细胞周期分析在 秀丽隐杆线虫 使用胸苷类似物EdU标记生殖系

摘要

本文描述了一种基于成像的方法，可用于利用胸苷类似物EdU鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）雌雄同体生殖系中的S期并分析细胞周期动态。该方法无需使用转基因，且与免疫荧光染色兼容。

摘要

真核生物的细胞周期分析通常利用染色体形态、细胞周期各阶段所需基因产物的表达和/或定位，或核苷类似物的掺入来进行。在S期，DNA聚合酶将胸苷类似物（如EdU或BrdU）掺入染色体DNA中，从而标记细胞以供分析。对于C. elegans，可在常规培养过程中通过喂食方式给予线虫核苷类似物EdU，且该方法与免疫荧光技术兼容。C. elegans的生殖系是研究信号通路、干细胞、减数分裂和细胞周期的强有力模型系统，因其组织透明、遗传操作简便，并且减数分裂前期及细胞分化/配子发生过程以线性组装的方式依次进行。这些特性使得EdU成为研究有丝分裂细胞动态行为及生殖系发育的优良工具。本实验方案详细描述了如何成功制备含EdU的细菌，喂食野生型C. elegans雌雄同体个体，解剖其生殖腺，对DNA中的EdU掺入进行染色，使用抗体检测多种细胞周期和发育标志物，成像生殖腺并分析结果。本方案还阐述了在测定S期指数、M期指数、G2期持续时间、细胞周期总时长、减数分裂进入速率以及减数分裂前期进程速率时，实验方法与分析中的各种变异条件。该方法可进一步调整，用于研究其他组织、发育阶段、遗传背景及生理条件下细胞的周期进程或细胞历史。

引言

在动物发育过程中，需要经过数百次、数千次、数百万次、数十亿次甚至数万亿次的细胞分裂才能形成成体生物。细胞周期是一系列细胞事件的总称，包括G1期（间隙期）、S期（合成期）、G2期（间隙期）和M期（有丝分裂期），定义了每次细胞分裂所执行的事件序列。细胞周期是动态的，最理想的是在实时观察下进行研究，但这在技术上可能较为困难。本实验方案中介绍的技术能够使研究者通过静态图像来测量细胞周期各时相及其时间进程。

使用核苷类似物（如5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）或5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU））标记是研究成年秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称 C. elegans）雌雄同体生殖系细胞周期动态中鉴定S期的金标准^1,2,3,4,5。EdU和BrdU几乎可在任何遗传背景下使用，因其不依赖于任何遗传构建体。BrdU的可视化需要强烈的化学处理以暴露抗原，便于抗BrdU抗体染色，但该过程常与通过其他抗体共染色来评估其他细胞标志物的方法不兼容。相比之下，EdU的可视化通过温和条件下的点击化学反应实现，因此可与抗体共染色兼容^6,7。

该标记的特异性十分明确，因为只有在S期，细胞核才会将胸苷类似物（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入DNA中。可视化过程在固定组织中进行。EdU标记本身不可见，直到含有叠氮基团的染料或荧光染料通过铜催化的点击化学反应与EdU中的炔基发生共价结合⁸。通过短时间脉冲标记，EdU标记可立即提供处于S期的细胞核信息。此外，通过脉冲-追踪或连续标记，EdU还可提供动态信息；例如，在脉冲-追踪实验中，随着细胞每次分裂，标记会被稀释，或随着非分裂细胞的发育进程而持续传递。

C. elegans 雌雄同体的生殖系是研究信号通路、干细胞、减数分裂和细胞周期的有力模型系统。成体生殖系呈极性排列，类似于流水线结构：在远端存在干细胞，随后细胞进入并推进减数分裂前期，同时在更近端区域与配子发生的不同阶段相协调（图1）。在近端，卵细胞成熟后被排卵并受精，并在子宫内启动胚胎发育^9,10,11。靠近远端顶端细胞、长度约为20个细胞直径的区域，包含进行有丝分裂循环的生殖系干细胞、前体细胞以及减数分裂S期细胞，但不包括处于减数分裂前期的细胞，该区域被称为前体细胞区^2,4,9,12。在远端生殖系中，细胞膜并未完全分隔各个细胞核，但前体细胞区的细胞在很大程度上独立进行有丝分裂周期。年轻成体雌雄同体的生殖系前体细胞区细胞的中位有丝分裂周期时长约6.5小时；G1期极短或缺失，且未观察到细胞静止状态^1,2,13。生殖系干细胞的分化主要通过直接分化实现，因此不存在过渡性扩增分裂⁴。在粗线期的分化过程中，大约每5个细胞核中有4个不会形成卵细胞，而是通过凋亡途径作为滋养细胞，将其胞质内容物贡献给正在发育的卵细胞^12,14,15。

除了使用核苷类似物标记S期细胞外，还可以通过抗体染色来鉴定处于有丝分裂和减数分裂的细胞。处于有丝分裂期的细胞核对磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体（简称pH3）呈免疫阳性反应^7,16。处于减数分裂期的细胞核对HIM-3抗体（一种减数分裂染色体轴蛋白）呈免疫阳性反应¹⁷。前体区的细胞核可通过缺乏HIM-3、存在核质中的REC-8¹⁸，或存在WAPL-1¹⁹来识别。WAPL-1的信号强度在体细胞性腺中最高，在前体区较高，在减数分裂早期前期较低¹⁹。通过略微调整实验方案，可进行多种细胞周期参数的测量：I）鉴定S期细胞核并计算S期指数；II）鉴定M期细胞核并计算M期指数；III）确定细胞核处于有丝分裂还是减数分裂的S期；IV）测量G2期持续时间；V）测量G2+M+G1期的持续时间 ；VI）测量减数分裂起始速率；VII）估算减数分裂进程速率。

仅通过少数几种湿实验即可获得多个细胞周期的测量数据。以下方案描述了通过喂养进行30分钟脉冲标记的方法 秀丽隐杆线虫 成年雌雄同体线虫以EdU标记的细菌喂养，并通过抗pH3抗体染色标记M期细胞，同时利用抗WAPL-1抗体染色标记前体区细胞。仅持续时间的变化 EdU孵育（步骤2.5）、所用抗体类型（步骤5）以及分析方法（步骤8.3）是进行额外测量所必需的。

方案

1. EdU标记细菌的制备

1. 培养 MG1693 菌株的初始培养物。Escherichia coli（E. coli）MG1693 携带 thyA 基因突变。
   1. 从冻存的甘油菌种中划线接种 E. coli MG1693 至一个 120 mm 的 LB（Lysogeny Broth）琼脂培养皿上，在 37 °C 下培养过夜。
   2. 挑取两个独立的 E. coli MG1693 单菌落，分别接种至两管 4 mL 液体 LB 培养基中，于 37 °C 培养约 16 小时。
      注：MG1693 在未添加胸腺嘧啶或胸苷的 LB 培养基中仍可正常生长。
2. 在添加 EdU 的最低培养基中培养 E. coli MG1693。
   1. 对一个 500 mL 锥形瓶进行高压灭菌。
   2. 采用无菌操作，向锥形瓶中加入 5 mL 20% 葡萄糖、50 μL 10 mg/mL 硫胺素、120 μL 5 mM 胸苷、100 μL 1 M MgSO₄、200 μL 10 mM EdU、100 mL M9 缓冲液，以及 4 mL 新鲜培养的过夜 MG1693 菌液。
      注：该培养体系中 EdU 的终浓度为 20 μM^1,7。若将此浓度直接应用于哺乳动物细胞培养，会导致 DNA 损伤和细胞周期阻滞²⁰。然而，仅有部分 EdU 被 E. coli 摄取并整合，因而可供 C. elegans 利用。在对年轻成年雌雄同体线虫进行 EdU 处理后，未观察到细胞周期阻滞现象，其前体细胞区大小或 M 期指数均无变化。
   3. 在 37 °C、200 rpm 振荡条件下培养过夜，但不得超过 24 小时。
3. 浓缩标记 EdU 的 E. coli，并将其涂布于 M9 琼脂培养皿上。
   1. 将台式离心机预冷至 4 °C。
   2. 采用无菌操作，将菌液转移至 2–4 个无菌的 50 mL 锥形管中。
   3. 在 4 °C 下以 3,000 × g 离心 30 分钟，收集标记 EdU 的 E. coli 菌体沉淀。
      注：含 EdU 的上清液应按照当地及机构相关规定妥善处理。
   4. 用 4 mL 新鲜 M9 缓冲液重悬菌体沉淀。可使用无菌的 1 mL 移液枪头或无菌 5 mL 血清移液管。重悬过程可能需要数分钟。
   5. 使用同一支移液管将重悬的 EdU 标记 E. coli MG1693 溶液滴加并涂布于室温下的 60 mm M9 琼脂培养皿中央，约 8 滴。每批菌液可制备约 16 个培养皿。
   6. 让培养皿在室温下干燥数小时或过夜，随后用实验室封口膜密封每个培养皿。培养皿可在 15 °C 保存约 2 周，或在 4 °C 保存约 2 个月。每组实验应使用同一批制备的含 EdU 培养皿。

2. 向 C. elegans 喂食 EdU

1. 通过定时产卵、碱性次氯酸盐处理后孵化于含胆固醇的S培养基中，或通过挑取适当发育阶段的个体来实现群体同步化²¹将动物培养至所需阶段（此处为L4后24小时），培养基为接种有大肠杆菌OP50的线虫生长培养基 E. coli OP50，20 °C
   注意：每次实验需准备50–100只动物，因为部分个体可能解剖效果不佳，且在清洗和转移过程中会有所损耗。
2. 将EdU培养皿置于20 °C（或实验所需的温度）下回温。
3. 用M9或磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗NGM培养皿中的线虫 转移到1.5 mL离心管中。静置片刻使动物自然沉降，或在微量离心机中短暂离心。
4. 移去上清液，用约 1 mL M9 或 PBS 将样品洗涤 1–2 次。移去上清液。
5. 使用玻璃巴斯德吸管将动物连同少量M9或PBS转移至EdU培养基表面中央。静置数分钟，待液体吸收后，根据需要在20 °C孵育30分钟（用于直接测量S期）或更长时间（用于测量S期历史）。
   注意：在给予 EdU 后仅 15 分钟，即可在生殖系细胞核中检测到 EdU 信号¹.
6. 用约 2 mL M9 或 PBS 将 EdU 培养皿中的线虫冲洗至玻璃解剖皿中。

3. C. elegans 生殖系的解剖与固定

注意：本实验方案中关于秀丽隐杆线虫（C. elegans）雌雄同体生殖系的解剖、固定和抗体染色步骤与 Gervaise 和 Arur（2016）发表的方案²²几乎完全相同，区别仅在于可使用1 mL玻璃管进行离心以加快洗涤步骤，并可使用拉长的玻璃巴斯德移液管更有效地从1 mL玻璃管中移除液体。

1. 清洗与解剖 秀丽隐杆线虫 生殖系
   1. 让动物沉降到培养皿底部，轻轻晃动以使其聚集至中央，用长巴斯德吸管吸除PBS。用约2 mL PBS洗涤1–2次。
   2. 加入2 mL PBS和4 μL 100 mM 左旋咪唑以固定动物。轻轻晃动培养皿，使动物聚集于皿的中央。
      注意：固定时间可能在几秒到几分钟之间。成功的解剖并不需要完全固定。有些人在解剖未完全固定的动物时效果更佳。
   3. 使用一对25G 5/8英寸针头在头部（大约位于两个咽部膨大之间）或尾部解剖动物。注意不要切断生殖系的环状结构。由于体内压力，肠道和生殖系应从体腔中弹出，但仍保持连接。本方案类似于先前发表的Gervaise和Arur（2016）的方法。²².
      注意：解剖时间应控制在约5分钟，绝对不超过15分钟。过长的解剖时间可能导致抗体染色信号减弱（Sudhir Nayak，个人交流），而在PBS中长时间孵育可能影响动物的生理状态。快速而准确地完成解剖可能需要一定练习。
   4. 如有需要，轻轻晃动以将解剖后的动物样本聚集于中心，然后使用长柄巴斯德吸管尽可能吸除PBS。
2. 固定并脱水组织
   1. 加入2 mL含3%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，用实验室封口膜 loosely 覆盖培养皿，室温放置于实验台或抽屉中固定10分钟。
      注意：将PFA溶液在37 °C水浴中解冻，然后冷却至室温，再进行生殖腺解剖。
      警告：PFA 溶液具有中等毒性，可能为致癌物和致畸物。对苯二甲醛溶液释放的蒸气易燃。操作时需佩戴腈类手套。在化学通风橱内将 16% 的 PFA 稀释至 3%。若在通风橱外操作，须始终盖好所有容器。
   2. 将性腺小心转移至一支洁净的5 mL玻璃离心管中。
   3. 向含有性腺的培养皿中加入约 3 mL PBSTw（含 0.1% Tween-20 的 PBS），以帮助回收残留的性腺并稀释 PFA 溶液。
   4. 在临床离心机中以870 x g离心 g 约1分钟。较年轻或较小的动物需要更长的离心时间 比年长或体型更大的动物。
   5. 使用长玻璃移液管将上清液转移至废料烧杯中，最终倒入化学通风橱中的废料瓶内弃置。
   6. 加入2 mL预冷至-20 °C的高纯度甲醇。用实验室封口膜紧密封住离心管管口。
      注意：使用新鲜的高纯度“金标”甲醇对于某些抗体获得良好形态至关重要。
      警告：甲醇是一种高度易燃的液体和蒸气， 吞咽、吸入或接触皮肤后有毒 接触皮肤。佩戴手套及适当的个人防护装备。使用适用于少量易燃物的冷冻设备。
   7. 于 -20 °C 冰箱中保存 1 小时，可过夜，甚至数月。
      注意：此处可暂停本实验方案。

4. 重水化生殖系

1. 用 PBSTw 装满玻璃离心管至管口，以稀释甲醇并使性腺重新水化。在临床离心机中以 870 × g 离心约 1 分钟。
2. 使用长玻璃巴斯德吸管，将上清液转移至废弃物烧杯中，最终倒入化学通风橱中的废弃物瓶内。
3. 用约 5 mL 的 PBSTw 对性腺清洗 3 次，每次在临床离心机中以 870 × g 离心约 1 分钟。每次离心后移除上清液。
4. 用 PBSTw 冲洗一个小的 1 mL 耐热玻璃管和一支长玻璃巴斯德吸管。
5. 加入约 700 μL 的 PBSTw，并用长玻璃巴斯德吸管将性腺转移至小管中。再用少量几滴 PBSTw 确保所有性腺均被转移完全。
6. 在临床离心机中以 870 × g 离心约 1 分钟。使用拉长的长玻璃巴斯德吸管，尽可能吸除液体，同时不扰动性腺沉淀，残留液体不超过 50 μL。
   注意：如果无需进行抗体检测，可跳至第 6 步。

5. 使用抗体检测抗原

1. 将一抗用含30%血清的PBS稀释。在本示例中，anti-WAPL-1抗体按1:2,000稀释，anti-pH3抗体按1:500稀释。将 freshly thawed 血清在4 °C条件下以20,000 x g离心10分钟，以去除颗粒物。取上清液使用，该上清液可在4 °C保存数天。使用与二抗宿主生物相匹配的血清（此处使用山羊血清）。可在加入一抗前增加一个可选的封闭步骤。
2. 向每根小玻璃管中加入100 μL稀释后的一抗溶液，在室温下孵育4小时。
   注意：不同抗体的孵育时间可能不同。某些抗体在室温下孵育2小时已足够。更长的孵育时间（例如，过夜）也可行，但可能增加背景信号。
3. 用PBSTw加满各管，在临床离心机中以870 x g离心约1分钟。
4. 用约1 mL PBSTw洗涤性腺3次，每次洗涤孵育约5分钟，使过量的一抗充分扩散至洗涤液中。使用拉长的玻璃巴斯德吸管，在不扰动性腺的前提下尽可能吸除液体，残留体积不超过50 μL。
5. 将二抗用含30%山羊血清的PBS稀释。在本示例中，山羊抗兔-594和山羊抗小鼠-647均按1:400稀释。
   注意：应谨慎选择二抗，确保其荧光染料与EdU试剂盒中的染料不同。在本示例中，EdU试剂盒使用的是激发波长为488 nm的染料。
6. 向每根小玻璃管中加入100 μL稀释后的二抗溶液，在避光条件下室温孵育2小时。
   注意：不同二抗的孵育时间可能不同。某些二抗在室温下孵育1小时已足够。更长的孵育时间（例如，过夜）也可行，但可能增加背景信号。
7. 用约1 mL PBSTw洗涤性腺3次，每次洗涤孵育约5分钟，使过量的二抗充分扩散至洗涤液中。使用拉长的玻璃巴斯德吸管，在不扰动性腺的前提下尽可能吸除液体，残留体积不超过50 μL。
   注意：如有需要，此步骤后可将性腺保存在100 μL PBS中，但可能会减弱信号。继续实验前需去除PBS。

6. 进行 EdU 点击反应以检测 EdU

注意：根据所用抗体的不同，可在抗体染色步骤之前进行 EdU 点击反应（即在步骤 5 之前执行步骤 6）⁷但点击化学试剂可能会干扰某些抗原例如，REC-8 抗体对固定和透化处理敏感）。此处所述操作顺序可获得较强的免疫荧光信号，适用于 REC-8、WAPL-1、HIM-3、pH3、FLAG 和 CYE-1 抗体等多种抗体的染色。

1. 新鲜配制点击 EdU 混合液⁸，将以下组分依次加入一个洁净的 1.5 mL 离心管中。添加顺序至关重要。避光操作，并将所有试剂保持在冰上。此配方量可满足一个样品（100 μL）的使用需求；根据需要按比例放大。
   1. 向缓冲液添加剂中加入 2 mL 超纯水。此操作得到 10x 缓冲液添加剂，使用前需立即稀释至 1x。
   2. 将 8.5 μL 的 10x 缓冲液加入 76.5 μL 超纯水中。充分混匀。
   3. 加入 4 μL 的 100 mM CuSO₄（可能标记为组分 E）。充分混匀。
   4. 加入 0.25 μL 的 488 nm 叠氮染料。该染料需在室温下解冻，因其溶剂二甲基亚砜在 4 °C 下呈固态。充分混匀，并避光保存。
   5. 在管盖中将 9 μL 超纯水与 1 μL 缓冲液添加剂混合。用移液器从管盖中吸取后加入剩余的混合液中，通过反复吹打充分混匀。
2. 进行 EdU 点击反应。
   1. 向小管中的性腺组织加入约 100 μL 点击 EdU 混合液。用封口膜封口，室温孵育 30–60 分钟。
   2. 用 100 μL 反应洗涤缓冲液洗涤一次。
   3. 使用约 1 mL PBSTw 对性腺组织进行 4 次洗涤。每次洗涤孵育约 15 分钟，以使过量的 EdU 混合液组分充分扩散至洗涤液中。使用拉长的细口玻璃巴斯德移液管，在不扰动性腺组织的前提下尽可能吸除液体，残留液体不超过 50 μL。

7. 染色DNA并制备载玻片

1. 向性腺中加入1滴（约25 μL）含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，用于可视化DNA）的抗荧光淬灭封片剂。静置数分钟，使其沉降并与性腺充分混合。
   注意：也可使用PBS中1:1,000稀释的DAPI（来自0.1 mg/mL的储备液）孵育5分钟，随后加入20 μL的1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷（DABCO）溶于90%甘油的抗荧光淬灭封片剂，或其他抗荧光淬灭封片剂。
2. 在标准玻璃载玻片上制备一大块2.5%琼脂糖垫。
3. 使用一支新的、洁净无尘的长型玻璃巴斯德吸管将性腺转移至琼脂糖垫上。保持所有液体和性腺位于吸管的狭窄底部，以最大限度减少性腺损失。
   注意：粘附在小玻璃管或长型玻璃巴斯德吸管中的性腺可通过PBSTw冲洗“抢救”，将冲洗液收集至解剖皿中，再用睫毛挑取单个样本至载玻片上。
4. 使用粘附在牙签上的睫毛（或细发丝弯成的环）将性腺在琼脂糖垫上分散开，并去除灰尘颗粒。
5. 盖上矩形玻璃盖玻片。从一侧缓慢放下，避免产生气泡。用纸巾吸除多余液体，从而 防止盖玻片自由移动。
   注意：应选择与所用显微镜匹配的盖玻片。 #1和#1.5盖玻片效果良好。
6. 将载玻片在室温或4 °C下静置并略微干燥过夜。这有助于性腺轻微展平。载玻片应存放于4 °C。
7. 可选：用指甲油或其他载玻片密封剂封固载玻片边缘。先密封四角，再密封各边，可防止盖玻片移位。

8. 共聚焦成像与分析

1. 使用配备高能光源、平场复消色差物镜和高效率显微相机的转盘共聚焦荧光显微镜对远端性腺进行成像。以1 μm或更小的间隔采集z轴堆栈图像。记录所有通道的激光功率、灵敏度和曝光时间。
   1. 使用以下设置：DAPI采用405 nm激光激发，485 nm（W60）发射滤光片；EdU采用488 nm激光激发，527 nm（W55）发射滤光片；WAPL-1采用561 nm激光激发，615 nm（W70）发射滤光片；pH3采用640 nm激光激发，705 nm（W90）发射滤光片。
      注意：信号强度和背景强度会有所变化，所需的曝光时间也可能不同，差异可能高达10倍。
2. 使用Fiji^24,25中的Cell Counter插件²³手动计数每个细胞核。根据pH3、EdU和WAPL-1的存在与否对每个细胞核进行分类标注。使用表1和图2中描述的细胞核类型，以便进行下文所述的所有计算。
   注意：熟练的实验人员能够准确地在三维图像中计数所有细胞核，而不会重复计数或遗漏任何细胞核。或者，也可以在每个z平面中计数所有细胞核，并使用Marks-to-Cells R脚本³去除重复计数的细胞核。
3. 根据上述计数结果，依据所需细胞周期测量类型计算细胞数量和频率。细胞核类型定义见表1和图2。计算方法总结见表2。
   1. （变体I）为识别处于S期的细胞核，向动物喂食EdU持续30分钟。显示EdU标记的所有细胞核均为S期细胞核。计算时取A类和C类细胞核之和，见表1和图2。
      注意：在野生型成年雌雄同体动物中进行30分钟EdU脉冲标记时，所有EdU标记的细胞核均与前体区标志物共标记¹。
   2. 为测量前体区范围，使用REC-8或WAPL-1抗体等前体区标志物进行染色。此处将前体区定义为所有核质呈REC-8¹⁸或WAPL-1免疫反应阳性的生殖系细胞核。计算时将所有WAPL-1免疫反应阳性细胞核（A+B+C+D）相加，见表1和图2。
      注意：WAPL-1也会标记远端帽（DTC）和体细胞性腺细胞核，这些不应计入。体细胞核可通过极强的WAPL-1信号、位于生殖系略外侧的位置以及“煎蛋样”细胞核形态来轻易识别。
   3. 为测量S期指数，进行30分钟EdU实验并联合使用REC-8或WAPL-1抗体共标记。S期指数定义为前体区中处于S期的细胞核所占比例。计算方法为：计数所有S期细胞核，再除以前体区细胞核总数（A+C / A+B+C+D），见表1和图2。
   4. （变体II）为识别处于M期的细胞核，使用pH3抗体染色。所有pH3免疫反应阳性的细胞核均为M期细胞核。此方法不受EdU喂养时间长短的影响。计算时取A类和B类细胞核之和，见表1和图2。
      注意：WAPL-1也会标记远端帽（DTC）和体细胞性腺细胞核，这些不应计入。体细胞核可通过极强的WAPL-1信号、位于生殖系略外侧的位置以及“煎蛋样”细胞核形态来轻易识别。
   5. 为测量M期指数，联合使用pH3与REC-8或WAPL-1抗体进行共标记。M期指数定义为前体区中处于M期的细胞核所占比例。计算方法为：计数所有M期细胞核，再除以前体区细胞核总数（A+B / A+B+C+D），见表1和图2。
   6. （变体III）有丝分裂和减数分裂的S期细胞核均可被EdU标记。为区分这两个群体，需判断S期之后是进入有丝分裂还是减数分裂。为确定细胞核处于有丝分裂S期还是减数分裂S期，喂食EdU持续4小时，并通过抗体染色联合检测pH3（M期标志物）和HIM-3（减数分裂染色体轴蛋白）。将同时显示EdU和pH3信号的细胞核（A型，见表1和图2）记录为有丝分裂S期，将同时显示EdU和HIM-3信号的细胞核（E型，见表1和图2）记录为减数分裂S期。
   7. （变体IV）计算G2期持续时间。
      注意：G2期介于S期与M期之间。尽管目前尚未报道可在C. elegans生殖系中标记G2期的特异性标志物，但可通过整合多个实验数据来估算G2期持续时间，这些实验需标记M期（解剖时）和S期（解剖前数小时开始标记）。在实验过程中同时显示M期和S期标志物的细胞表明其已完成G2期；仅显示M期标志物而不显示S期标志物的细胞则表明其在实验期间未经历S期。
      1. 为计算G2期持续时间，喂食EdU持续2小时，并联合使用pH3抗体染色。仅分析pH3标记阳性的细胞核（即解剖时处于M期），检查其是否含有EdU信号（即在解剖前2小时EdU标记期间处于S期）。计算完成G2期的M期细胞核所占比例（A / A+B），见表1和图2。
      2. 重复该实验，分别使用3小时和4小时EdU标记（可选5小时标记）。以pH3阳性细胞核中EdU阳性细胞核的百分比为纵坐标，EdU标记持续时间为横坐标作图，如图3A所示。
      3. 通过连接图中各点并确定曲线穿过50%处的位置，计算G2期的中位持续时间，如图3A所示。
      4. 通过连接图中各点并确定曲线穿过99%处的位置，计算G2期的最大持续时间，如图3A所示。
   8. （变体V）计算G2+M+G1期总持续时间。
      注意：在C. elegans生殖系中，G1期异常短暂。尽管目前尚未报道可在C. elegans生殖系中标记G1期的特异性标志物，但可估算G2、M和G1期的总持续时间，并将该时间与上述G2期时间进行比较。G2+M+G1期的最大持续时间可根据在数小时EdU标记后仍保持EdU阴性（未经历S期）的前体区细胞核（WAPL-1免疫反应阳性）所占百分比进行估算。
      1. 为计算G2+M+G1期持续时间，喂食EdU持续2小时，并联合使用REC-8或WAPL-1抗体染色。确定在此期间经历S期的前体区细胞核所占比例（A+C / A+B+C+D），见表1和图2。
      2. 重复该实验，分别使用3小时和4小时EdU标记（可选5小时标记）。以REC-8或WAPL-1阳性细胞核中EdU阳性细胞核的百分比为纵坐标，EdU标记持续时间为横坐标作图，如图3B所示。
      3. 通过连接图中各点并确定曲线穿过99%处的位置，计算G2+M+G1期的最大持续时间，如图3B所示。
         注意：可通过一组包含2、3、4和5小时EdU标记的实验，联合使用兔抗WAPL-1和鼠抗pH3抗体共标记，同时完成G2期和G2+M+G1期持续时间的测定。
   9. （变体VI）为识别在前体区完成DNA复制但已进入减数分裂的细胞核，向动物喂食EdU持续10小时，并联合使用REC-8或WAPL-1抗体染色。显示EdU标记的细胞核表明其在该10小时内处于S期。不显示核质REC-8或WAPL-1染色的细胞核表明其已进入减数分裂。只需计数具有EdU标记但无前体区标志物标记的细胞核（E型，见表1）即可。
      注意：反之，若使用抗HIM-3抗体对性腺进行减数分裂前期标志物HIM-3染色，则应计数同时具有EdU标记和HIM-3阳性的细胞核数量。
   10. 为计算减数分裂进入速率，进行上述实验，分别使用5小时、10小时和15小时EdU标记。以进入减数分裂的细胞核数量为纵坐标，EdU标记持续时间为横坐标作图，如图3C所示。然后使用简单线性回归法，根据y=mx+b计算斜率（每小时进入减数分裂的细胞核数）。
       注意：必须使用线性回归法计算减数分裂进入速率。若仅将进入减数分裂的细胞核数量除以EdU标记持续时间是错误的，因为y轴截距不为零。
   11. （变体VII）测量减数分裂进程速率。
       注意：由于EdU共价掺入DNA，因此可用于追踪一群细胞在分化过程中的动态变化。在前体区经历S期的细胞在进入减数分裂、完成减数分裂及卵子发生过程中仍保留EdU标记。通过EdU脉冲-追踪实验可测量减数分裂进程速率。
       1. 向动物喂食含EdU的细菌持续4小时（“脉冲”阶段）。将动物转移至不含EdU的OP50细菌中培养48小时（“追踪”阶段），然后解剖并根据需要联合使用前体区标志物（如REC-8或WAPL-1）或减数分裂前期标志物（如HIM-3）进行染色。
       2. 成像时，寻找最靠近近端的EdU标记细胞核的位置。减数分裂进程速率为该最靠近近端的EdU标记细胞核在48小时追踪期间所移动的距离（以从前体区末端起算的细胞直径为单位）。

结果

由于DNA合成是掺入EdU所必需的，因此可以推断出EdU标记的细胞核在EdU标记的时间窗口内经历了S期。在30分钟EdU标记细菌喂养实验中标记的细胞核可被解释为在解剖时正处于S期的细胞核。在较长时间连续EdU喂养实验中标记的细胞核可能是在时间窗口早期被标记并已离开S期，也可能是在EdU标记时间窗口的后期阶段才被标记。EdU信号与DAPI信号共定位。在某些细胞核中，EdU信号覆盖所有染色体，而在其他细胞核中，EdU信号局限于1–2个明亮的点状区域（图4）。这些点状结构很可能是X染色体，其在S期晚期进行复制¹³。

在此，动物持续喂食 EdU 30 分钟后按上述方法及图5所示进行解剖。在图4中展示了一个年轻成年动物 EdU 染色成功的示例，以及一个年老成年动物 EdU 染色失败的示例（见下文）。30 分钟标记产...

讨论

制备EdU标记的细菌（步骤1）对于本实验方案至关重要，也是故障排查的首要环节。野生型年轻成虫雌雄同体在4小时EdU脉冲标记中可获得非常可靠的标记效果，因此可作为每一批新制备EdU标记细菌的有效对照。此外，完整进入肠道的EdU标记细菌（在老年线虫或某些咽部/研磨器功能缺陷突变体中）可通过点击化学反应进行标记，并在肠道中呈现为明亮的椭圆形点状结构。另一种标记雌雄同体的方法是采用高浓度（1 mM）EdU进行“浸泡”处理³。该方法在标记期间会使线虫处于饥饿状态，但在排查固定和点击化学反应问题时，可作为一种无需制备EdU标记细菌的有效替代方案。如果EdU“浸泡”实验成功而EdU喂养实验失败，则应重新制备新鲜的EdU标记细菌。为了在达到足够细菌密度的同时实现较高的EdU掺入量，可能需要调整EdU和胸腺嘧啶的浓度。

该技术在标记S期方面的主要局限在于需要向动物喂食带有EdU标记的细菌。由于基因型或发育阶段原因无法进食的动物，可能无法通过此技术进行标记。然而，核苷类似物目前仍是识别秀丽隐杆线虫（C. elegans）生殖系中处于S期...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E. coli MG1693	大肠杆菌遗传资源中心	6411	在标准未添加成分的LB培养基中生长良好
E. coli OP50	秀丽隐杆线虫遗传资源中心	OP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 成像试剂盒	赛默飞世尔科技	C10337
5-乙炔基-2′-脱氧尿苷	西格玛	900584-50MG	或使用试剂盒中提供的EdU
葡萄糖	西格玛	D9434-500G	D-(+)-右旋糖
硫胺素（维生素B1）	西格玛	T4625-5G	试剂级
胸苷	西格玛	T1895-1G	生物试剂
七水合硫酸镁	西格玛	M1880-1KG	MgSO4，试剂级
磷酸氢二钠，无水	菲舍尔	BP332-500G	Na2HPO4
磷酸二氢钾	西格玛	P5379-500G	KH2PO4
氯化铵	西格玛	A4514-500G	NH4Cl，试剂级+
细菌学琼脂	US Biological	C13071058
二水合氯化钙	西格玛	C3881-500G	CaCl
LB肉汤（Miller配方）	西格玛	L3522-1KG	使用浓度为25 g/L
左旋咪唑	西格玛	L9756-5G	0.241 g/10 ml
磷酸盐缓冲液	Calbiochem Omnipur	6506	自制PBS效果同样良好
吐温-20	西格玛	P1379-500ML
16% 电镜级多聚甲醛安瓿瓶	电子显微镜科学公司	15710	10 ml 安瓿瓶
100% 甲醇	赛默飞世尔科技	A454-1L	高品质甲醇对某些抗体获得良好形态至关重要
山羊血清	吉布科	16210-072	批号 1671330
兔抗WAPL-1抗体	Novus 生物公司	49300002	批号 G3048-179A02，使用稀释比例为1:2000
小鼠抗pH3单克隆抗体（克隆3H10）	密理博	05-806	批号#2680533，使用稀释比例为1:500
山羊抗兔IgG-Alexa Fluor 594标记二抗	英杰公司	A11012	批号 1256147，使用稀释比例为1:400
山羊抗小鼠IgG-Alexa Fluor 647标记二抗	英杰公司	A21236	批号 1511347，使用稀释比例为1:400
含4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的Vectashield抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1200	也可使用不含DAPI的封片剂，随后单独进行DAPI孵育
指甲油	Wet n Wild	DTC450B	任何透明指甲油均可使用
S培养基	多种来源		参见wormbook.org上的实验方案
M9缓冲液	多种来源		参见wormbook.org上的实验方案
M9琼脂	多种来源		配方与M9缓冲液相同，但添加1.7%琼脂
线虫生长培养基	多种来源		参见wormbook.org上的实验方案
解剖用表面皿	Carolina Biological	42300
Parafilm实验室封口膜	Pechiney Plastic Packaging	PM-996	4英寸宽实验室封口膜
培养皿			直径60 mm
长型玻璃巴斯德吸管
1 ml 离心管	MidSci Avant	2926
吸头
血清移液管
500 ml 锥形瓶
铝箔
25G 5/8” 针头	BD PrecisionGlide	305122
5 ml 玻璃离心管	Pyrex
1 ml 硼硅酸盐玻璃管
载玻片
22 × 40 mm 的1号盖玻片			1.5号盖玻片也可能适用
37 °C 摇床培养箱
台式离心机
临床离心机	IEC	428	配备6孔摆动转子
小型离心机
20 °C 培养箱
4 °C 冰箱
-20 °C 冰柜
Observer Z1 显微镜	蔡司
Plan Apo 63X 1.4 油镜物镜	蔡司
Ultraview Vox 转盘共聚焦系统	PerkinElmer		尼康转盘共聚焦系统效果也很好，详见：http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy