通过非放射性L-叠氮高丝氨酸标记法分离原代小鼠肝细胞用于新生蛋白质合成分析

摘要

本文介绍了一种分离健康且具有功能的小鼠原代肝细胞的实验方案。同时提供了利用非放射性标记底物检测肝脏新生蛋白质合成的方法，以帮助理解肝脏在能量代谢稳态背景下蛋白质合成的相关机制。

摘要

肝细胞是肝脏的实质细胞，参与多种代谢功能，包括合成和分泌对全身能量稳态至关重要的蛋白质。从小鼠肝脏分离得到的原代肝细胞是一种有价值的生物学工具，可用于理解肝脏中发生的生理特性或功能改变。本文描述了一种通过两步胶原酶灌注法分离和培养原代小鼠肝细胞的方法，并探讨其在蛋白质代谢研究中的应用。成年小鼠肝脏依次用乙二醇双四乙酸（EGTA）和胶原酶进行灌注，随后利用密度梯度缓冲液分离肝细胞。所获得的肝细胞在培养板上具有良好的存活率，并保留了肝细胞的大部分固有特性。这些肝细胞可用于评估蛋白质代谢，包括使用非放射性试剂检测新生蛋白质的合成。我们证明，通过四甲基罗丹明（TAMRA）蛋白检测法结合化学选择性连接反应以及蛋白质印迹分析，所分离的肝细胞易于操控，并在与能量代谢相关的蛋白质合成方面表现出更高的质量和体积稳定性。因此，该方法对于研究与能量稳态相关的肝脏新生蛋白质合成具有重要价值。以下实验方案详细说明了高质量原代小鼠肝细胞的分离步骤及新生蛋白质合成的检测方法。

引言

蛋白质是一种重要的营养成分，人体干重的大约50%由蛋白质构成，这些蛋白质具有多种生物学特性和功能¹因此，蛋白质合成是最消耗能量的过程之一，蛋白质代谢的改变与多种疾病的发生密切相关，包括代谢性疾病。^2,3,4在肝脏中，蛋白质生物合成约占总能量消耗的20–30%^5,6此外，蛋白质不仅作为肝脏的被动结构组分或构建模块，还在细胞内或细胞外作为活性信号介导因子，参与调节全身代谢⁷例如，血清白蛋白水平降低，该蛋白由肝脏合成并分泌，是血浆中最丰富的蛋白质⁸，增加2型糖尿病的发病风险^9,10,11而血清白蛋白浓度较高则对代谢综合征的发生具有保护作用¹²此外，参与调节胆固醇稳态的分泌性或膜结合性肝蛋白（包括脂蛋白、LDLR 和 LRP1）若发生功能障碍或表达异常，可导致胰岛素....

方案

本方案涉及实验小鼠的使用。动物护理和实验操作均按照辛辛那提儿童医院医疗中心动物护理委员会批准的程序进行。

1. 小鼠原代肝细胞的分离

1. 分离前准备
   1. 按照表1所述配制450 mL 40%密度梯度缓冲液，并置于4 °C保存（每只小鼠15 mL）。
   2. 按照表1所述配制500 mL Williams’ 培养基，并置于4 °C保存。
   3. 按照表1所述配制500 mL DMEM，并置于冰上保存（每只小鼠30 mL）。
   4. 按照表1所述配制500 mL HBSS (-) 缓冲液，并置于42 °C水浴中预热（每只小鼠40 mL）。
   5. 按照表1所述配制500 mL含0.3 mg/mL X型胶原酶的HBSS (+) 缓冲液，于42 °C水浴中孵育30分钟（每只小鼠40 mL）。
   6. 将静脉（I.V）输液管穿过脚踏开关并固定，启动灌注泵，检查灌流液流动情况，确保无气泡。
   7. 将管路加热器预热至42 °C。
   8. 将离心机预冷至4 °C。
2. 麻醉与灌注
   1. 清洁工作区域及灌注....

结果

小鼠原代肝细胞分离可获得约 20 × 10⁶ 个总细胞/只小鼠。经 24 小时培养后，活的且已贴壁的原代肝细胞在组织学上呈多边形或典型的六边形，细胞膜边界清晰（图 2）。

为了确认分离的细胞是否为原代肝细胞，我们比较了分离的原代小鼠肝细胞（PMHs）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、小鼠肝癌细胞系（Hepa 1-6）以及小鼠肝脏中白蛋白蛋白的表达水平。白蛋白蛋白的表达仅在原代小鼠肝细胞和小鼠肝脏中被检测到，而在MEFs或Hepa 1-6细胞中均未检测到（图3）。

为了确定鱼藤酮对肝脏AMP激活的蛋白激酶（AMPK）活化的影响是否为细胞自主性，我们比较了从野生型小鼠肝脏分离的原代肝细胞的时间依赖.......

讨论

尽管已有多种永生化肝细胞系被提出并用于研究肝脏功能^49,50,51,52，但这些细胞通常缺乏正常肝细胞的重要基本功能，例如白蛋白的表达（图3）。因此，尽管原代肝细胞的培养与维持存在挑战，学界普遍认为使用原代肝细胞是在体外研究肝脏生理学和代谢功能的有价值选择。本研究详细描述了一种相对简便且高效的两步胶原酶法，成功分离出原代小鼠肝细胞。通过该方法，培养中获得的大多数原代肝细胞仍保持其代谢功能和形态稳定性，可用于研究肝脏功能，包括蛋白质代谢、糖异生以及线粒体呼吸作用。

分离的原代肝细胞是研究肝脏能量代谢分子机制的有力实验工具。鱼藤酮通过干扰线粒体中电子传递链复合物I的活性，阻断氧化磷酸化过程，导致ATP合成受限⁵³，这一点可通过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES缓冲液	Fisher Scientific	BP310-500
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-500
乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸	AmericanBio	AB00505-00025
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩）	Gibco	15240-062
无钙、无镁、无酚红的HBSS（10倍浓缩）	Gibco	14185-052
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）	Fisher Scientific	C79-500
密度梯度缓冲液	GE Healthcare	17-0891-02
DMEM（杜氏改良伊格尔培养基），低糖，含丙酮酸	Gibco	11885-084
胎牛血清	Hyclone	SH30910.03
磷酸盐缓冲液（PBS）（1倍浓度）	Gibco	1897141
不含谷氨酰胺的Williams E培养基	Gibco	12551-032
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽补充剂	Gibco	35050-061
X型胶原酶	Wako Pure Chemical Industries	039-17864
灌注泵	Cole-Parmer	Masterflex L/S	Equipment
静脉输液装置	EXELINT	29081	Equipment
水浴锅	REVSCI	RS-PB-200	Equipment
管式加热器	Fisher Scientific	Isotemp	Equipment
乙醇	Decon Lab, Inc	0-39613
异氟烷	PHOENIX	10250
经高压灭菌的棉签	Fisherbrand	23-400-124
100 mm培养皿	TPP	93100
连接器（雄性鲁尔锁环）	Cole-Parmer instrument	EW-4551807
24 G导管	TERUMO	Surflo 24Gx3/4'
100 μm滤膜（细胞筛）	VWR	10199-658
15 mL锥底离心管	VWR	89039-666
50 mL锥底离心管	VWR	89039-658
化学选择性连接反应蛋白分析检测试剂盒，TAMRA炔	Invitrogen	C33370
AHA（L-叠氮高丙氨酸）	Invitrogen	C10102
无甲硫氨酸DMEM	Gibco	21013024
二盐酸-L-胱氨酸	SIGMA	C2526
Laemmli样品缓冲液	BioRad	161-0737
蛋白酶抑制剂混合物	SIGMA	P9599
SDS溶液（20%）	BioRad	161-0418
Tris-HCl（1 M）	American Bioanalytical	AB14044-01000
磷酸酶抑制剂混合物	SIGMA	P5726
蛋白质浓度测定试剂盒（牛血清白蛋白-BSA）	BioRad	500-0207
6孔组织培养板	TPP	92006
数字加热块	VWR	12621-092	Equipment
多用途旋转混合仪	Grant-bio	PTR-60	Equipment
超声波破碎仪	Cole-Parmer	GE130PB	Equipment
标准重型涡旋混合器	VWR	97043-566	Equipment
多模式激光扫描仪	GE Healthcare Life Science	FLA 9500	Equipment
考马斯亮蓝染色试剂	Thermo Scientific	24594
倒置显微镜	Olympus	CKX53	Equipment
蛋白质印迹装置	BioRad	1658004	Equipment
离心机	Eppendorf	5424R	Equipment
自动细胞计数仪	BioRad	TC20	Equipment
FluorChem R系统	proteinsimple	-	Equipment
p-AMPKα（T172）抗体	Cell signaling	2535
总AMPK抗体	Cell signaling	5832
白蛋白抗体	Cell signaling	4929
β-肌动蛋白抗体	Santa Cruz	sc-130656
精细剪刀和镊子