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一种用于检测汞和镉的厌氧生物传感器检测方法

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DOI：

10.3791/58324

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2018年12月17日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Ottawa

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用厌氧全细胞微生物生物传感器评估不同环境变量如何影响汞和镉在缺氧环境中对细菌生物可利用性的实验方案。

摘要

汞（Hg）对微生物的生物可利用性是汞在食物网中发生毒性生物放大作用的关键步骤。镉（Cd）的转化及其对细菌的生物可利用性决定了其在主粮作物中积累的量。这些金属的生物可利用性取决于它们在溶液中的形态，尤其在缺氧条件下更为重要，因为在缺氧环境中汞会被甲基化为有毒的单甲基汞（MeHg），而镉则持续存在于根际。全细胞微生物生物传感器在金属进入细胞质时会产生可量化的信号，因此是评估金属生物可利用性的有效工具。然而，由于现有报告蛋白在无氧条件下功能受限，目前大多数生物传感研究仍局限于有氧环境。本研究中，我们介绍了开发和优化一种可在厌氧条件下运行的全细胞生物传感器检测方法的努力，该方法能够在数小时内近乎实时地检测缺氧条件下的金属。我们阐述了该生物传感器如何帮助评估与金属环境循环相关的化学变量对其生物可利用性的影响。以下实验方案包括：（1）在缺氧条件下制备汞和镉标准溶液的方法；（2）在无氧条件下制备生物传感器的方法；（3）设计并实施实验以确定一系列变量对汞或镉生物可利用性影响的方法；以及（4）生物传感器数据的定量与解读方法。我们展示了生物传感器的线性响应范围，并通过使用金属诱导型和组成型菌株，提供了该方法能够区分金属生物可利用性与毒性的实例。

引言

汞（Hg）是一种全球性污染物，其对汞甲基化微生物的生物可利用性是汞通过食物网生物放大并可能对人类和野生动物产生神经毒性效应的第一步1。目前认为，微生物介导的汞甲基化是一个细胞内过程，需要满足两个条件：i）汞的形态具有生物可利用性2,3,4,5,6,7；ii）细胞本身具备甲基化汞的生理能力8,9,10。镉（Cd）可在生物体内发生生物累积，但不会在食物网中发生生物放大，且广泛应用于工业和商业过程中，常导致人和环境的急性暴露11。尽管微生物在汞的环境归趋中发挥多种关键作用，但关于镉的地球化学和生态毒理学研究大多集中于微生物真核生物12。食用农作物（例如水稻）是人体直接接触镉的主要来源；在此情况下，根际微生物对镉的生物可利用性直接影响植物对其的富集程度13。

汞的转运途径十分复杂，可能涉及主动转运步骤14当涉及转运蛋白时，近期研究提示 HgII 使用 ZnII 或 MnII 转运蛋白7,15,16,17. 而CdII 被假定为通过二价金属转运途径（特别是Mn）意外转运至胞质溶胶中II 或 ZnII），镉的作用机制II 细胞内的转运机制仍属推测，尚未发现特异性的镉转运途径13,18无论所涉及转运蛋白的性质如何，三种机制因素最终决定了金属进入细胞的能力：i）溶液中金属的形态2,6,15,16,17,19,20,21,22,23，ii) 细胞膜的生物理化性质17,24,25,26,27,28,29,30,31，以及 iii) 金属进入转运位点的能力7,32镉和汞由于对溶解性有机质（DOM）及螯合污染物具有高亲和力，在微生物生理相关条件下不太可能以游离离子形式存在。例如， EDTA）或还原态硫基团33,34,35 (CdII 可以以游离离子形式存在，或在缺乏这些配体时形成离子对。目前尚缺乏有效的方法来确定在与环境归趋相关的条件下这些金属物种的生物可利用性。例如，汞在厌氧条件下会发生甲基化14，且镉和Hg均为软金属（或B类阳离子），因此必须在保持还原态硫基团完整性的条件下研究其形态。

微生物生物传感器是能够响应细胞内金属（如汞或镉）浓度而产生可量化信号的细菌细胞。因此，它们是研究金属如何进入细胞的理想工具36，前提是暴露条件需严格控制。汞生物传感器通常包含调控元件与报告基因的融合，其中调控元件来自汞抗性基因 mer-操纵子（包括编码转录调节因子MerR的基因以及该操纵子的操纵区和启动子区）和报告基因例如，lux、gfp、lac 基因）。当细胞质中存在汞时，汞会与MerR结合，从而启动报告基因的转录并产生相应的信号19,37特定的Cd生物传感器通常利用以下方法设计 cadC, cadAC, zntA 或 zntR 编码的转录调控因子38，但值得注意的是，MerR 对 Cd 具有较低但可量化的亲和力5由于大多数常用发光或荧光报告蛋白存在需氧限制，直到最近，微生物生物传感器仍无法提供有关缺氧条件下金属生物转化的信息。这使得在一系列与金属环境归趋相关的条件下，特别是在存在氧化还原敏感配体的情况下，对金属生物有效性的厌氧检测变得极为困难。例如， 硫化物和硫醇4,5,39.

为克服在无氧条件下进行活体成像的方法学难题，Drepper 等（2007）开发了一种基于黄素的荧光蛋白（FbFp），该蛋白源自恶臭假单胞菌（P. putida）SB2蛋白的光-氧-电压结构域。该蛋白家族能够在无氧条件下产生荧光40。在Drepper 等研究的基础上，本实验室设计了一种厌氧生物传感器，可用于研究在有氧和无氧条件以及宽盐度范围内汞（Hg）的生物可利用性17。本文中，我们描述了如何制备和使用该生物传感器，以检测环境变量对汞或镉（Cd）生物可利用性的影响。尽管该生物传感器是为检测HgII而开发的，但我们选择以CdII进行实验，旨在提醒读者注意：生物传感器可能对环境中常共存的多种胁迫因子产生响应；本研究中选择CdII是因为已知其可结合转录调控因子MerR5。本文展示了针对两种金属的代表性校准曲线及功能线性范围。同时，我们还举例说明了生物传感器结果具有明确结论的情况（MgII和MnII对Hg生物可利用性的影响）和结论不明确的情况（ZnII对Hg生物可利用性的影响）。

方案

1. 培养基与暴露介质的配制

  1. 配制 250 mL 生长培养基：
    注意：如果微量元素 #1 溶液和微量元素 #2 溶液已预先配制好，请直接跳至步骤 1.1.5。
    1. 在洁净的容量瓶（200 mL）中配制微量元素 #1 溶液，使其终浓度为 1.5 × 10-3 M Na2MoO4、6.5 × 10-4 M Na2SeO4、5 × 10-3 M H3BO3 和 0.1 M NaOH。
      警告：强碱（NaOH）具有腐蚀性。称量试剂时需确保最终摩尔浓度准确反映关键微量元素（Mo、Se 和 B）的含量。
    2. 在无菌条件下，使用 0.22 µm 聚醚砜注射器滤器，在洁净/无菌的塑料/聚四氟乙烯（PTFE）瓶中进行过滤除菌。
    3. 在洁净的容量瓶（200 mL）中配制微量元素 #2 溶液，使其终浓度为 0.01 M MnSO4、5 × 10-4 M ZnSO4、3.25 × 10-3 M CoCl2、6.25 × 10-3 M NiCl2 和 0.1 M H2SO4。
      警告：强酸（H2SO4）具有腐蚀性。称量试剂时需确保最终摩尔浓度准确反映关键微量元素（Mn、Zn、Co 和 Ni）的含量。
    4. 在无菌条件下，使用 0.22 µm 聚醚砜注射器滤器，在洁净的玻璃瓶中进行过滤除菌。
    5. 在无菌条件下，于一个洁净/无菌的玻璃瓶（最小容量 250 mL）中加入 200 mL 超纯水、42.5 mL M9 最小盐溶液（5×；参见材料表）、2.5 mL 2 M 葡萄糖、125 µL 2 M MgSO4、1200 µL 来自冷冻（-20 ˚C）分装液的 0.6 M 盐酸硫胺素、1.25 mL 4 M NaNO3、770 µL 0.075 M L-亮氨酸/L-异亮氨酸/缬氨酸溶液、250 µL 微量元素 #1、250 µL 微量元素 #2 以及 250 µL 0.01 M EDTA 钠盐。
      注意：步骤 1.1.5 中的所有试剂应预先配制，并使用 0.22 µm 聚醚砜注射器滤器过滤除菌。超纯水可通过高压灭菌器进行灭菌。
    6. 将装有步骤 1.1.5 所得溶液的玻璃瓶盖上松动的瓶盖，送入厌氧室的气闸舱循环处理。
    7. 在厌氧室内，加入 15 µL 0.225 M FeSO4（溶于 0.2 M H2SO4 中），拧紧瓶盖并振荡，直至所有白色沉淀完全消失。
      注意：步骤 1.1.7 中的所有试剂应预先配制，并使用 0.22 µm 聚醚砜注射器滤器过滤除菌。0.225 M FeSO4（溶于 0.2 M H2SO4 中）应储存在厌氧室内。
    8. 打开瓶盖，静置 1 分钟以完成气体交换，重新盖上瓶盖，然后剧烈振荡。重复此操作一次。
    9. 将瓶盖拧紧，从厌氧室中取出，并将瓶子置于冰箱（4 ˚C）中保存，直至使用。
    10. 生长培养基应每周重新配制一次，重复步骤 1.1.5 至 1.1.9。
  2. 在两个 50 mL 无菌聚丙烯锥形离心管中配制 100 mL 暴露培养基：
    注意：建议在进行暴露实验当天配制暴露培养基，以最大限度降低污染风险；但也可提前配制并冷藏保存。
    1. 在厌氧室内，向每个 50 mL 离心管中加入 42 mL 厌氧超纯水、350 µL 来自冷冻（-20 ˚C）分装液的 1 M 磷酸-beta-甘油钠、2 mL 1 M MOPS 游离酸、50 μL 1 M (NH4)2SO4、125 μL 2 M 葡萄糖、300 μL 2.5 M KOH 以及 200 μL 2.5 M NaOH。
      注意：步骤 1.2.1 中的所有试剂应预先配制，并使用 0.22 µm 聚醚砜注射器滤器过滤除菌。超纯水可通过高压灭菌进行热灭菌。2.5 M NaOH 必须储存在塑料/PTFE 瓶中。除磷酸-beta-甘油钠需储存在 (-20 ˚C) 冰箱中外，其余所列试剂均应储存在厌氧室内。通常建议将所有塑料或玻璃部件及容器在厌氧室中放置数天，以确保无残留氧气。
    2. 盖紧 50 mL 离心管，充分振荡混匀，取出 10 mL 分装液测定 pH。该暴露培养基的 pH 值在 25 ˚C 下必须始终为7.00 ± 0.02。若 pH 不在此范围内，需调整所加 2.5 M KOH 的体积进行校正。
      注意：切勿使用 pH 探针滴定溶液来调节 pH。pH 探针可能成为暴露培养基的污染源。pH 值必须完全由步骤 1.2.1 中添加的试剂决定。
  3. 配制 5–10 mM NaNO3 储存液，并置于厌氧室中，供暴露实验期间使用。
    注意：稀释较高浓度的 NaNO3 原液比直接配制 5–10 mM NaNO3 原液更为方便。

2. 汞和镉标准溶液的制备。

  1. 配制4-8 µM 汞（HgII) 溶液置于 0.2 M H2SO4.
    1. 制备 Hg2+ 通过配制毫摩尔浓度（1-10 mM）的 HgCl 标准溶液2，HgNO3 或 HgSO4 0.2 M H 溶液2SO4.
      警告：汞具有高度毒性，且 H2SO4 具有腐蚀性。应在通风橱中操作，并穿戴所有必要的个人防护装备。
    2. 在聚四氟乙烯瓶中，将2.1.1中的标准溶液稀释至0.2 M H2SO4 以获得4-范围内的浓度8 µM Hg2+.
      注意：所用酸必须为分析纯级 H2SO4.
    3. 2.1.2 中的汞浓度应使用汞分析仪进行验证（参见 材料表).
      注意：可采用其他方法对汞浓度进行验证。
  2. 制备 10 µM CdII 10 mM H中的溶液2SO4.
    1. 制备 CdCl 的一级标准品2 （准确称量粉末的浓度范围为10–50 mM）置于0.1 M H2SO4.
    2. 在一系列洁净的、经酸冲洗过的20 mL硼硅酸盐玻璃小瓶（带黑色酚醛螺旋盖，盖内衬聚四氟乙烯覆面橡胶垫）中进行连续稀释，将2.2.1中的标准品稀释至 10 µM Cd2+确保 H 的浓度2SO4 在每一次后续的连续稀释中，浓度仍保持为 10 mM。

3. 厌氧暴露实验用生物传感器的制备

  1. 将汞诱导型生物传感器（含PUC57merR-PpFbFp的E. coli NEB5α）和组成型表达生物传感器（含PUC19Balch-PpFbFp的E. coli NEB5α）从-80 °C甘油保藏菌种接种至含120 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板。有关这些生物传感器构建的详细信息，请参见我们此前发表的研究工作17.
  2. 下午4:30至5点，将菌种接种于10 mL LB（加氨苄青霉素）培养基中，过夜培养。
    注意：从一块培养皿开始，需要 2 天 为制备厌氧培养物 暴露实验 (即， 周一 afternoon（4:30-5 PM）开始的培养物将可进行后续操作 暴露实验 周三中午左右）。以下步骤是当天准备培养物所必需的微生物学技术 暴露实验.
    1. 从平板培养物中挑取一个菌落，加入到10 mL的LB培养基（Lysogeny Broth）中 21 µL 在无菌培养管中加入100 mg/mL氨苄青霉素钠盐储备液（终浓度为210 μg/mL amp）。
    2. 将培养物放入培养箱/摇床中，在 +37 ˚C、220 rpm 振荡条件下过夜培养。
  3. 次日上午9-10点，重悬培养物，并以20%接种量进行全天厌氧培养。
    1. 将培养物从培养箱（步骤 3.2.1）中取出，并将 培养基 （步骤 1.1.9）加入到 厌氧培养箱.
    2. 加入8 mL新鲜的 培养基 和氨苄青霉素（210 μg/mL) 转移至无菌 Balch 试管中。
    3. 收集2 mL过夜培养的菌液，转移至2 mL微量离心管中。在10,000 RCF条件下离心90秒，弃上清，沉淀用缓冲液重悬 2 mL 新鲜的 培养基将重悬的菌液加入含有8 mL新鲜培养基的Balch试管中 培养基 和氨苄青霉素。
    4. 使用无菌技术，小心地将橡胶塞盖在Balch管上。从 厌氧培养箱 置于培养箱/摇床中，在37 ˚C、220 rpm振荡条件下厌氧培养至下午3-5点。
  4. 下午3至5点之间，将1%的厌氧接种物接种到新鲜培养基中 培养基 过夜培养。
    1. 将Balch管（步骤3.3.4）放入 厌氧培养箱 以及 培养基添加 100 µL 将培养物转移至10 mL新鲜培养基中 培养基 （1% 接种量）在无菌Balch管中加入氨苄青霉素（210 μg/mL Amp）。
    2. 使用无菌技术，小心地将橡胶塞盖在Balch管上。从 厌氧培养箱，置于培养箱/摇床中，在37 ˚C、220 rpm振荡条件下过夜培养。
  5. 上午9点至10点之间，将培养物重悬，使其在当天内厌氧生长（接种量为20%）。
    1. 将培养物从培养箱（步骤 3.4.1）中取出，并将 培养基 （步骤 1.1.9）加入到 厌氧培养箱.
    2. 加入 8 mL 的 培养基 并将氨苄青霉素（210 ug/mL amp）加入无菌Balch试管中。
    3. 收集2 mL过夜培养的菌液，转移至2 mL微量离心管中。在10,000 × g离心90秒，弃上清，沉淀重悬于 2 mL 新鲜的 培养基将重悬的菌液加入含有8 mL新鲜培养基的Balch管中 培养基 和氨苄青霉素。
    4. 使用无菌技术，小心地将橡胶塞盖在巴尔氏管（Balch tube）上。从厌氧箱中取出后置于培养箱/摇床中，在37 ˚C、220 rpm振荡条件下进行厌氧培养。
  6. 使用分光光度计（步骤 3.5.4）监测培养物的生长，直至达到 光密度600 0.6 达到该值后，每次测量OD前务必涡旋振荡培养物。
    注意：此步骤需要 3-4 小时，且 暴露培养基 （步骤1.2）也应在此期间准备好 暴露实验 （步骤 4.1）
  7. 当培养物达到指定状态时停止培养 光密度600 0.6（±0.1） （预计生长时间为3-4小时）。
    1. 将试管放入 厌氧培养箱 （步骤 3.6）并将培养物转移至 2 x 2 mL 微型离心管。在10,000 x g条件下离心90秒，弃上清液，重悬于2 x 2 mL 新鲜的 暴露培养基.
    2. 重复步骤 3.7.1 一次，以去除任何残留的 培养基.
  8. 将步骤3.7中两个微量离心管中的细胞培养物合并至一个7 mL聚四氟乙烯（PTFE）标准小瓶中，以获得 生物传感器储备液 用于 暴露实验 （步骤 4）。
    注意：务必混合 生物传感器储备液 通过轻轻反复吹打混匀后使用。此步骤可暂停最多一小时。

4. 暴露实验

  1. 设计微孔板布局。
    注意：在开始暴露实验之前，务必完成所有移液量的计算并准备好相应的储备液。如何正确设计实验以及应包含哪些对照组，文中已有详细说明。此外，若厌氧监测仪显示厌氧舱内存在氧气，则不应启动实验。
    1. 根据96孔模板设计微孔板布局。若每个处理设置3个技术重复，则最多可进行32种不同的处理，建议采用4 × 8的网格形式来设置离心管（见图1）。

用于实验室分析中高通量筛选实验的微孔板和样品管设置。
图1：一个96孔板（左）和一个对应的4×8排列的聚四氟乙烯（PTFE）小瓶阵列（右），用于将样品转移至微孔板中。 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：在利用以下方法检测某一变量对汞（Hg）吸收作用时 汞诱导型生物传感器 每个变量需要两个处理： 治疗 （生物传感器 + Hg + 可变 + 硝酸盐）及其 处理空白 （生物传感器 + 变量 + 硝酸盐）。在利用生物传感器检测某一变量对细胞生理功能的影响时 组成型生物传感器， 每个变量需要两个处理： 治疗 （生物传感器 + Hg + 可变 + 硝酸盐）和 治疗 空 （生物传感器 + 变量 + Hg）。汞可替换为镉。在绘制校准曲线时，Hg 或 Cd 将作为变量。 组成型 和 可诱导的 生物传感器无需在同一时间（即相同的板布局）进行检测。以下提供了在测试镁浓度梯度（变量）时，板布局及相应4×8网格的模板示例。 表1).

123456789101112
aHg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0 mM MgHg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 0 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 0 mM Mg
bHg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0.1 mM MgHg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 0.1 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0.1 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 0.1 mM Mg
cHg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 1 mM MgHg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 1 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 1 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 1 mM Mg
dHg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 10 mM MgHg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 10 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 10 mM Mg组成型生物传感器 + Hg + 10 mM Mg
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表1：使用生物传感器在镁浓度梯度（0–10 mM）下检测汞（5 nM）生物有效性的示例微孔板布局

  1. 根据检测板布局设置 4 x 8 网格。
    1. 将7 mL PTFE标准小瓶放入托盘中。
      注意：PTFE 瓶在使用前应进行酸洗和高温灭菌。操作时仅可通过接触瓶身外部来处理瓶子。
    2. 向每个小瓶中加入 暴露培养基 与每个对应的体积 治疗.
      注意：在总体积为 2,000 µL （2 mL），加入的 暴露培养基 将是： 暴露培养基 µL = 2,000 µL – 处理（空白） µL. (例如， 暴露培养基 µL = 2,000 – 100 µL （生物传感器）– 40 µL （硝酸盐）– 100 µL (Hg) – 100 µL （变量（例如， MgSO₄4)) = 1660 µL). 确保所添加的待测变量体积不超过5%（100 µL最终体积的）
    3. 向每个小瓶中加入根据板布局确定的相应体积的待测化学变量溶液。
    4. 从步骤1.3开始，向每个小瓶中加入硝酸盐，使其终浓度为 200 µM (40-80 µL）。此步骤不适用于 组成型生物传感器处理空白对照.
    5. 从步骤 2.1 或 2.2，加入 Hg (5 nM 在检测变量时）或 Cd（300 nM 根据平板布局向小瓶中加入待测变量）。此步骤不适用于 汞诱导型生物传感器处理空白对照.
      1. 使用 Hg 时，应采取 4-8 µM 储存并充分振荡。将溶液稀释 暴露培养基 在7 mL PTFE小瓶中 100-250 nM 配制工作用 Hg 溶液。从该工作溶液中向所需样品瓶加入 Hg。本实验中 Hg 的标准曲线范围为 0 至 12.5 nM。
        注意：在检测某一变量对汞（Hg）或镉（Cd）生物可利用性的影响时，需确保所有处理组中的[Hg]或[Cd]保持恒定。添加Hg或Cd时，应使用同一个移液枪头，但切勿接触小瓶中的暴露培养基。
  2. 手动进行圆周振荡。
    注意：根据汞或镉在溶液中形态转化所需时间，实验此时可暂停。若放置超过一小时，需用聚四氟乙烯（PTFE）盖密封PTFE小瓶，以防止蒸发或污染。
  3. 轻柔吹打 生物传感器储备液 来回振荡以确保均匀。加入 100 µL 的 生物传感器储备液 向每个小瓶中加入适量试剂。手动进行圆周振荡。
  4. 将酶标仪预热并设置为以下条件进行读数：温度设定为 37˚C，动力学实验运行 10 小时 每2.5-5分钟读取一次数据，读取间隔期间进行轨道振荡，同时进行荧光检测 440 nm 荧光激发 和一个 500 nm发射.
  5. 移液器 200 µL 从4×8网格中的每个PTFE小瓶转移至96孔板（黑色，96孔透明底非结合表面微孔板）的相应孔中。每次转移前，用移液器反复吹打5次 200 µL.
    注意：不要丢弃移液器吸头，而是将其保留在PTFE小瓶中，以跟踪移液进度。
  6. 将96孔板放入酶标仪的板架中，然后盖上96孔板盖，开始检测。

5. 数据量化

  1. 每份样品的荧光强度 治疗 每个时间点的数据必须针对每个单独孔的背景噪声进行校正，并以空白对照进行空白校正 处理空白组
    1. 每个时间点（t）的荧光强度 治疗 (T) 必须根据每个孔第一次时间点的初始荧光值（t­0）进行校正，然后对3个重复样本取平均值 处理 重复 (r1- r3). 该处理组的平均值随后需减去空白对照组的平均值 处理空白 (结核病）以相同方式翻译（公式 1）。

荧光强度 (t) = 平均值(Tr1(t) – Tr1(t0), Tr2(t) – Tr2(t0), Tr3(t) – Tr3(t0)) – 平均值(TBr1(t) – TBr1(t0), TBr2(t) – TBr2(t0), TBr3(t) – TBr3(t0))           (1)

注意：应将其设置为电子表格函数。还应针对每个时间点计算误差的正确传递。

  1. 将每种处理的校正后荧光强度随时间变化绘制成图

Hg(II)检测的荧光时间与浓度关系图；不同[Hg(II)] nM对RFU的影响。
图2：校正后的荧光数据随时间变化关系。 在厌氧条件下，向携带pUC57merR-Pp质粒（可诱导菌株）的大肠杆菌（E. coli）NEB5α中加入不同浓度HgII（0–12.5 nM），测定其随时间变化的相对荧光单位（RFU）。荧光值为37 ˚C下三个技术重复的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：图中没有 0 nM Hg 的数值，所有其他 Hg 浓度均已相对于 0 nM Hg 进行空白校正 处理空白因此，0 nM Hg 代表横轴，任何正向荧光信号均表示在给定变量条件下由 Hg 产生的荧光。不以这种方式对荧光进行空白校正也是可选的，但如果所测试的变量具有背景荧光，则荧光曲线将给出误导性的结果即， 溶解性有机物本身会产生荧光，若未设置仅含细胞和溶解性有机物的处理空白对照，随着溶解性有机物浓度的升高，荧光信号也会增强。

  1. 定量测定荧光峰。可定量的荧光峰通常在2.5–4小时后出现，代表作为末端电子受体的200 µM硝酸盐被完全消耗所释放的能量。该荧光峰应被定量，并代表该特定treatment的最终荧光值。
    注意：如果未观察到荧光峰（即无汞生物可利用性），则应在对照组（即未添加变量或添加5 nM Hg）出现荧光峰的时间点，对treatment的荧光值进行定量。另外，如果处理组出现荧光诱导，但未形成清晰定义的荧光峰，则可能存在高亲和力电子受体（如O2）的污染，应采取措施从所有溶液中去除痕量氧气，并需重新进行实验。

结果

在根据步骤5.3对荧光峰进行定量后，可根据变量浓度绘制荧光峰结果图，以说明该变量对Hg或Cd相对生物可利用性的影响。例如，荧光强度随[HgII] 来自 图2 将产生如图所示的可诱导数据 图3A. 对于 HgII 校准曲线对于汞诱导菌株将始终包含三个组分；其中阈值响应约为1-2 nM HgII 在荧光信号产生之前，其强度与[HgII]，线性范围 5 nM HgII 将始终可靠地位于该范围的中心，以及一个随着[HgII] 将不再增加荧光信号。组成型菌株中信号生成无变化表明，[HgII] 不影响信号的产生。对于 CdII 在 图3B，诱导型菌株始终包含两个组分：一个线性范围，在此范围内 200-300 nM CdII 将始终可靠地位于线性范围和平台期的中心。随着[Cd]增加，荧光信号降低II] 表明较高浓度的 Cd 对细胞具有毒性，可解释在 Cd 浓度达到 1000 nM 平台期后诱导性荧光产生减少的现象II因此，在检测汞或镉的生物有效性与环境变量的关系时，我们建议使用 5 nM 用于 HgII 和 300 nM 的 CdII.

在某些情况下，信号的产生可准确归因于汞（Hg）或镉（Cd）的生物可利用性；但在其他情况下，信号的产生可能受到生物传感器宿主细胞生理状态变化的影响（例如，所关注的金属或测试的环境条件具有毒性）。在图4A中，测试了5 nM Hg的生物可利用性在锌（Zn）浓度梯度（0–10 µM）下的响应。在Hg诱导型和组成型菌株中，随着Zn浓度的增加，信号均表现出相似程度的下降。因此，无法区分该信号的降低是由于Hg生物可利用性降低所致，还是Zn毒性的结果。在图4B和4C中，测试了5 nM Hg的生物可利用性在镁（MgII）浓度梯度（0–10 mM）和锰（MnII）浓度梯度（0–10 µM）下的响应。随着MgII和MnII浓度的增加，诱导型菌株的荧光信号下降。相反，组成型菌株在MgII和MnII浓度升高时并未表现出荧光信号的降低（MgII和MnII有利于FbFp蛋白的生成，表现为荧光信号增强）。这表明细胞仍具有活性，而Hg诱导型菌株荧光信号的降低是由于Hg生物可利用性下降所致。该数据强调了在所有生物传感器检测中，同时提供反映细胞整体生理状态的组成型对照测量的重要性。

Hg(II)、Cd(II)离子的荧光响应图。可诱导型与组成型基因表达数据。
图3：生物传感器对汞和镉的线性检测范围。 在厌氧条件下，携带 pUC57merR-Pp（Hg-可诱导型）和 pUC19Balch-Pp（组成型）质粒的 E. coli NEB5α 在添加 A) HgII（0–15 nM）和 B) CdII（0–1,000 nM）后，测得的最大荧光值以相对荧光单位（RFU）表示，误差条为1个标准差。荧光值为37 ˚C下三次技术重复的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

锌、镁、锰浓度的荧光响应图；诱导型与组成型。
图4：锌检测结果不明确，而镁和锰检测结果明确的示例。 在厌氧条件下，测量携带 pUC57merR-Pp（汞诱导型）和 pUC19Balch-Pp（组成型）质粒的 E. coli NEB5α 的最大荧光值，以相对荧光单位（RFU）表示，误差线为 ±1 个标准差，分别添加 A) ZnII（0–10 µM）、B) MgII（0–10 mM）和 C) MnII（0–10 µM）。所有处理组的 [HgII] 浓度均设定为 5 nM，荧光值为 37 ˚C 下三次技术重复的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

微生物生物传感器是研究金属与微生物相互作用机制的有用工具。本文介绍一种可在厌氧条件下定量检测汞（HgII）和镉（CdII）对革兰氏阴性宿主细胞（E. coli）生物可利用性的方法，并在数小时内提供可量化的结果。该方案的主要优势之一在于，通过避免使用强结合配体或可能导致金属沉淀的成分，可对暴露介质中的金属形态进行高度可控的调节。本研究中已使用 PHREEQC17 对该暴露介质中的金属形态进行建模和验证，但也可采用其他金属形态分析软件。在未添加配体的情况下，汞的主要形态预计为 97% 的 Hg(OH)2 和 3% 的 Hg(NH3)22+，而镉的形态则包括 59% 的 Cd-β-甘油磷酸盐、25% 的 Cd2+ 和 16% 的 CdSO4。使用者可通过简单的热力学建模软件设计暴露介质，并检测目标金属的生物可利用性。此外，该生物传感器宿主细胞（E. coli NEB5α）在较宽的 pH 范围（5–8.5）和 NaCl 浓度范围（0–0.55 M）17 内均具有良好的存活能力。

Hg甲基化是一种厌氧过程，本研究中所述方案无需氧气，从而能够更准确地描述厌氧代谢对金属生物可利用性的影响。这一点至关重要，因为氧气的存在会改变基因表达谱。48,49 因此具有潜在的转运途径；这使得该方法相较于目前现有的好氧替代方案更具优势。本文提出的生物传感构建体还可与其他可能更适用于汞甲基化的厌氧宿主联用。例如，Geobacter、Desulfovibrio），但可能比后者更难处理 E. coli目前该方法的一个局限性在于，我们的检测限尚未达到现有有氧系统所实现的皮摩尔（pM）水平。4,19,37但需要注意的是，要达到如此低的检测限，必须采取多个步骤44：i）需要添加配体以确保汞保留在溶液中，不吸附到微生物细胞壁上（汞会不可逆地结合到细胞表面的巯基上，从而阻止其生物可利用性）25,27；参见 Hg 的阈值响应 图3A），ii）调整细胞密度，或iii）修改遗传构建体以包含转运蛋白 mer-操纵子（即 merT 和 merP），增加细胞内汞（Hg）通量50,51这些修饰有助于检测低浓度的Hg，但在评估环境相关情况时未必理想。而此前的镉生物传感器主要以 "原理验证"，它们是在复杂的培养基中设计的，这使得研究者无法评估形态转化对生物可利用性的影响41,42,43,44.

生物传感器是研究金属物种生物可利用性机制的一种极为有用的工具。由于宿主生物并非汞甲基化菌，因此该方法仅可用于建立汞进入革兰氏阴性菌的模型，而不能为汞甲基化菌如何获取汞提供确定性的解释。目前已有其他方法可用于测定汞的生物可利用性，例如以甲基化作为吸收结果的指标，或采用质量平衡法10,15,20,45,46。尽管如此，本文所述方法的优势在于可提供活细胞中准实时的生物可利用性数据。我们不建议使用该方法对环境基质中的总汞或总镉含量进行定量。尽管已有研究提出利用生物传感器测定环境中金属浓度36，但目前已有更多成熟且易于获得的标准方法，例如电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、火焰原子吸收光谱法（FAAS，适用于镉分析）或冷蒸气原子吸收光谱法（适用于汞分析）。然而，该生物传感器可用于判断特定环境基质是否具有增强或抑制生物可利用性的潜力；这一目的可通过标准加入法实现。

暴露介质的pH值可在5至8.5范围内调整，条件是将MOPS游离酸（缓冲剂）替换为具有合适pKa值的其他缓冲剂的游离酸（请参见合适的缓冲剂列表（Ferreira et al. (2015)47）），并在配制暴露介质时用KOH调节至相应的pH值。此外，该方法不仅限于汞（Hg）和镉（Cd），还可通过使用其他转录调节因子扩展至其他金属。

可通过修改暴露实验，以探究其他电子受体（如O2和延胡索酸）对汞或镉生物有效性的影响。如需获取将O2和延胡索酸同时作为电子受体的方法的微小修改方案，可联系索取。

总之，我们希望强调以下几点：I) 在步骤2中，必须明确 Cd 或 Hg 储备液的浓度，因为这些浓度将用于生物传感器的校准。II) 在暴露当天，细胞生长必须在 OD600 达到 0.6（± 0.1）时停止，并且在重悬细胞培养物时需格外小心，因为生物传感器是针对此细胞密度进行校准的。III) 最后，暴露培养基必须在暴露当天精确配制。为确保实验方案的成功，应同时培养多份培养物（以避免培养失败的可能性），并且培养基应每周重新配制一次（以避免培养基的亚稳态及可能的污染）。还应注意，生物重复样本（多个细胞培养物）在信号产生方面会表现出一定变异性。尽管不同培养物之间的荧光响应可能存在差异，但在多个生物重复样本中，针对特定变量的荧光变化趋势应保持一致。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢两位匿名审稿人以及Poulain实验室成员对厌氧生物传感器开发过程中提出的宝贵意见和深入讨论。本研究由安大略省早期研究人员奖、加拿大自然科学与工程研究理事会向A.J.P.提供的发现基金及加速器补充基金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7 ml 标准小瓶，内壁圆润Delta Scientific200-007-20推荐使用 34 个
小瓶托盘，21 mm 孔径Delta Scientific730-20014 个（适用于 4 × 8 网格）
24 mm 封口盖Delta Scientific600-024-01推荐使用 32 个
LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50CorningCorning 3931
Corning 96 孔透明平底无结合表面微孔板CorningCorning 3651
厌氧培养箱（手套箱）厌氧培养箱内的气体环境应为（97 % N2 ± 2 % 和 3 % H2 ± 2 %）
钯催化剂在厌氧培养箱中将 O2 转化为 H2O。非必需，但建议使用。
微孔板读数仪
微孔板读数仪用 450 (±10) nM 滤光片
微孔板读数仪用 500 (±10) nM 滤光片
厌氧培养小管（Balch 管）+ 橡胶塞
分光光度计适用于厌氧培养管的改装型号
MA-3000（汞分析仪）
pH 探针任何 pH 探针均可使用
50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管
0.22 µm 聚醚砜注射器滤器 + 注射器
无菌/洁净玻璃瓶用于培养基和标准品
无菌/洁净塑料或聚四氟乙烯（PTFE）瓶用于碱性溶液（NaOH/KOH）
试剂粉末：Na2MoO4、Na2SeO4、H3BO3、NaOH、KOH、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、NiCl2、氨苄青霉素钠盐、Difco M9 最小盐、葡萄糖、MgSO4、硫胺素盐酸盐、NaNO3、L-亮氨酸、L-异亮氨酸-缬氨酸、EDTA 钠盐、FeSO4、β-甘油磷酸钠、Mops 游离酸、(NH4)2SO4、Hg(NO3)2、CdCl2
无菌 Milli-Q 水经高压灭菌或滤膜除菌均可
LB 培养基（Lysogeny Broth）
分析纯 H2SO4

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