该算法旨在通过连续图像膨胀和路径查找，持续测量两个二维边缘之间的距离。该算法可应用于多种领域，如心脏结构生物学、血管生物学和土木工程。
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摘要
摘要
一种最近被描述的细胞外纳米结构域，称为周边隙（perinexus），被认为参与了电紧张耦合，这是一种心肌细胞间电传导的替代机制。目前通过手动分割量化这一空间的方法速度较慢，且空间分辨率较低。我们开发了一种算法，该算法通过对二值化轮廓进行连续图像膨胀，来计算两个相对的二维边缘之间的像素数量。与手动方法相比，该算法所需人工工时更少，空间分辨率更高，同时保留了手动方法的可重复性。事实上，经验丰富的研究人员和新手研究者均能利用该新算法重现先前研究的结果。该算法的局限性在于需要人工手动勾画周边隙轮廓，以及计算能力主要受限于已有的路径搜索算法。然而，该算法具备高通量能力、高空间分辨率和良好的可重复性，使其成为一种多功能且稳健的测量工具，适用于各种需要测量任意二维（2D）边缘间距的应用场景。
引言
以下算法用于测量在称为周边隙（perinexus）的纳米结构域中，两个结构耦联的心肌细胞在缝隙连接斑块边缘分离处的膜间距离。1，这与缝隙连接耦合有关2,3,4,5在之前的一项研究中，通过手动分割方法分析数百张周围突触网的透射电子显微镜（TEM）图像的过程中6，有必要开发一种高通量方法，能够在保持先前手动分割过程准确性的同时，以更高的空间分辨率对周边间隙宽度进行采样。在手动分割过程中，沿中心线每隔约15 nm绘制一条近似垂直的线，以测量周边间隙宽度。新算法采用两条平行线的单像素宽二值化轮廓，通过连续的图像膨胀操作来计算两条膜之间的像素数量。尽管图像膨胀已广泛应用于多种图像处理场景，包括轮廓或边缘检测，7,8该算法使用膨胀作为计数机制，然后利用路径查找算法分离出中心线。9 并且在连接周围区域长度方向上以与图像分辨率相等的精度测量周连接宽度。本例中分辨率的差异表现为：手动分割为每15 nm进行一次测量，而新算法为每0.34 nm进行一次测量，空间采样频率提高了44倍。此外，该更高的采样频率的实现耗时约为手动方法的五分之一th 手动分割所需的时间。
该算法将以当前形式用于测量间隙连接斑块边缘传统范围内0-150 nm的周间隙宽度5（GJ），以及在特定兴趣区域内周间隙稳定于30至105 nm之间的区域2,3,10。相较于手动分割，更高的采样频率降低了单个周间隙测量值的变异性，并显著缩短了分析时间，从而实现对大规模数据集的高效处理。然而，该程序不仅限于心脏闰盘的纳米级透射电镜图像。相同的方法也可用于量化血管直径、心室射血分数，甚至非生物现象，如河流侵蚀或洪水范围。该算法适用于量化任意两条准平行边缘之间的距离。
方案
注意：所需软件包括 ImageJ（或类似图像处理软件）和 Matlab R2015。用户在使用其他版本的 Matlab 时可能会遇到兼容性问题。
1. 图像预处理
- 对于任何灰度图像，确保任意像素的最大强度值 <255。这通常通过在自定义 Matlab 程序 "ImageSub.m" 中将图像减去 1 来实现，该程序包含在补充文件 S1 中。
2. 围产期网络的概述
- 在 ImageJ 或其他图像处理软件中勾勒出周边区（perinexus）的轮廓。
- 确保轮廓线宽度为一个像素，并将其强度值设置为图像中的最高值（在 0 到 255 的灰度图像中为 255）。
- 通过其五层结构（pentalaminar structure）11,12 识别间隙连接（GJ），并将周边区的起始点定义为两个相对的细胞膜双层开始分离的位置，如 图 1A 所示。从 GJ 边缘约 200 nm 处开始，沿第一个细胞的内膜进行描迹，再沿第二个细胞的内膜返回。在 ImageJ 中，松开画笔以自动闭合轮廓，此人为闭合部分将在后续裁剪中去除。
注意：必须尽可能在高倍率下仔细勾勒周边区轮廓，因为即使轮廓的微小偏差也可能导致最终测量结果出现数纳米的误差。
3. 设置算法并选择感兴趣的连接子区域
注意：路径搜索算法要求 AutoGraph、Edge、Graph、Node 和 Pathfinding 函数9 与 MembraneSepDist 的 m 文件位于同一目录中。所有文件均可在补充文件 S1 中找到。
- 选择数据和图像的保存位置。这些位置目前在 m 文件中已硬编码。
注意：程序的第一行是一个用于清除所有变量、关闭所有窗口并清空命令窗口的函数。在运行 m 文件之前，请保存任何需要保留的变量或图像。
注意：所有硬编码值的软件截图均包含在补充文件 S2 中。 - 运行程序 "MembraneSepDist.m"。
- 设置参数。
注意：将弹出一个图形用户界面（GUI），其中包含梯度阈值、尺度、感兴趣区域和手动起始点的默认参数。这些默认值可在 m 文件中修改，也可针对每张单独的图像进行调整。- 设置空间导数梯度阈值。
注意：较高的数值会导致在中心线提取过程中选中更多的点。若数值过高或过低（超出约 3.0–7.9 的范围），可能导致计算效率降低，或中心线点选择不精确，从而影响中心线提取的准确性（见图 2A-C）。 - 以像素/标度单位设置尺度。
- 设置感兴趣区域的空间下限和上限。
注意：根据本实验室的惯例，定义的感兴趣区域位于缝隙连接（GJ）边缘外 30 至 105 nm 范围内2,3,10。 - 设置自动/手动起始模式。在大多数情况下，算法能够准确检测缝隙连接终止、周边区（perinexus）开始的位置。然而，对于形状不规则的周边区，用户需手动指定起始点。将该值设为 0 表示自动，设为 1 表示手动。
- 设置空间导数梯度阈值。
- 选择目标图像。
注意：可在 m 文件中更改文件选择目录。 - 裁剪图像以选定感兴趣的周边区。
- 图像显示后，光标将自动变为十字准线。通过在感兴趣的周边区周围拖拽框选进行裁剪（见图 3）。可通过角点和边上的方块调整裁剪框的大小。
- 裁剪时，确保周边区的"开放"端（距 GJ 最远的一端，见图 3）被裁剪，使两条膜轮廓延伸至裁剪图像的边缘。
注意：建议将图像设为全屏，以便更清晰地观察感兴趣的周边区并进行适当裁剪。
- 通过在待测相对边缘之间双击光标，确认最终裁剪区域。
注意：双击操作必须在周边区内部完成。若程序未能识别出中心线，请重启程序并确保点击位置位于周边区内部。 - 在所有膨胀和腐蚀操作完成后，观察最终生成的中心线，以供用户对程序效果进行最终评估。
注意：程序运行期间，屏幕上将弹出一个对话框，提示用户在程序完成前 MATLAB 无法处理其他命令。处理所需时间取决于数组（图像）大小和计算机处理能力。 - 若启用了手动起始点，将看到中心线图像叠加在原始解剖图像上，并出现十字准线光标（见图 2E）。在靠近目标起始点但位于周边区外部的位置选择一个点。
注意：程序将查找距离所选像素最近的中心线点，并将其作为起始点。 - 记录数据。
注意：程序完成后，将返回一条映射的中心线，以及周边区宽度随距 GJ 边缘距离变化的曲线图。此外，程序将在 MATLAB 命令行输出距 GJ 边缘 150 nm 范围内的平均周边区宽度，以及定义的感兴趣区域内的平均宽度。Wp 值及距 GJ 的距离存储在变量 "WpList" 中，用户也可手动单独记录这些数据。
4. 算法故障排除
- 如果中心线未能正确识别（图2A），请打开图像 "Gmag"，并使用索引确定合适的梯度阈值（图2C）。
- 如果起始点未能正确识别，请手动设置起始点（参见方案3.8）。
结果
统计学方法：采用学生t检验对实验组之间进行比较。以p值<0.05为差异具有显著性，所有数值均以均值±标准差表示。
手动分割。GJ邻近的周间隙纳米结构域宽度（Wp）的量化通常通过手动分割完成。该手动分割过程如图1A所示，并已在先前研究中描述6。观察者首先确定GJ的边缘（图1，红点），然后沿周间隙中心方向移动5 nm，并测量该位置处两膜之间的距离。随后在10、15、30 nm处以及此后每隔15 nm重复此测量，直至150 nm。尽管该技术有效，但在周间隙全长范围内的测量仍存在耗时以及空间采样不足的局限性。
平均值 Wp 先前研究中的测量值可能在约10至20 nm之间变化2,3,10，而3 nm似乎是检测统计学显著性所需的平均差异，远高于基于0.34 nm像素间分辨率的每测量点0.7 nm空间奈奎斯特频率。因此，尽管手动分割耗时较长，该方法仍足以测量W的差异p 与某种干预措施或疾病状态相关。
连续图像扩张法。 为了以更快、可重复的方式并具备适当空间分辨率来测量周边隙（perinexus），我们开发了一种基于连续图像扩张的程序，用于计算两条手动勾画的膜之间相隔的像素数量，如图1B所示。
连续膨胀过程如图4所示。当二值图像被膨胀时（图4A-4D），该膨胀结果被反转后叠加到一幅工作图像上——即原始轮廓的非二值形式（图4E-4H）。此过程重复进行，直至轮廓完全被填充（图4D）。此时，最终的工作图像（图4H）记录了每个特定像素保持未被膨胀的次数。因此，细胞膜轮廓附近的数值非常低，而中心区域的数值最高。通过统计每个位置填充区域所需的膨胀次数，可计算出膜边缘之间的距离。接下来的挑战是识别并分离出中心线，以量化缝隙连接（GJ）距离函数下的周隙宽度，这首先通过对最终工作图像应用空间导数来实现（图2-最后一幅图像，以及图5A）。另一个形状更不规则的周隙示例见补充文件S3。
中线识别。 最终工作图像的梯度可通过空间导数进行量化，因为从边缘到边缘的扩张计数值由高到低再到高变化（图5A 从左至右）。仅考虑空间导数的幅值（图5B），轮廓线与中线（以白色箭头标示）可立即被识别为不连续区域。在这些位置，梯度方向由递增转为递减，或反之。应用阈值（图5C）可得到中线与轮廓线的二值图像，从中减去原始轮廓线即可获得孤立的中线（图5D）。尽管该中线分离方法在计算上较为高效，但对空间导数应用阈值会在所得中线上产生间隙。这些间隙（图5D，插图）必须填补，以准确测量距缝隙连接（GJ）的距离，并确保周边间隙（perinexus）被完整测量。首先，对中线进行膨胀以填充所有间隙（图5E），随后进行腐蚀（图5F），并应用“bwmorph”函数（操作 = 'skel'，n = inf），在保留连续中线的前提下尽可能消除多余点，从而提高后续路径搜索算法的计算效率，该算法由Wasit Limprasert开发，可在MATLAB Central获取9。此膨胀-腐蚀函数生成完整的中线，并与最终工作图像合并（图5G）。然而，该中线通常超过一个像素宽度，因此并非中线的精确分离。
Wasit Limprasert 路径搜索算法用于确定周边隙中心线。该路径搜索算法能够追踪最高值——在此情况下，即为最接近中心且在中心线方向上经过最多次迭代仍保持未扩张的数值（图 5G，插图）。其结果为对中心线的自动追踪，如 图 6 所示。通过分离出中心线，周边隙宽度可表示为距间隙连接（GJ）末端距离的函数，如 图 6B（上图）所示，或表示为特定感兴趣区域的平均宽度。
核分析。需要注意的是，数字化图像基于方形阵列，膨胀核同样基于方形矩阵。这意味着对角线方向的膨胀距离大于正交方向。因此，我们接下来试图确定核的形状是否影响算法的结果。为了量化核特异性变异，分析了五种不同的核形状：“加号”（即上述分析中使用的形状）、“X”、“方框”和“线”，如图7A所示。该核应用于二值图像中每个非零点。图7A中每个核的星号代表中心位置，其中白色表示值为1，黑色表示值为0，用于膨胀核。
每个核对平均 W 的影响p 单个近似水平的周边图像的测量（图7B，由经验丰富的用户通过使用 Matlab 的“imrotate”命令旋转图像并计算 W 确定（顶部）p 逐步 10°. Wp 测量值（图7B，底部）随图像方向呈整流正弦波形式波动 加 呈形的籽粒。当相对较直的周脐线呈垂直或水平方向时，其数值最低。两者均不 X, 盒子，也不 线 与十字形核相比，其他核未显示出任何优势。 X 和 盒子 核函数产生相同结果，但平均W的值p 与 th 相位不同e 加 核由 45°。该 线 核函数在某些角度未能完全膨胀图像，这一点可通过绿色轨迹中旋转角度小于30或大于的图像数据缺失看出 145°因此，正交的 加 膨胀核在对轴线呈对角方向（例如约）的周边隙进行膨胀时，高估了膜分离程度 45°，以及 X 和 盒子 籽粒低估了平均Wp 当闰盘的长轴也处于 45°基于此分析，我们建立了一个校正因子，用于修正使用十字形核进行膨胀运算所得到的数值。为校正因图像方向导致的膜间距高估问题，该校正因子根据图像的取向与测得的宽度值相乘（公式1）。
如果 θ <45°
Wp 校正 = cosd(θ) * Wp 值测量
如果 θ ≥45°
Wp 校正 = cosd(θ) * Wp 值测量 （公式 1）
在该方程中，Wp 测量值为上述算法生成的原始 Wp 值，θ 为相对于水平方向的计算角度（单位为度）。θ 通过取水平方向总变化量与垂直方向总变化量之比的反正切值得到，该比值基于连接体中心线的总变化。上述校正方法近似于连接体的平均角度（相对于水平方向）（图8A，左上），并使测量结果等效于从水平方向的连接体获得的测量值（图8A，左下）。该方程的理论依据在于十字形核（图7A）本质上是由两个正交排列的线形核构成。因此，当角度低于45°（更接近水平方向）时，膨胀操作在垂直方向发生，此时乘以角度的余弦值可得到正确的测量结果；相反，当角度高于45°（更接近垂直方向）时，膨胀操作在水平方向发生，此时使用正弦值来确定正确的测量结果。在恰好45°时，正弦值与余弦值相等。补充文件 S4 展示了这一概念的示意图。需注意，该校正基于平均角度，当分析明显非线性的形状时应谨慎使用。该过程在20个随机选择的连接体上重复进行，校正后的测量值与通过手动旋转并重新分析图像获得的测量值高度相关（图8A，右）。为验证图像方向校正的准确性，生成了两组模拟边缘（图8B，左）并旋转180°。在三角函数校正下，无论空间分辨率或图像尺寸如何，算法在各个方向上均能准确返回正确的数值（图8B，右）。
结合取向校正的分析应用与可重复性。 回顾以往采用手动分割的研究，其报告的 Wp 平均值差异具有统计学意义，且大于或等于 3 nm。因此，有必要确定本算法是否可用于基于完整数据集重现以往的研究结果。使用新算法，两名观察者（其中一名具有心肌周隙分析经验，另一名无此经验，分别记为 Obs. 1 和 Obs. 2）对先前一项研究6中的相同图像进行了分析，该研究共纳入 12 例在组织采集前被诊断为心房颤动（AF）的患者和 29 例无既往 AF 病史的患者（No-AF）。经验丰富的使用者发现，AF 患者的 Wp 显著宽于非 AF 患者（分别为 21.9±2.5 nm 和 18.4±2.0 nm，图 9A）。应用校正因子后的这些数值与先前报道的结果相近（分别为 24.4±2.2 nm 和 20.7±2.4 nm）6。重要的是，无经验的使用者使用自动化程序也发现了疾病状态间的相同显著差异（分别为 22.1±2.8 nm 和 20.1±2.6 nm）。此外，Wp 值的标准差在校正因子应用后未发生变化，表明 2–3 nm 的标准差并非算法所致的假象，而是结构本身及组织处理过程的真实反映。这些结果表明，所提出的自动化方法能够成功重现以往研究的结果。
值得注意的是，周边隙（perinexus）是一种新近定义的结构，目前尚未对间隙连接（GJ）附近膜分离距离的绝对值范围达成共识2,3。由于既往研究估计间隙连接的外膜到外膜宽度约为 20 nm13，因此我们通过测量间隙连接宽度来评估该算法的有效性。两位观察者均发现，有或无房颤病史患者的间隙连接宽度（GJW）之间无显著差异（图9B）。经验丰富的观察者测得房颤患者与非房颤患者的绝对 GJW 值分别为 20.5 ± 2.5 nm 和 20.3 ± 1.9 nm，而经验较少的观察者测得的结果分别为 21.0 ± 3.1 nm 和 20.0 ± 2.2 nm，与既往报道的结果相似。
为了确定自动算法分析数据所需时间是否少于手动分割，经验丰富的用户和无经验用户均记录了量化一个包含10张图像的训练集所需的时间（补充文件S5）。表1显示，与手动分割方法相比，经验丰富的用户和无经验用户使用自动算法分别将分析时间缩短了4.7倍和8.3倍，同时在周 nexus 区域的空间分辨率提高了约43倍。
算法故障排除。运行算法时最常见的错误是最终的中心线未延伸至图像边缘。出现这种情况时，通常是由于从空间导数图中选取的点数不足，导致程序失败，并提示用户错误信息，建议选择更大的裁剪区域或提高空间导数阈值。在某些情况下，绘制更大的裁剪框可提高程序的可靠性，因为空间导数在图像边缘附近变化剧烈，可能干扰路径查找或边缘检测算法。
即使中心线延伸至图像边缘，路径搜索算法仍有可能无法正确识别中心线，尤其是在梯度阈值过低的情况下（图2A）。若梯度阈值设置过高，则会有更多不必要的点被纳入路径搜索算法（图2B），从而降低计算效率。如果用户难以确定合适的阈值，程序生成并存储在工作区中的图像数组“GMag”（图2C）可帮助用户判断阈值。用户可查找沿中心线的点，并将阈值设定略高于这些点的索引值，以确保这些点被选中。在本示例中，合适的阈值应略高于约5.1（图2C，插图）。
起点也可能未能到达周边连接区的起始位置（图2D）。此时，可重新运行程序，并将手动起始值设为1。在中心线被分离后，用户选择一个位于周边连接区外的点，系统将自动设定距离所选像素最近的中心线点（图2E，红色方框）作为起点。最终结果即为完整的中心线（图2F）。
图1： 透射电镜图像及量化过程。手动分割过程（A）要求用户在估算中心线的同时，进行12次独立的膜间距离测量。自动分割过程（B）要求用户手动连续描画周边区域的轮廓。每幅图像中的红点代表用户确定的间隙连接（GJ）末端及周边区域的起始位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：中心线故障排除。 中心线识别失败的两种主要模式及其解决方案：每幅图像均标有 Matlab 中的数组名称。若梯度阈值过低（A，阈值 0.2），中心线算法可能失败；若阈值设置过高（B，阈值 70），则可能降低路径搜索算法的计算效率。合适的梯度阈值可从 GMag 数组中确定（C，插图）。若中心线未能到达周边隙的起始边缘（D），用户可选择手动指定起点。在初始图形用户界面中将“起点”选项设为 1 后，用户需选择一个位于目标周边隙之外的点（E）。最终结果应为一条准确描绘整个周边隙的中心线（F）。所有带引号的标签（A–F）均对应于 Matlab 中的变量名。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：周边隙区域的选择。 为裁剪周边隙区域，请点击并按住鼠标拖动以在其周围绘制一个选框（裁剪工具将自动启用），如蓝色箭头所示。可通过侧面和角上的方块调整该选框的大小，使其扩大或缩小。绿色箭头指示周边隙的末端，用户应确保该区域保持“开放”状态。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：连续图像膨胀过程。 二值轮廓以每次1像素的增量反复进行膨胀（A-D），并在每次膨胀后添加至工作图像（即图像的非二值形式，E-H）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：中心线分离与路径搜索。从最终工作图像（A）计算空间导数，利用该空间导数的幅值（B）来分离轮廓和中心线（白色箭头）。通过用户定义的阈值识别出轮廓和中心线，再减去原始轮廓即可得到中心线（D）。然而，由于阈值处理，中心线上会出现间隙（D - 插图）。为了生成连续的中心线，需对分离出的中心线进行二次膨胀处理（E），然后进行二次腐蚀以提高后续路径搜索算法的计算效率。此腐蚀后的图像（F）再与最终工作图像合并，从而识别出连续且单像素宽的中心线（G - 插图）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：最终数据展示。 该程序在原始透射电子显微镜（TEM）图像上方输出最终轮廓（A）。线条采用颜色编码：0–150 nm 范围为绿色，用户定义的兴趣区域为蓝色，超过 150 nm 的区域为红色。此外，程序还输出一张类似的颜色编码图表，表示 Wp 随距周边隙起始位置距离的变化情况，以及在兴趣区域内的变化（B），并显示平均 Wp 值（各图插图所示）。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：膨胀核形状分析。 膨胀核的形状（A）：中心的星形代表膨胀后的像素。白色框表示受膨胀影响的像素，其形状分别为加号形、X 形、方框形或线形。一条大致水平的闰盘结构（B，上方，红色线表示 0°）以 10° 为步长从 0° 顺时针旋转至 180°，并使用不同形状的核反复进行膨胀处理（B，下方）。加号形和线形核产生相似的结果，尽管线形核在某些取向上失效，而方框形和 X 形核的相位相差 45°。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：图像方向校正。 为校正图像的方向，需根据起始点和终止点的位置（A，左图，黑线的起点和终点）计算周边隙（perinexus）的平均角度。y方向变化量（A，左图，绿色线）与x方向变化量（A，左图，红色线）之比的反正切值即为校正角度θ（A，左图，黄色）。校正的目标是将平均Wp值修正为边缘间的最短距离，相当于周边隙被近似水平成像时的距离（A，左图下方）。将式（1）所述的校正因子应用于图像分析前，与手动将15张随机选取的图像各自旋转计算所得的θ角后进行分析的结果进行了比较。校正后的数值与旋转图像后测得的数值高度相关（R2 = 0.991，A，右图），表明式（1）是有效的图像方向校正因子。为验证该校正因子的适用性，构建了两个具有已知间距且边缘完全平行的模型（B，左图）。模型1和模型2的空间分辨率分别为2.833 像素/mm和71.6 像素/in。如B，右图中蓝色菱形和红色正方形所示，该算法在图像旋转180度范围内均能准确计算其宽度。请点击此处查看本图的放大版本。
图9：算法的可重复性。 使用带有图像方向校正的自动处理流程，经验丰富的观察者和无经验的观察者均在房颤（AF）组与无房颤（No-AF）组之间检测到显著差异（A），结果与先前研究一致，可检测到的最小差异为2.6 nm。此外，两位观察者均未在GJW中发现显著差异（B）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 手动 | 自动 | |
| 时间 - 观测 1 (s) | 205±11 | 44±14 |
| 时间 - 观测 2 (s) | 248±18 | 30±5 |
| 空间分辨率（测量值/nm） | 0.08 | 3.45 |
表1：手动与自动流程的比较。 两位观察者在对包含10张图像的训练集进行轮廓描记时，每张图像所需时间均少于执行手动分割流程所需时间。此外，自动流程具有更高的采样频率，每纳米记录3.45个测量值，而手动流程平均每12.5纳米记录1个测量值。训练集图像见补充文件S5，其中还包括经验丰富的用户所完成的轮廓描记和测量结果。
讨论
该算法通过连续的图像膨胀操作，计算二值图像中两个相对的二维边缘之间的像素数量，此处即为周边间隙（perinexus）的膜间距离2,3,14。随后采用空间导数和路径搜索算法来提取中心线，再通过二次膨胀与腐蚀序列操作填充中心线中的间隙，方法类似于先前的研究15。然后将中心线与最终的膨胀计数图像合并，以表示周边间隙宽度随边缘分离起始位置的距离变化情况，此处即为间隙连接（GJ）末端至周边间隙起始处的距离16。
程序开始时，用户需在图形用户界面中定义四个主要参数：
- 梯度阈值
- 比例尺
- 感兴趣区域范围
- 起始点选择方法（自动或手动）
该算法最常见的失效机制是中心线未能到达图像边缘，而路径搜索算法正是通过这种方式确定终点。为解决此问题，用户可提高步骤3.3.1中所述的梯度阈值，这将使程序从空间导数图像中选取更多的点，从而增加路径搜索算法所需的计算时间。因此，该算法需要在计算速度与中心线完整性之间进行权衡。需要注意的是，只要中心线的所有点均能从空间导数图像中被正确识别，并且起点选择恰当，空间导数阈值将不会影响边缘分离度的测量结果。
图像方向似乎会影响膨胀值，因为核的膨胀以90度为步长进行，如果大部分感兴趣区域与膨胀矩阵的轴成45°角，则可能引入误差。因此，膨胀次数并不总是能准确反映边缘之间的间距。这一局限性已通过三角函数校正因子加以解决，但如果数据集中的所有图像均以相同方向对齐，则该校正可能被忽略。此外，在解释结果时应谨慎，因为切片平面可能并非完全垂直于两层膜。在图9B中，我们使用GJW来表明我们的周 nexus 图像处于平面内。尽管如此，必须确保样本量足够大，以消除图像间切片方向差异带来的影响。此外，我们的周 nexus 宽度测量值不应被解释为反映in vivo状态下的实际空间，但该方法可用于测量相对于某种干预或疾病状态下周 nexus 宽度的平均差异。
当前算法还需要以手动勾画的边缘轮廓作为输入。需要注意的是，只要比例尺设置正确，空间分辨率对算法的测量结果没有影响，这一点在图6中不同分辨率的图像以及补充文件S6中的另一幅低分辨率图像中已得到验证。下一步改进算法的方向是去除轮廓生成过程中的人工干预，并开发一种能够自动选择感兴趣区域的工具。这些功能有望提高测量的精确性并减少用户主观偏差。
该计算效率较高的算法提供了一种更快的量化周 nexus（perinexus）的方法，所需人工时间约为手动分割方法的五分之一，且在可重复性方面未表现出可检测到的下降。此外，手动分割方法每15纳米进行一次测量以量化周 nexus 宽度，而由于周 nexus 的膜间距在15纳米范围内可能发生显著变化，这可能导致采样不足。相比之下，自动化程序的空间分辨率与成像方式相同，在本例中沿周 nexus 长度方向达到每纳米2.9像素，因此能够提供更精细分辨率的周 nexus 宽度平均值。
尽管该算法在心脏结构生物学领域的应用前景广阔且令人振奋，但其用途并不仅限于透射电子显微镜（TEM）图像。任何需要对两条近似平行的二维边缘进行精确、高分辨率测量的领域均可应用此算法。该算法可用于追踪从卫星图像中的河岸侵蚀与洪水模式，到明场或荧光显微镜下的血管发育等多种现象。其中最具前景的潜在应用之一，是在心脏病学领域中利用床旁心脏超声心动图测量左心室射血分数（EF）。目前，标准技术为双平面圆盘法17，尽管一种更新的算法AutoEF现已成为EF定量分析的前沿方法18,19。在双平面圆盘法中，需手动勾画目标心腔轮廓，并采用改良的辛普森法进行量化，系统通过叠加椭圆形圆盘的总和自动计算总体积。该方法的主要局限在于仅能提供目标心腔的总横截面积，无法分辨特定感兴趣区域，且需要大量人工干预和专业经验。较新的AutoEF方法则利用二维散斑算法识别并勾勒心室边缘，进而计算心室横截面积。尽管该过程在测量整体心室面积方面精确高效，但也存在类似的根本性局限，即仅能测量总的横截面积。这一主要缺陷限制了临床医生的诊断与治疗能力。相比之下，本文所介绍的算法能够识别中线，并以成像模态的分辨率精确定位特定感兴趣区域。这一点至关重要，因为市面上已有空间分辨率达微米级的超声扫描仪20,21，这意味着该算法有望以微米而非厘米的分辨率检测局部室壁运动异常。尽管该应用尚需实验验证，但它可能是该算法最直接且最具前景的应用之一。事实上，该算法可轻松结合AutoEF的散斑追踪功能或手动平面测量中使用的手动描记方法，从而在提供传统EF数据的同时，同步获得更高分辨率的信息。
尽管当前算法具有高度的通用性和适用性，但它最初是为二维图像开发的。然而，随着成像技术的不断进步，对三维和四维定量技术的需求日益增长。因此，该算法的下一阶段迭代将把相同的策略——即对二值图像进行连续膨胀——扩展到三维物体，其中自动定义中心线目前仍超出现有成像程序的能力范围。此类算法仅在心脏领域就将具有广泛的临床和实验应用，包括三维心脏超声心动图22,23、三维电子显微镜24,25,26以及三维磁共振成像27,28,29。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢弗吉尼亚-马里兰兽医学院的 Kathy Lowe 对透射电子显微镜样品的处理与染色工作。
资助项目：
美国国立卫生研究院 R01-HL102298
美国国立卫生研究院 F31-HL140873-01
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 触摸屏显示器 | Dell | S2240T | 需要软头触控笔 |
| 台式机 | Dell | Precision T1650 | 8GB 内存 |
| 操作系统 | Microsoft | Windows 7 Enterprise | 64 位操作系统 |
| 程序平台 | Mathworks | Matlab R2015b | 该程序可能与更新或更早版本的 Matlab 不兼容 |
参考文献
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