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方法文章

通过非放射性L-叠氮高丝氨酸标记法分离原代小鼠肝细胞用于新生蛋白质合成分析

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DOI：

10.3791/58323

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2018年10月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine, University of Cincinnati, 2Division of Endocrinology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 4Department of Pediatrics, College of Medicine, University of Cincinnati

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种分离健康且具有功能的小鼠原代肝细胞的实验方案。同时提供了利用非放射性标记底物检测肝脏新生蛋白质合成的方法，以帮助理解肝脏在能量代谢稳态背景下蛋白质合成的相关机制。

摘要

肝细胞是肝脏的实质细胞，参与多种代谢功能，包括合成和分泌对全身能量稳态至关重要的蛋白质。从小鼠肝脏分离得到的原代肝细胞是一种有价值的生物学工具，可用于理解肝脏中发生的生理特性或功能改变。本文描述了一种通过两步胶原酶灌注法分离和培养原代小鼠肝细胞的方法，并探讨其在蛋白质代谢研究中的应用。成年小鼠肝脏依次用乙二醇双四乙酸（EGTA）和胶原酶进行灌注，随后利用密度梯度缓冲液分离肝细胞。所获得的肝细胞在培养板上具有良好的存活率，并保留了肝细胞的大部分固有特性。这些肝细胞可用于评估蛋白质代谢，包括使用非放射性试剂检测新生蛋白质的合成。我们证明，通过四甲基罗丹明（TAMRA）蛋白检测法结合化学选择性连接反应以及蛋白质印迹分析，所分离的肝细胞易于操控，并在与能量代谢相关的蛋白质合成方面表现出更高的质量和体积稳定性。因此，该方法对于研究与能量稳态相关的肝脏新生蛋白质合成具有重要价值。以下实验方案详细说明了高质量原代小鼠肝细胞的分离步骤及新生蛋白质合成的检测方法。

引言

蛋白质是一种重要的营养成分，人体干重的大约50%由蛋白质构成，这些蛋白质具有多种生物学特性和功能1因此，蛋白质合成是最消耗能量的过程之一，蛋白质代谢的改变与多种疾病的发生密切相关，包括代谢性疾病。2,3,4在肝脏中，蛋白质生物合成约占总能量消耗的20–30%5,6此外，蛋白质不仅作为肝脏的被动结构组分或构建模块，还在细胞内或细胞外作为活性信号介导因子，参与调节全身代谢7例如，血清白蛋白水平降低，该蛋白由肝脏合成并分泌，是血浆中最丰富的蛋白质8，增加2型糖尿病的发病风险9,10,11而血清白蛋白浓度较高则对代谢综合征的发生具有保护作用12此外，参与调节胆固醇稳态的分泌性或膜结合性肝蛋白（包括脂蛋白、LDLR 和 LRP1）若发生功能障碍或表达异常，可导致胰岛素抵抗、高脂血症或动脉粥样硬化的发生。13因此，鉴定参与肝脏蛋白质代谢紊乱及其相关代谢并发症的分子病理生理机制，可能有助于发现延缓发病或治疗胰岛素抵抗、糖尿病和非酒精性脂肪肝等代谢性疾病的新型药理学方法。

蛋白质合成与细胞能量状态紧密相关（例如在蛋白质合成的延伸步骤中，每形成一个肽键需要消耗4个磷酸二酯键14并由感知细胞内外营养物质可利用性的分子通路进行调控15,16AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是维持细胞内能量稳态的能量感受器之一17当细胞能量水平降低时，AMPK 被激活，进而通过其靶向底物促进分解代谢途径，并抑制包括蛋白质合成在内的合成代谢过程。18,19蛋白质合成的调控由多种翻译因子和核糖体蛋白的磷酸化介导。20值得注意的是，哺乳动物雷帕霉素靶复合物1（mTORC1）是蛋白质合成的主要驱动因子之一，也是AMPK的主要靶点之一。21mTORC1通路的激活通过促进蛋白质翻译和自噬，增强细胞生长与增殖20,21因此，AMPK的激活能够抑制mTORC1介导的蛋白质合成是合乎逻辑的22确实，AMPK 的激活可拮抗并直接在苏氨酸残基 2446（Thr2446导致其失活23 以及蛋白质生物合成的抑制24此外，AMPK可通过磷酸化并激活结节性硬化复合物2（TSC2）来间接抑制mTORC1的功能25 即mTORC1信号级联的上游调控因子。简言之，这些通路在肝脏中的失调常与代谢性疾病的发生相关，因此迫切需要建立有效的实验工具，以研究这些通路在肝细胞能量和蛋白质代谢调控中的作用。

分离的原代肝细胞的功能特性之间具有更强的相似性 体内 肝细胞比与 体外 肝源性细胞系26,27,28已发现，原代人肝细胞与肝活检组织在基因表达谱方面具有77%的相似性，而HepG2细胞作为分化良好的肝癌细胞系，虽被广泛用于肝功能研究，其基因表达谱与肝活检组织的相似性却低于48%。29因此，在研究肝脏功能和生理学时，使用原代肝细胞而非永生化培养细胞至关重要，目前已有多种可用于分离和培养原代肝细胞（尤其是大鼠来源）的实验方案。30,31尽管大鼠肝细胞具有相对较高的细胞收获量，但由于基因修饰小鼠资源丰富，小鼠肝细胞在许多科学研究方面具有更大的应用潜力。然而，从小鼠中分离出健康且数量充足的原代肝细胞用于细胞和分子水平的评估仍存在若干技术挑战：首先，由于小鼠门静脉或下腔静脉细小且壁薄，插管灌注缓冲液的操作极为困难；其次，细胞分离过程中的操作时间延长会导致细胞数量和质量下降；第三，非酶法的机械分离方法可能造成严重损伤，导致可存活的原代肝细胞得率较低32,3320世纪80年代，胶原酶灌注技术被引入用于从动物肝脏中分离肝细胞34该方法基于肝脏的胶原酶灌注35,36,37，用钙螯合剂溶液灌注肝脏38,39酶消化与肝实质的机械解离35第一步，用钙离子 [Ca2+] 含有 [Ca 的无缓冲液2+]螯合剂（乙二胺四乙酸，EDTA）。第二步中，用含有胶原酶的缓冲液灌注小鼠肝脏，以水解细胞与细胞外基质之间的相互作用。与第一步所用缓冲液不同，该缓冲液中含有[Ca2+第二步缓冲液中的 ] 离子对于胶原酶的有效活性至关重要，随后需使用镊子在肝包膜与实质组织之间轻柔地进行机械分离以进一步消化肝脏。最后，通过过滤去除结缔组织，再经离心结合密度梯度缓冲液将活肝细胞与非实质细胞及死肝细胞分离开来。40,41,42在本研究中，我们展示了一种改良的两步胶原酶灌注法，用于从小鼠肝脏中分离原代肝细胞，以分析蛋白质合成。

蛋白质的放射性标记被广泛用于定量蛋白质的表达水平、周转速率，并确定其生物学分布43，这得益于放射性检测的高度灵敏性44。然而，放射性同位素的使用需要高度受控的研究环境和操作流程45。目前已开发出多种非放射性替代方法，并日益受到青睐。其中一种方法是基于四甲基罗丹明（TAMRA）蛋白检测法的化学选择性连接反应46，该反应利用叠氮基团与炔基之间的化学选择性反应，可用于分析细胞事件，例如检测新生蛋白质的合成以及经叠氮基团修饰的糖蛋白亚类。在新生蛋白合成研究中，可将叠氮修饰的氨基酸L-叠氮高丝氨酸（L-AHA）通过代谢方式掺入蛋白质，并利用TAMRA蛋白检测法进行检测47。通过在原代小鼠肝细胞中应用该检测方法，我们发现新生蛋白的合成速率与线粒体产生的ATP水平及AMPK的激活状态密切相关（图1）。

总之，利用原代小鼠肝细胞对于研究蛋白质和能量代谢至关重要，而定量新生蛋白质的合成有助于深入理解与肝细胞相关疾病的发生及治疗相关的信号通路的生理作用。

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方案

本方案涉及实验小鼠的使用。动物护理和实验操作均按照辛辛那提儿童医院医疗中心动物护理委员会批准的程序进行。

1. 小鼠原代肝细胞的分离

  1. 分离前准备
    1. 按照表1所述配制450 mL 40%密度梯度缓冲液，并置于4 °C保存（每只小鼠15 mL）。
    2. 按照表1所述配制500 mL Williams’ 培养基，并置于4 °C保存。
    3. 按照表1所述配制500 mL DMEM，并置于冰上保存（每只小鼠30 mL）。
    4. 按照表1所述配制500 mL HBSS (-) 缓冲液，并置于42 °C水浴中预热（每只小鼠40 mL）。
    5. 按照表1所述配制500 mL含0.3 mg/mL X型胶原酶的HBSS (+) 缓冲液，于42 °C水浴中孵育30分钟（每只小鼠40 mL）。
    6. 将静脉（I.V）输液管穿过脚踏开关并固定，启动灌注泵，检查灌流液流动情况，确保无气泡。
    7. 将管路加热器预热至42 °C。
    8. 将离心机预冷至4 °C。
  2. 麻醉与灌注
    1. 清洁工作区域及灌注泵。
    2. 用70%乙醇彻底冲洗与泵连接的输液管10分钟。
    3. 用去离子水（DDW）彻底冲洗与泵连接的输液管10分钟，以去除残留乙醇。
    4. 用70%乙醇擦拭剪刀和镊子。
    5. 将小鼠放入底部带网格的塑料容器中，网格下方放置浸有2 mL异氟烷的纱布，避免直接接触。
    6. 通过足底反射（用力捏脚趾）评估麻醉深度。
    7. 当小鼠达到所需麻醉深度时，将其取出。
      注意：麻醉诱导时间不应超过1分钟。
    8. 使用15 mL离心管制作鼻腔麻醉装置，将浸有1 mL异氟烷的棉垫推至管底。
    9. 通过移动鼻腔麻醉装置靠近或远离小鼠鼻孔，控制麻醉深度。
    10. 将小鼠仰卧置于操作平台。
    11. 用70%乙醇喷洒小鼠腹部区域，然后使用锐利剪刀和齿镊在皮肤和腹膜上做一较大的横向切口。
    12. 接着，使用锐利剪刀和齿镊纵向切开腹壁各层，直至完全暴露腹腔器官。
    13. 用已灭菌的棉签将小肠和大肠推向小鼠左侧，使肝脏、门静脉和下腔静脉（IVC）清晰暴露。
    14. 小心地将24 G导管插入下腔静脉（IVC）分叉处（与右肾静脉交汇处），操作时避免手抖，以防损伤IVC并引起出血。
      注意：若插入导管时发生出血，应尝试将新导管插入门静脉。
    15. 拔出导管针芯，固定套管位置以防其滑出IVC，然后使用连接器将24 G套管与灌注管连接。
      注意：开始灌注前应避免存在气泡。
    16. 以4 mL/min的流速开始用温热的HBSS (-) 灌注肝脏，并迅速用剪刀剪断脾静脉以排出体内血液。
      注意：若插管成功，缓冲液将从IVC逆流至肝静脉，肝脏开始变苍白。门静脉由脾静脉和肠系膜上静脉汇合而成，因此剪断脾静脉是安全的，因其管径较粗且远离肝脏。
    17. 继续用35 mL温热的HBSS (-) 进行灌注。
      注意：若灌注充分，肝脏颜色将变浅；此时小鼠在麻醉状态下仍存活。
  3. 消化与提取
    1. 以4 mL/min的流速，用含X型胶原酶的35 mL温热HBSS (+) 灌注小鼠肝脏。
    2. 每隔几分钟，用镊子夹闭脾静脉约10秒，使HBSS (+) 充分扩散至肝脏各解剖区域。
      注意：夹闭脾静脉后，由于缓冲液积聚，肝脏开始肿胀。
    3. 灌注结束后，将5 mL预热的含X型胶原酶的HBSS (+) 倒入100 mm培养皿中。
    4. 在停止泵前剪下灌注后的肝脏，以防血液倒流；用镊子去除胆囊，再用纸巾轻轻擦拭肝脏以去除血液。
    5. 将肝脏转移至含5 mL预热HBSS (+) 的培养皿中，用直头镊子小心去除肝包膜。
      注意：肝包膜是包裹肝脏的一层薄的结缔组织。
    6. 用镊子小心分散肝实质组织。向培养皿中加入15 mL冷DMEM。
      注意：若肝脏消化良好，培养基将因肝实质细胞释放而变浑浊。
    7. 轻轻摇动撕碎的肝脏，使残留的实质细胞释放到培养基中，并再向培养皿中加入15 mL冷DMEM以收集剩余细胞。
    8. 将含有溶解肝脏的DMEM通过100 μm细胞滤网过滤至50 mL离心管中，并置于冰上保存。
  4. 纯化
    1. 将细胞悬液在4 °C下以60 x g离心2分钟，小心吸除上清液，用10 mL DMEM重悬沉淀。
    2. 将重悬的沉淀以薄层形式加至40%密度梯度缓冲液表面，在4 °C下以800 x g离心10分钟（不启用刹车）。
    3. 小心吸除上清液，包括上层（DMEM）和中层（死亡或非实质细胞），保留下层（沉淀：原代实质肝细胞）。
    4. 用2–3 mL Williams’ 培养基E重悬原代细胞，并转移至新的50 mL离心管中，以避免管壁残留的死细胞污染。
    5. 加入7–8 mL Williams’ 培养基E，轻轻混匀，在4 °C下以800 x g离心1分钟。
    6. 小心吸除上清液，再用10、20或30 mL Williams’ 培养基E（根据沉淀体积）重悬沉淀。
    7. 使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
    8. 用Williams’ 培养基E接种细胞，将培养板置于37 °C培养箱中孵育2–3小时，然后更换为含10% FBS和抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）的DMEM培养基，去除死亡或未贴壁细胞，并在37 °C下继续过夜培养。
    9. 次日，原代小鼠肝细胞即可用于实验。

2. 检测新生蛋白质合成的化学选择性连接反应实验

  1. 代谢标记
    1. （预处理）用37 °C温热的PBS洗涤原代肝细胞两次，然后加入无甲硫氨酸的DMEM培养基孵育30分钟，以耗尽细胞质中的甲硫氨酸储备。
      注意：L-叠氮高丝氨酸是一种氨基酸，为甲硫氨酸的类似物，含有一个叠氮基团，可在细胞蛋白质生物合成过程中被掺入蛋白质中。因此，通过耗尽胞质中的甲硫氨酸，可促进L-叠氮高丝氨酸在培养的原代肝细胞新合成蛋白质中的摄取与掺入。
    2. （处理）用37 °C预热的PBS洗涤原代肝细胞两次，然后加入含25 μM AHA（L-叠氮高丙氨酸）的无甲硫氨酸DMEM培养基，孵育4–6小时。
    3. 添加任何特定化学物质（即 在培养基中加入10 μM rotenone，并在AHA存在下处理4–6小时，以研究其对新生蛋白质表达水平的影响。
    4. 孵育后，用真空抽吸法除去培养基，并用冷的PBS洗涤原代肝细胞3次。
    5. 加入200 μL裂解缓冲液至孔板中，冰上孵育15–30分钟，然后倾斜孔板，将全细胞裂解液转移至1.7 mL离心管中。
      注意：在收集细胞时，应观察到细胞裂解物具有很强的黏性。
    6. 在冰上使用探头式超声仪对细胞裂解液进行三次超声处理，每次5秒，以溶解蛋白质并分散DNA。
    7. 涡旋细胞裂解液5分钟，在4℃、21,130 × g条件下离心10分钟 oC，然后将澄清的上清液转移至新管中。重复测定蛋白质浓度两次。
      注意：若蛋白质样品未立即使用，可于 -20 °C 保存两周。
  2. 标记叠氮化修饰的新生蛋白
    1. 将60 μL的组分（A）加入组分（B）中，以配制组分（A+B）。
      注意：将组分（A）加入组分（B）后，溶液颜色变为亮粉色。
    2. 根据方案配制缓冲液（D）和（E）。
    3. 取20–40 μg细胞裂解液，加入50 μL 2x反应缓冲液（组分A+B），再用DDW定容至80 μL，涡旋混匀5秒。
    4. 加入5 μL CuSO4（组分C），涡旋振荡5秒。
    5. 加入5 μL反应缓冲液添加剂1（新配制的组分D），涡旋振荡5秒，静置3分钟。
    6. 加入10 μL重悬的反应缓冲液添加剂2（组分E），然后涡旋振荡5秒，并使用多管旋转仪在4 °C下旋转孵育样品20分钟。
      注意：加入组分（E）后，溶液颜色变为亮橙色。样品在旋转过程中应避光保存。
    7. 加入300 μL甲醇，涡旋5秒；加入75 μL氯仿，涡旋5秒；然后加入200 μL DDW，涡旋5秒。
    8. 在 21,130 × g 和 4℃ 条件下离心样品 °C 下孵育 5 分钟，弃去上清液，保留沉淀。
    9. 向管中加入 250 μL 甲醇，涡旋混匀，再于 21,130 x g 离心 5 分钟.
    10. 弃去上清液，然后用无绒布覆盖样品，并将沉淀物在室温下晾干15分钟。
  3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析与蛋白质印迹法
    1. 将沉淀物溶于20 μL上样缓冲液中 无 β-巯基乙醇，涡旋10分钟，使用加热块在70 °C加热10分钟。然后将样品上样至10% SDS凝胶（1.5 mm）进行四甲基罗丹明（TAMRA）检测。
    2. 使用多功能激光扫描仪检测AHA信号，以精确定量新生蛋白质。
    3. 用双蒸水洗涤凝胶15分钟。
    4. 然后，使用快速且灵敏的考马斯亮蓝染色试剂对10% SDS凝胶染色15–60分钟，以检测总蛋白作为对照。
    5. 用去离子水脱色1–2小时，然后使用紫外荧光成像仪获取图像。

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结果

小鼠原代肝细胞分离可获得约 20 × 106 个总细胞/只小鼠。经 24 小时培养后，活的且已贴壁的原代肝细胞在组织学上呈多边形或典型的六边形，细胞膜边界清晰（图 2）。

为了确认分离的细胞是否为原代肝细胞，我们比较了分离的原代小鼠肝细胞（PMHs）、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、小鼠肝癌细胞系（Hepa 1-6）以及小鼠肝脏中白蛋白蛋白的表达水平。白蛋白蛋白的表达仅在原代小鼠肝细胞和小鼠肝脏中被检测到，而在MEFs或Hepa 1-6细胞中均未检测到（图3）。

为了确定鱼藤酮对肝脏AMP激活的蛋白激酶（AMPK）活化的影响是否为细胞自主性，我们比较了从野生型小鼠肝脏分离的原代肝细胞的时间依赖...

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讨论

尽管已有多种永生化肝细胞系被提出并用于研究肝脏功能49,50,51,52，但这些细胞通常缺乏正常肝细胞的重要基本功能，例如白蛋白的表达（图3）。因此，尽管原代肝细胞的培养与维持存在挑战，学界普遍认为使用原代肝细胞是在体外研究肝脏生理学和代谢功能的有价值选择。本研究详细描述了一种相对简便且高效的两步胶原酶法，成功分离出原代小鼠肝细胞。通过该方法，培养中获得的大多数原代肝细胞仍保持其代谢功能和形态稳定性，可用于研究肝脏功能，包括蛋白质代谢、糖异生以及线粒体呼吸作用。

分离的原代肝细胞是研究肝脏能量代谢分子机制的有力实验工具。鱼藤酮通过干扰线粒体中电子传递链复合物I的活性，阻断氧化磷酸化过程，导致ATP合成受限53，这一点可通过...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢Joonbae Seo博士和Vivian Hwa博士提供的科学建议与讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）（R01DK107530）资助。T.N. 受日本科学技术振兴机构（JST）PRESTO项目支持。本研究的部分工作由美国国立卫生研究院（NIH）（P30DK078392）资助，用于支持辛辛那提消化系统疾病研究中心核心设施。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HEPES缓冲液Fisher ScientificBP310-500
D-葡萄糖Fisher ScientificD16-500
乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸AmericanBioAB00505-00025
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩）Gibco15240-062
无钙、无镁、无酚红的HBSS（10倍浓缩）Gibco14185-052
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）Fisher ScientificC79-500
密度梯度缓冲液GE Healthcare17-0891-02
DMEM（杜氏改良伊格尔培养基），低糖，含丙酮酸Gibco11885-084
胎牛血清HycloneSH30910.03
磷酸盐缓冲液（PBS）（1倍浓度）Gibco1897141
不含谷氨酰胺的Williams E培养基Gibco12551-032
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽补充剂Gibco35050-061
X型胶原酶Wako Pure Chemical Industries039-17864
灌注泵Cole-ParmerMasterflex L/SEquipment
静脉输液装置EXELINT29081Equipment
水浴锅REVSCIRS-PB-200Equipment
管式加热器Fisher ScientificIsotempEquipment
乙醇Decon Lab, Inc0-39613
异氟烷PHOENIX10250
经高压灭菌的棉签Fisherbrand23-400-124
100 mm培养皿TPP93100
连接器（雄性鲁尔锁环）Cole-Parmer instrumentEW-4551807
24 G导管TERUMOSurflo 24Gx3/4'
100 μm滤膜（细胞筛）VWR10199-658
15 mL锥底离心管VWR89039-666
50 mL锥底离心管VWR89039-658
化学选择性连接反应蛋白分析检测试剂盒，TAMRA炔InvitrogenC33370
AHA（L-叠氮高丙氨酸）InvitrogenC10102
无甲硫氨酸DMEMGibco21013024
二盐酸-L-胱氨酸SIGMAC2526
Laemmli样品缓冲液BioRad161-0737
蛋白酶抑制剂混合物SIGMAP9599
SDS溶液（20%）BioRad161-0418
Tris-HCl（1 M）American BioanalyticalAB14044-01000
磷酸酶抑制剂混合物SIGMAP5726
蛋白质浓度测定试剂盒（牛血清白蛋白-BSA）BioRad500-0207
6孔组织培养板TPP92006
数字加热块VWR12621-092Equipment
多用途旋转混合仪Grant-bioPTR-60Equipment
超声波破碎仪Cole-ParmerGE130PBEquipment
标准重型涡旋混合器VWR97043-566Equipment
多模式激光扫描仪GE Healthcare Life ScienceFLA 9500Equipment
考马斯亮蓝染色试剂Thermo Scientific24594
倒置显微镜OlympusCKX53Equipment
蛋白质印迹装置BioRad1658004Equipment
离心机Eppendorf5424REquipment
自动细胞计数仪BioRadTC20Equipment
FluorChem R系统proteinsimple-Equipment
p-AMPKα（T172）抗体Cell signaling2535
总AMPK抗体Cell signaling5832
白蛋白抗体Cell signaling4929
β-肌动蛋白抗体Santa Cruzsc-130656
精细剪刀和镊子

参考文献

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
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