使用一台荧光显微镜实现多种成像模式

摘要

本文介绍了一种构建集成显微系统的实用指南，该系统以经济高效的方式将传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨率成像以及多色单分子检测（包括单分子荧光共振能量转移成像）整合到一个装置中。

摘要

荧光显微镜是检测生物分子的一种强大工具 原位 并实时监测它们的动态变化和相互作用。除了传统的落射荧光显微镜外，已发展出多种成像技术以实现特定的实验目标。其中一些广泛应用的技术包括单分子荧光共振能量转移（smFRET），该技术可报告埃级分辨率下的构象变化和分子相互作用，以及基于单分子检测的超分辨率（SR）成像，该技术可将空间分辨率提高约十倍 相较于衍射受限显微镜，分辨率可提高至二十倍。本文介绍一种用户定制的集成化系统，该系统将多种成像方法整合于一台显微镜中，包括传统的落射荧光成像、基于单分子检测的超分辨成像，以及多色单分子检测成像（含单分子FRET成像）。通过切换光学元件，可轻松且可重复地实现不同成像模式。该装置易于被生物科学领域的各类研究实验室采用，尤其适用于需要常规开展多样化成像实验的单位，在成本和空间占用方面显著优于分别为特定用途搭建独立显微镜的方案。

引言

荧光显微镜是现代生命科学研究的重要工具，许多生物学实验室 routinely 进行荧光成像。通过将目标生物分子与荧光染料标记结合，我们可以在显微镜下直接观察它们，并记录其在活体（in vivo）或体外（in vitro）条件下随时间变化的定位、构象、相互作用及组装状态。^1,2 传统的荧光显微镜受限于衍射极限，其空间分辨率在横向约为 200 - 300 nm，轴向约为 500 - 700 nm，因此仅适用于百纳米至微米尺度的成像。为了揭示分子组装或组织结构中的更精细细节，目前已开发出多种能够突破衍射极限的超分辨率（SR）显微技术。实现超分辨率的策略包括利用非线性光学效应，如受激发射损耗（STED）显微术^3,4 和结构光照明显微术（SIM）^5,6,7；基于单分子随机检测的方法，如随机光学重建显微术（STORM）⁸ 和光激活定位显微术（PALM）⁹；以及上述两类方法的结合，例如 MINFLU....

方案

1. 显微镜的设计与组装

1. 激发路径
   注意：激发光路包括激光器、微分干涉差（DIC）组件、显微镜主体及其照明臂。
   1. 准备一个隔振光学平台。例如，一个尺寸为 48 x 96 x 12 英寸的结构阻尼平台可为所有组件提供足够的空间。
      注意：在具有温度控制的房间内搭建装置（例如，21.4 ± 0.55 °C）。温度稳定性对维持光学对准至关重要。
   2. 安装配备有用于光纤连接的照明臂、100倍油浸TIRF物镜和微分干涉差（DIC）组件的显微镜主体。
   3. 放置四个激光头（647 nm、561 nm、488 nm 和 405 nm，用圆圈标出） 图1B）及其散热器固定在光学平台上，并确保发射的激光束高度相同且尽可能短，以保证良好的稳定性（例如, 3’’).
      注意：如果某个激光头的高度低于其他激光器，则应在下方放置一块足够厚度的铝板。务必确保散热器与光学平台之间最大程度接触，以实现最佳散热效果。图1B）。激光器的功率必须足够用于超分辨率成像。参见 材料表建议在二极管激光器前安装激光清理滤光片。
   4. 通过外设组件互连（PCI）接口在工作站中安装数据采集卡，并将激光器与此卡连接。通过该卡的....

结果

该显微镜可灵活且可重复地在不同成像方法之间切换。此处展示了使用每种成像模块采集的样本图像。

图 5D 展示了在超分辨成像过程中闪烁开启分子的点扩散函数（PSF）。通过重建数千张此类图像，生成最终的超分辨图像（图5E). 图 5E 显示了与上图荧光显微图像中相同的细菌调控RNA 图7A. 图7 显示一个小的调控性RNA的代表性落射荧光图像 大肠杆菌 细胞和U2OS哺乳动物细胞中的mRNA。两种RNA均通过荧光标记的DNA寡核苷酸进行标记 原位 杂交¹⁷.

讨论

这种混合显微镜系统消除了购买多台显微镜的需求。所有部件的总成本，包括光学平台、平台安装人工、软件和工作站，约为23万美元。定制加工部件（包括磁透镜和三维透镜）的成本约为700美元（具体费用取决于不同机构的实际收费标准）。目前市面上常见的基于单分子检测的超分辨显微成像集成系统价格通常超过30万至40万美元，且在没有白光光源的情况下，难以实现单分子荧光共振能量转移（smFRET）测量，或在合理视场范围内进行落射照明成像。因此，本文所介绍的方法能够以显著降低的成本实现相当于多台显微镜的成像功能。

该调制显微镜系统可基于不同制造商的显微镜主体构建。3-D透镜可安装在发射光路中的任意位置，包括发射分光器内部、显微镜主体内部，或滤光轮与物镜转盘之间的可用空间。然而，3-D透镜的物理位置将决定其实现最佳像散效应以进行3-D超分辨（SR）成像所需的焦距。我们建议初始选择10米的焦距。放大透镜（mag lens）本质上是安装在激发光路中的一个扩束系统。如果激发激光器为自由空间耦合（i.e., 未使用光纤），则在激光束准直后的任意位置安装此类扩束系统都非常简便。如果激发激光器为光纤耦.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
尼康 Ti-E 显微镜支架	尼康	Ti-E
物镜	尼康	100X NA 1.49 CFI HP TIRF
显微成像软件	尼康	NIS-Elements 高级研究/HC	HC 包括 "职位招聘" 模块，该程序化采集模块用于SR成像。
照明臂	尼康	Ti-TIRF-EM 电动照明单元 M	该臂上设有用于放大镜片的插槽
分析模块	尼康	Ti-A	这被安装在滤光片转轮中。
Z轴漂移校正系统	尼康	无进展生存期	该系统由物镜转换器上的步进电机、红外发光二极管（IR LED）和探测器组成。
光学平台桌面	TMC	783-655-02R
光学平台底座	TMC	14-426-35
647 nm 激光器	Cobolt	90346 (0647-06-01-0120-100)	647 nm 120 mW 调制激光二极管，包含激光头、CDRH 控制盒、USB 线缆和 PSU（电源单元）
561 nm 激光器	相干的	1280721	OBIS 561 nm LS 150 mW 激光系统
488 nm 激光器	Cobolt	90308 (0488-06-01-0060-100)	488 nm 60 mW 调制激光二极管，包含激光头、CDRH 控制盒、USB 线缆和电源装置（PSU）
405 nm 激光器	Crystalaser	DL405-025-O	405（±5）nm，25 mW，圆形，M2 <1.3，低噪声，连续波，TTL 信号频率高达 20 MHz。配备 2 个用于 TTL 的 BNC 接口 &和模拟调节
散热器	Cobolt	11658 (HS-03)	两个部件：无风扇散热片 HS-03，适用于 647 nm 和 488 nm 激光器的散热片
散热器	相干的	1193289	Obis 带风扇散热片，165 x 50 x 50 mm，用于 561 nm 激光器
CAB-USB-miniUSB	Cobolt	10908	两套单元，用于647 nm和488 nm激光器的通信电缆
用于高度调节的铝制部件	McMaster-Carr	9146T35	多功能6061铝合金矩形棒，4毫米 × 40毫米，1英尺长，用于抬升561纳米激光器
用于高度调节的铝制部件	McMaster-Carr	8975K248	多功能6061铝合金，1-1/4" 厚 X 3" 宽度 × 1 英尺长度，用于提升 405 nm 激光
BNC 电缆	L-com	CC58C-6	RG58C 同轴电缆，BNC 公头/公头，6.0 英尺
BNC 适配器	L-com	BA1087	同轴适配器，BNC穿墙式，接地型
SMA转BNC适配器	HOD	SMA-870	Cobolt MLD 激光器具有 SMA 接口，因此该适配器用于 BNC 连接。
SMB 转 BNC 适配器	费尔维微波	FMC1638316-12	SMB 插头转 BNC 母头面板安装电缆 RG316 同轴线，12 英寸，适用于 Coherent Obis 激光器
数据采集卡	国家仪器公司	PCI-6723	13位、32通道、800 kS/s模拟输出设备，用于控制激光器、微分干涉差（DIC）LED等
屏障滤光轮控制器	Sutter Instrument	Lambda 10-B	光学滤光片转换器
发射光分离器	凯恩	OptoSplit III
二向色分光镜	色度	T640LPXR-UF2	OptoSplit III 中用于分离红色发射光与绿色发射光的二向色分光镜
二向色分光镜	Chroma	T565LPXR-UF2	分色镜分离绿色 &以及在OptoSplit III中将蓝色发射与红色发射分离
发射滤光片	染色	ET700/75M	两个单元，OptoSplit III 和 Barrier 滤光轮中的红色发射光滤光片（如 Alexa Fluor 647）
发射滤光片	染色	ET595/50M	OptoSplit III 和滤光片转轮中的黄色/绿色发射光滤光片（如 Cy3B）两个单元
发射滤光片	染色	ET525/50M	两个单元，OptoSplit III 和 Barrier 滤光轮中的蓝色发射滤光片（适用于 Alexa Fluor 488/GFP 等）
发射滤光片	Semrock	FF02-447/60-25	用于紫色发射光（如 DAPI/Alexa Fluor 405）的发射滤光片，安装在阻挡滤光轮中
二向色分光镜	Chroma	zt405/488/561/647/752rpc-UF3	显微镜机身内用于647、561、488和405 nm激光激发的多波段二向色分光镜
DAPI滤光片组	染色	49000	安装在显微镜主体中
尼康激光/TIRF滤光立方体	色度	91032
590 长通滤光片	Chroma	T590LPXR-UF1	用于结合647 nm激光与561 nm激光
525 长通滤光片	染色	T525LPXR-UF1	用于将已合并的647 nm和561 nm激光与488 nm激光进行组合
470 长通滤光片	色度	T470LPXR-UF1	用于将已合并的647 nm、561 nm和488 nm激光与405 nm激光进行组合
激光清理滤光片（647）	色度	zet640/20x	用于清除647 nm激光的其他波长
激光清理滤光片（488）	Semrock	LL01-488-25	用于清除488 nm激光中的其他波长
LED光源	Excelitas	X-Cite120LED	仅用于 DAPI 成像
镜架	纽波特	SU100-F3K
光学柱	纽波特	PS-2
夹叉	纽波特	PS-F
功率计	纽波特	PMKIT	用于测量激光功率
二向色性光束合束器支架	Edmund Optics	58-872	C型接口运动学安装座，用于在激光激发组件中固定二向色分光镜合束器
卡环	Thorlabs	CMRR	用于二向色性光束合束器安装座
光纤适配器板	Thorlabs	SM1FC	FC/PC光纤适配器板，带外置SM1（1.035）"-40) 穿线
Z轴平移调节架	Thorlabs	SM1Z	Z轴平移安装座，兼容30 mm笼式系统
消色差双合透镜	Thorlabs	AC050-008-A-ML	Ø5 毫米，安装式消色差双合透镜，AR 镀膜：400 - 700 纳米
笼板	Thorlabs	CP1TM09	带M9×0.5内螺纹和8-32丝锥的30 mm笼板
笼具组装杆	Thorlabs	ER4	笼具组装杆，4" 长， Ø6 mm
笼具安装支架	Thorlabs	CP02B	30 mm笼式系统安装支架
单模光纤	Thorlabs	P5-405BPM-FC-2	补光光纤，PM，FC/PC转FC/APC，405 nm，熊猫型，2 m
多模光纤	Thorlabs	M42L01	Ø50 µm，0.22 数值孔径，FC/PC-FC/PC 光纤跳线，1 m
消色差双合透镜（放大透镜）	Thorlabs	ACN127-025-A	ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" 消色差双合透镜，抗反射涂层：400-700 nm，含凹透镜 "磁透镜"
消色差双合透镜（放大透镜）	Thorlabs	AC127-050-A	f=50.0 mm Ø1/2" 消色差双合透镜，抗反射涂层：400-700 nm，凸透镜 "磁透镜"
卡环	Thorlabs	SM05PRR	SM05 塑料卡环用于 Ø1/2" 透镜管和透镜支架，用于 "磁透镜"
尼龙尖螺丝	Thorlabs	SS3MN6	M3 × 0.5 尼龙尖端紧定螺钉，6 mm 长，用于固定 "3D 透镜"
3D 透镜	CVI Laser Optics	RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700	f=10 m，矩形柱面透镜
EMCCD相机	Andor	iXon Ultra 888
100 nm 多通道微球	Thermo	T7279，TetraSpeck 微球
红色染料	赛默飞世尔科技	Alexa Fluor 647
黄绿色染料	GE Healthcare	Cy3
绿色染料	GE Healthcare	Cy3B
蓝色染料	赛默飞世尔科技	Alexa Fluor 488