重要作用。由于每种技术本身存在局限性，EVs 的分离纯化在该领域中仍是一个主要挑战。差速超速离心结合密度梯度离心法是一种常用方法，被公认为 EVs 分离的金标准操作流程。然而，该方法耗时较长、劳动强度大，且通常可扩展性较低，可能不适用于支气管肺泡灌洗液等小体积样本。我们证明，超滤离心分离法操作简便，节省时间和人力，同时可实现较高的回收率和纯度。我们建议，该分离方法可作为 EVs 分离的一种替代方案，尤其适用于小体积生物样本的 EVs 分离。

引言

外泌体是细胞外囊泡（EVs）中最小的亚群，直径为50–200 nm，在多种信号传导过程中具有多重生物学功能1,2,3,4,5。它们主要通过脂质、蛋白质和核酸等 cargo 分子介导细胞间通讯，从而调控细胞和组织的稳态6,7,8,9。EV 研究中的一个关键步骤是分离过程。差速超速离心法（UC），无论是否结合密度梯度离心（DGC），被认为是金标准方法，但该方法存在重大局限性，包括EV回收率低和可扩展性差10,11,12，这限制了其最佳应用范围，仅适用于较大体积的样本，如细胞培养上清液或高产量外泌体样本。其他方法的优缺点已有充分描述，例如基于超滤或层析的尺寸排阻法、基于微珠或层析柱的免疫亲和分离法以及微流控技术；现代辅助技术也已发展，以克服并最小化每种方法的技术局限11,12,13,14,15。已有研究显示，使用滤芯中带有纳米多孔膜的超滤离心法（UFC）是一种可替代的技术，其纯度可与UC方法相媲美16,17,18。该技术可被视为一种替代性分离方法。

支气管肺泡灌洗液（BALF）含有细胞外囊泡（EVs），在多种呼吸系统疾病中具有多种生物学功能19,20,21,22。由于支气管镜检查对人体具有侵入性，且灌洗液回收量有限，研究来源于BALF的EVs面临一定挑战。在小动物（如小鼠）中，正常肺组织条件下仅能回收数毫升灌洗液，在炎症或纤维化肺组织中回收量更少23。因此，通过差速超速离心法收集足够量的BALF用于EV分离及后续实验可能难以实现。然而，准确分离EV群体是研究其生物学功能的关键因素。在已建立的EV分离方法中，效率与有效性的平衡仍是一个持续存在的难题。

在本研究中，我们证明了采用截留分子量为100 kDa（MWCO）的纳米膜滤器单元的离心超滤方法适用于支气管肺泡灌洗液（BALF）等小体积生物样本。该技术操作简便、高效，可提供高纯度和可扩展性，有助于支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡（EVs）的研究。

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方案

所有动物使用及相关操作程序均经西达斯-西奈医学中心（CSMC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1. 小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集与制备

  1. 支气管肺泡灌洗液采集
    1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（300 mg/kg）和赛拉嗪（30 mg/kg）混合物实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
    2. 将22 G套管针插入气管。连接含有1 mL冰冷无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的胰岛素注射器，通过套管针向双肺灌注1 mL DPBS。
    3. 缓慢回抽注射器活塞以收集支气管肺泡灌洗液（BALF），并将 BALF 滴入一个 50 mL 锥形管中。将 BALF 置于冰上保存。
    4. 重复步骤 1.1.2 和 1.1.3，共 3 次（每只小鼠总计 4 次）。
      注意：每毫升灌注液通常可回收约 0.8 mL。此外，以下步骤可对单只小鼠分别进行即，3 mL的BALF），但合并多个BALF样本可获得更大量的EVs，以确保后续实验的一致性。
  2. 支气管肺泡灌洗液制备
    1. 将25只小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）混合，均分为两份（每份约35 mL）。
    2. 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟，去除BALF中的细胞及其他细胞碎片，收集上清液。
    3. 在4 °C、1,500 × g条件下离心上清液10分钟，以去除细胞碎片。收集上清液，进行细胞外囊泡（EV）分离步骤。

2. 从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

注意：本研究采用两种细胞外囊泡（EV）分离技术，即超滤离心（UFC）和使用浮力密度的超速离心法，用于从支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离EV。每种方法的详细实验步骤如下所述。

  1. 超滤离心（UFC）富集方法
    注意：本方法改编自先前描述的方案10。
    1. 将步骤1.2.3中的上清液通过0.2 μm无菌注射器滤膜过滤，并将滤过的BALF置于冰上保存。
      注意：此为尺寸排阻步骤，仅收集小于200 nm的囊泡。
    2. 用无菌DPBS平衡100 kDa截留分子量的离心过滤装置10分钟。在4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟，弃去DPBS。
      警告：一旦滤器装置中的膜被DPBS平衡后，必须始终保持湿润，直至装置使用完毕。
    3. 将步骤2.1.1中获得的15 mL BALF样品加入过滤装置中，在4 °C条件下以3,000 × g离心30分钟。穿过滤膜的BALF可弃去，或收集至另一标准离心管中，并于-80 °C保存以备后续使用。
    4. 对剩余的0.2 µm滤过BALF重复步骤2.1.3。
      注意：从初始体积35 mL的BALF中充分浓缩EVs通常需要进行三次离心，最终得到1–1.5 mL的截留液。
    5. 用14 mL无菌DPBS通过反复轻柔吹打清洗截留液。在4 °C条件下以3,000 × g离心30分钟，去除DPBS并进一步浓缩EV截留物。
    6. 将移液器插入过滤装置底部，采用左右扫动的方式吸取样品，以确保完全回收浓缩的BALF来源EVs。
    7. 将BALF来源EVs分装后于-80 °C保存，用于后续颗粒定量与表征（见步骤3）。
  2. 差速超速离心（UC）结合浮力密度梯度离心（DGC）
    注意：以下方案改编自先前描述的方法24。
    1. 将步骤2.1.1中的上清液转移至37 mL超速离心管中，在4 °C条件下使用超速离心机以10,000 × g离心30分钟。收集上清液后，在4 °C条件下以100,000 × g离心60分钟。在EV沉淀离心过程中，准备不同浓度的浮力密度梯度缓冲液（表1），用于步骤2.2.3。
    2. 弃去上清液，将EV沉淀用200 μL DPBS重悬。
    3. 将EV悬液与300 μL 50%碘克沙醇工作液（表1）混合，转移至15 mL超速离心管中。在50%碘克沙醇-EV混合悬液上方，按从下到上的顺序依次叠加以下缓冲液：30%碘克沙醇（4.5 mL）、25%碘克沙醇（3 mL）、15%碘克沙醇（2.5 mL）和5%碘克沙醇（6 mL）。在4 °C条件下以100,000 × g离心230分钟。
      注意：浮力密度梯度基于碘克沙醇浓度由底部最高浓度（50%）至顶部最低浓度（5%）递减。为制备不同浓度的碘克沙醇溶液，将不同体积的匀浆介质（表1）与工作液（50%碘克沙醇）混合。
    4. 收集15%和25%密度区带，并用无菌DPBS稀释至总体积15 mL。转移至新的小型超速离心管中，在4 °C条件下以100,000 × g离心60分钟。
    5. 弃去上清液，将EV沉淀用50 μL无菌DPBS重悬，用于后续表征。

3. 细胞外囊泡定量

注意：支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡回收率通过两个指标进行定量。

  1. 纳米颗粒追踪分析（NTA）测量
    1. 将EV样本用1 mL DPBS稀释1:200–1:500，加载至胰岛素注射器中。将样本注射器连接至注射泵，并开始测量颗粒数量和大小（参见材料表）。
    2. 所有样本测量的相机水平设为14，检测阈值设为1。每个样本记录5次重复测量，每次30秒采集1500帧，读取间隔为20秒。合并数据并取平均值，用于最终的浓度和粒径报告。
      注意：为准确捕获所有颗粒，应根据需要适当调整相机水平以可视化所有颗粒，并在每次实验的所有样本测量中使用相似的设置。
  2. 蛋白质定量
    注意：采用二辛可宁酸（BCA）蛋白测定法测定来自BALF的EVs的蛋白浓度。
    1. 将EV样本溶解于1x裂解缓冲液中。
    2. 按照BCA标准操作流程，使用酶标仪在560 nm处测定吸光度，通过比色法定量BALF来源EVs中的蛋白质含量。

4. 支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡的检测

注意：使用常见的外泌体表面标志蛋白（TSG101、CD63、CD81 和 CD9）通过 SDS-PAGE 和免疫印迹以及流式细胞术分析来验证细胞外囊泡的回收情况。

  1. SDS-PAGE 和免疫印迹
    1. 在 1.6 mL 离心管中，将各样品等量的 EV 蛋白溶解于上样缓冲液（十二烷基硫酸锂）和 50 mM 二硫苏糖醇（DTT）中。于 70 °C 加热 10 分钟。
    2. 将步骤 4.1.1 的样品上样至 4–12% Bis-Tris Plus 丙烯酰胺凝胶，进行电泳（150 伏，35 mA）35 分钟。
    3. 采用干转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。
    4. 用 5% 脱脂牛奶在室温下摇动封闭膜 60 分钟。
    5. 将膜与针对 EV 表面蛋白标志物肿瘤易感基因 101（TSG101）的一抗在含 5% BSA 的 Tris-缓冲盐水 Tween-20（TBST）中按 1:500 稀释，于 4 °C 摇动孵育过夜。
    6. 次日，用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，随后在室温下与 1:5,000 稀释的 HRP 标记的抗兔 IgG 二抗孵育 60 分钟。
    7. 用 TBST 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。使用化学发光 HRP 抗体检测试剂显影，并成像（参见材料表中的成像系统）。
  2. 流式细胞术
    1. 将支气管肺泡灌洗液（BALF）来源的 EV 溶于 49 μL PEB 染色缓冲液（PBS + 5 mM EDTA + 0.5% BSA，经 0.1 μm 注射器滤膜过滤）中。
    2. 向每个独立样品中分别加入以下抗体：1）大鼠抗小鼠 PE 标记 CD63 抗体（每反应 100 ng）；2）大鼠抗小鼠 PE 标记 CD81 抗体（500 ng）；3）大鼠抗小鼠 FITC 标记 CD9 抗体（200 ng）。于 4 °C 避光摇动孵育 60 分钟。
    3. 用 450 μL 经膜过滤的 PEB 染色缓冲液稀释样品，并进行流式细胞术分析（参见材料表）25。
    4. 按如下方式调整流式细胞仪设置：1）将所有通道设为超对数（hlog）模式；2）将触发阈值设为 SSC 4；3）关闭次级触发。以低速模式运行样品，每个样品至少采集 10,000 个事件。
    5. 使用分析软件对每个样品进行流式细胞术数据分析（参见材料表）。

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结果

我们于同一天采用超滤离心法（UFC）和超速离心密度梯度离心法（UC-DGC）从小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中分离细胞外囊泡（EV）。UFC 方法耗时约 2.5–3 小时，而 UC-DGC 技术需要 8 小时的处理时间。此时间不包括缓冲液和试剂的准备时间。需要注意的是，在长时间离心过程中可同时进行其他实验操作。尽管如此，UC-DGC 分离技术的整个流程几乎持续了一整天。

通过UFC法分离的正常小鼠BALF来源EVs表现出较小的粒径和更均一的粒径分布（148.8 ± 1.1 nM， 图1A）相较于 UC-DGC EVs（176.7 ± 7.8 nM， 图1B）。与UC-DGC分离法相比，UFC技术的总颗粒数显著高出65倍（29.4 ± 18.4 与 0.5 ± 0.1 × 1010 颗粒；

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讨论

在过去的几十年中，科学家们揭示了细胞外囊泡（EVs）在细胞稳态中的重要意义。更重要的是，EVs通过其生物活性货物分子调控邻近及远端细胞，在多种疾病过程中发挥关键作用1,21,22,26,27,28,29,30。该领域的未来发展与进步在很大程度上依赖于可靠且高效的方法，这些方法不仅能够识别并分离出正确的EV亚群，还能保持其生物学功能以用于后续应用10,11,

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院心肺血液研究所（NHLBI/NIH）资助项目 HL103868（授予 P.C.）和 HL137076（授予 P.C.）、美国心脏协会研究资助（授予 P.C.）以及塞缪尔·奥斯钦综合癌症研究所（SOCCI）肺癌研究奖（授予 P.C.）提供支持。 我们衷心感谢 Cedars-Sinai 医疗中心的斯密特心脏研究所为我们提供纳米流式检测仪用于细胞外囊泡（EV）纳米颗粒的追踪分析。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
Amicon Ultra-15 离心滤器 Ultracel-100KSigma-Millipore, St. Louis, MOUFC910024
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
蔗糖Sigma-Millipore, St. Louis, MOEMD8550
HEPESResearch Products International, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
氯化钠Sigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753密度梯度介质
氯胺酮VetOne, Boise, ID13985-702-10
赛拉嗪Akorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
1 mL 注射器BD Syringe, Franklin Lakes, NJ309656
20 G 血管导管BD Syringe, Franklin Lakes, NJ381703
15 mL 离心管VWR, Radnor, PA89039-666
50 mL 离心管Corning Cellgro, Manassas, VA430828
双辛可宁酸（BCA）蛋白测定试剂盒Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
兔抗小鼠 TSG101 抗体AbCam, Cambridge, MAAB125011
大鼠抗小鼠 PE-CD63 抗体Biolegend, San Diego, CA143904
CD81
CD9
抗兔 IgG HRP 标记抗体Cell Signaling Technology, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x 还原剂（Bolt）
10x 裂解缓冲液（Bolt）Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 丙烯酰胺凝胶Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 硝酸纤维素小型转印膜堆Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
化学发光 HRP 抗体检测试剂 HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
17 mL 超速离心管Beckman Coulter, Pasadena, CA337986
38.5 mL 超速离心管Beckman Coulter, Pasadena, CA326823
Corning SFCA 0.2 µm 孔径注射器滤器Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
设备
离心机Eppendorf, Hamburg, Germany-
超速离心机Beckman Coulter, Pasadena, CA-
Nanosight（NS300）Malvern, Worcestershire, UK-用于测量颗粒大小分布和颗粒浓度
MACSQuant Analyzer 10 流式细胞仪Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany-
iBlot 转印装置Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-
Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系统Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10分析软件

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超速离心密度梯度EV 分离颗粒追踪分析流式细胞术蛋白质印迹CD63 CD9 CD81小鼠支气管肺泡灌洗液
使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡
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