本文介绍了一种在新生大鼠初次摄入初乳的同时分离其脑核的实验方案。该技术可用于研究由肠上皮细胞信号调节的营养不足应激对大脑的影响。
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摘要
摘要
本实验方案的目的是在新生个体初次摄入初乳前后，分离大脑中富含催产素受体的脑核。通过蛋白质印迹法检测了已知对代谢应激有响应的蛋白质在分离出的脑核中的表达水平，以评估机体因营养不足引发的代谢应激是否触发了神经元应激。我们先前已证实，新生儿体内营养不足会在肠道中引起代谢应激。此外，初乳中的催产素可在新生大鼠初次进食前后调节肠道绒毛细胞的细胞应激反应、炎症及自噬标志物。本研究检测了与内质网应激相关的信号蛋白标志物［内质网分子伴侣结合免疫球蛋白蛋白（BiP）、真核翻译起始因子2A（eIF2a）以及eIF2a激酶——RNA依赖性蛋白激酶（p-PKR）］，以及两种炎症信号蛋白［核因子-κB（NF-κB）和抑制因子κB（IkB）］在新生大鼠脑核［孤束核（NTS）、室旁核（PVN）、视上核（SON）、皮层（CX）、纹状体核（STR）和内侧视前核（MPO）］中的表达水平，分别在首次进食前（未受初乳启动）和哺乳开始后（受初乳启动）进行检测。结果显示，在未受初乳启动的NTS组织中，BiP/GRP78和p-eIF2a表达上调，而在受初乳启动后则下调。NF-κB在CX、STR和MPO的细胞质中保持较高水平（持续存在），而在NTS、PVN和SON中，两种条件下NF-κB水平均较低且无变化。综合BiP和p-eIF2a的结果，提示存在应激反应。在SON、CX、STR和MPO中，eIF2a由双链RNA依赖性激酶（p-PKR）介导发生磷酸化；然而，在NTS（以及在较小程度上的PVN）中，eIF2a则由另一种激酶——通用控制非抑制性激酶2（GCN2）介导磷酸化。此前在新生个体肠道上皮细胞中观察到的应激调节机制，似乎在某些富含催产素受体（OTR）的大脑区域中也存在类似表现。NTS和PVN可能在营养缺乏条件下采用不同于其他脑区的磷酸化机制，并对营养不足的影响具有抵抗性。总体而言，这些数据表明，大脑对营养不足应激的反应可能被经初乳启动的肠上皮细胞发出的信号所抵消。
引言
与我们对产后数天至数周内大脑早期发育的理解相比，关于大鼠出生后最初数小时内发生的多种动态变化，目前所知甚少。一个主要挑战在于新生大鼠脑体积微小，且需要高技术手段才能分离出特定脑区或单个细胞。现有研究通常仅检测基因转录水平，而非翻译水平1,2，因此无法准确反映激活信号分子的功能水平。另一些研究采用免疫组织化学方法来定位脑区表达，但该方法无法对表达水平进行定量分析3。迄今为止，尚无研究探讨新生大鼠首次摄入初乳后在特定脑区中相关信号通路的激活情况，而此类研究需要快速完成脑组织分离、动物处死，并通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白表达及蛋白磷酸化水平。尽管脑微解剖技术已常用于年龄较大、体积更大的脑组织，但我们未发现任何文献报道在出生0天（P0）大鼠脑上实施非单细胞级别的脑组织打孔操作。本文介绍一种利用相对低技术含量的打孔法分离新生大鼠脑特定区域，并结合蛋白质印迹法检测小样本中蛋白表达的实验方案。该方案可能适用于需要评估任何物种小型脑组织中特定区域蛋白表达及翻译后修饰（e.g., 磷酸化）的研究问题，前提是操作者能够借助脑图谱和可识别的解剖标志在视觉上准确定位目标脑区。
该技术旨在研究新生大鼠首次摄入富含催产素（OT）的初乳后，其大脑所发生的变化。长期以来，人们已知OT具有促进乳汁....
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方案
本研究已获得哥伦比亚大学和纽约州精神病学研究所机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 组织制备
- 从供应商处订购配孕时间明确的大鼠。
- 在大鼠到达后的数周内，通过观察其腹部逐渐增大来跟踪配孕情况，并在预计分娩日每隔2小时检查笼子一次，以确认仔鼠出生。
- 在首次哺乳前（观察腹部无白色乳糜腹）或首次哺乳后（此时腹部可见白色胃区）用戴手套的手抓住仔鼠尾部将其取出，具体时间点参见时间线（图S1）。
注意：首次初乳喂养称为“启动”仔鼠，因此仔鼠在首次喂养前为未启动状态，喂养后则为初乳启动状态。 - 使用锋利、洁净的手术剪对未麻醉的仔鼠迅速进行断头处理。
- 沿颅骨中线及顶部表面剪开皮肤至鼻部以暴露脑组织，然后用镊子轻轻剥离颅骨，暴露大脑（图1A），定位前囟（bregma），并在去除骨板时用笔标记前囟位置（图1B）。
- 迅速将完整大脑置于室温下的聚甲基丙烯酸甲酯脑模中，用于在室温下进行冠状切片（图1C）。
- 立即使用新的剃刀刀片切割出500 μm厚的脑片，并将切片按头端至尾端顺序放置于培养皿中，以保持切片方向（
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结果
免疫反应性相对于总蛋白的代表性条带显示，某些脑核团收获的蛋白量极低。因此必须采用自动化Western印迹技术，该技术相较于传统的Western印迹具有更高的灵敏度。与传统Western印迹每泳道所需的蛋白量相比，该方法每个毛细管所需的蛋白量可减少至四十分之一。
初乳启动对脑核中 BiP 水平的差异性影响
在首次初乳喂养前（未致敏）和首次喂养后（致敏），采集大鼠脑组织的冠状切片。样品通过毛细管电泳（在WES上）进行分馏，并使用毛细管内总蛋白染色试剂盒对蛋白质进行定量（见方案）。在自动化Western系统上进行的额外免疫毛细管分馏可鉴定相应的蛋白质抗原。在图3A中，上方图显示了BiP蛋白表达的代表性结果，下方为对应的总蛋白。BiP是一种内质网分子伴侣蛋白。在
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讨论
本文介绍了一种用于显微解剖新生大鼠脑中离散且富含催产素受体（OTR）脑核团的技术。众所周知，即使在脑内已被充分表征的核团中，神经元也具有高度特化性。这种高度可重复的特异性富含OTR核团分离方法，能够实现可靠的假设检验。通过采用自动化Western印迹技术，进一步提高了结果的一致性和可重复性。尽管该技术仍存在一定程度的脑组织取样变异性的局限性，但相较于单细胞、全脑或脑切片方法，已有所改进。单细胞方法因仅能提供极为有限的瞬时信息而变得复杂；若使用全脑组织，当效应局限于特定脑区或神经元亚型时，任何发现都可能被稀释。在未进行显微解剖的情况下使用脑切片方法，可能在切片内仅数微米范围内就引入显著的结果变异性，这对于本研究中的下丘脑尤为不利，因其不同核团排列紧密。通过使用标准化的取样钻头并借助显微镜辅助，有效降低了蛋白质检测中的变异性。
本方案中有多个关键步骤，包括严格遵循首次喂养后组织采集的时间点、使用最小体积的蛋白质提取缓冲液、将脑切片在人工脑脊液（ACSF）中孵育以便使用分子抑制剂或激动剂，以及采用高灵敏度的免疫电泳装置。可能的改进包括选择不同的孵育试剂、调整孵育时间，以及延长未预处理的饥.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Manon Ranger 和 Alexandra Schulz 在准备本方案过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bradford 溶液 | Bio Rad | ||
| 蛋白裂解试剂盒 | Protein simple | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES 试剂盒 | Protein simple | WES-小鼠 12-230 主试剂盒 (PS-MK15)、WES-兔 12-230 主试剂盒 (PS-MK14)、WES 12-230 kDa 总蛋白主试剂盒 (PS-TP07) | |
| 抗小鼠 IgG HRP 偶联物 | Protein simple | ||
| 兔抗磷酸化 eIF2α | Cell Signaling Technology | SER51, 9721 | |
| 小鼠单克隆抗体抗 PKR | Cell Signaling Technology | 2103 | |
| 兔抗磷酸化 PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| 兔单克隆抗体抗 PKR | Cell Signaling Technology | 12297 | |
| 兔单克隆抗体抗 GAPDH | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 小鼠单克隆抗体抗磷酸化 IκB | Cell Signaling Technology | 9246 | |
| 小鼠单克隆抗体抗 IκB | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| 兔抗 BiP | Cell Signaling Technology | 3183 | |
| 兔抗 GCN2 | Cell Signaling Technology | 3302 | |
| 兔单克隆抗体抗磷酸化 GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| 妊娠 Sprague-Dawley 大鼠 | Charles River Laboratories | ||
| 打孔装置 | WellTech Rapid Core 或 Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
参考文献
- Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
- Okabe, A., et al.
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