离体成像小鼠膈肌三联突触中细胞特异性钙信号

摘要

本文介绍了一种在小鼠神经肌肉接头处对单个细胞类型的细胞群体进行钙信号成像的实验方案。

摘要

组织中细胞的电活动可通过电生理技术进行监测，但这些技术通常仅限于对单个细胞的分析。由于细胞质内钙离子（Ca²⁺）浓度的升高常常由电活动引起，或响应多种其他刺激而发生，因此可通过使用荧光钙敏感染料标记细胞并进行成像来监测这一过程。  然而，在完整组织中对特定细胞类型的此类响应进行成像较为困难，因为这些染料会被组织中的所有细胞类型摄取。相比之下，基因编码的钙指示剂（GECIs）可在特定细胞类型中表达，并在细胞内Ca²⁺浓度升高时产生荧光，从而允许对特定细胞类型的整个细胞群中的Ca²⁺信号进行成像。本文中，我们将GECIs GCaMP3/6应用于小鼠神经肌肉接头（NMJ），即运动神经元、骨骼肌和终末/突触周施万细胞之间的三元突触结构。我们展示了该技术在经典的ex vivo组织制备中的应用价值。通过使用光学分光器，我们实现了动态Ca²⁺信号与神经肌肉接头（NMJ）静态标记的双波长成像，该方法可轻松扩展用于同时监测两种细胞特异性的GECI或基因编码的电压指示剂（GEVI）。最后，我们讨论了用于获取荧光强度空间图谱的成像流程。综上所述，这些光学、转基因及分析技术可被广泛应用于多种情境下研究NMJ处不同细胞亚群的生物学活动。

引言

神经肌肉接头（NMJ）与所有突触一样，由三个部分组成：源自神经元的突触前终末、突触后神经元/效应细胞，以及突触周胶质细胞^1,2。尽管突触传递的基本特征最初是在该突触上得到证实的³，但这一过程的许多方面仍不明确，部分原因在于该突触的不同细胞组分表达相同的分子。例如，在脊椎动物NMJ处，运动神经元共同释放嘌呤类腺苷三磷酸（ATP）和乙酰胆碱（ACh），而肌肉细胞、施万细胞和运动神经元均表达这两种物质的受体，这使得对这些物质所引发的任何功能效应（例如，递质释放或反应、肌肉力量产生）的解释变得复杂⁴。此外，尽管与中枢神经系统中通常具有多个突触输入的神经元相比，NMJ的三部分结构相对简单，但目前尚不清楚运动神经元、肌细胞或施万细胞对刺激的反应是否因其内在异质性（例如，胚胎起源、纤维亚型、形态）而存在差异。为解决上述问题，理想的方法是能够同时追踪同一突触组分内多个细胞的反应，并在同一时间追踪其他两个独立组分中任一组分的此类反应。传统的使用化学染料检测钙信号的方法无法实现这两个目标，因为灌流施加的染料在应用于组织后会被多种细胞类型摄取，而细胞内加载的染料仅可用于观察单个或少量细胞群体。本文通过利用表达基因编码钙离子指示剂（GECIs）的转基因小鼠，结合特定的成像技术和软件工具

方案

动物饲养和实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》以及内华达大学动物照护与使用委员会（IACUC）的规定进行。

1. 转基因小鼠膈肌和膈神经的制备

1. 购买转基因小鼠及用于基因分型的寡核苷酸引物。
   注意：每种小鼠的引物均列在其对应的“信息”页面上。
   1. 培育一只3至6月龄的小鼠，该小鼠表达一份适当的转基因/基因敲入型Cre驱动等位基因，且不表达任何拷贝的条件性等位基因 GCaMP3/6 与同龄的另一只表达一个或两个拷贝条件性等位基因的小鼠杂交 GCaMP3/6 等位基因且不含Cre驱动等位基因的零拷贝。
   2. 对幼鼠进行基因型鉴定，并标记出同时携带Cre和条件性GCaMP3/6等位基因的个体——这些小鼠此后称为双转基因小鼠（例如, Myf5-Cre, 条件性 GCaMP3⁶.
      注意：通过这种方法，所有数据将来源于同时携带一份 Cre 基因和一份条件性 GCaMP3/6 等位基因的小鼠。当引入其他突变小鼠时，这一点尤为重要。例如，敲除）引入这些杂交中。
2. 当双转基因小鼠达到适当年龄时（例如出生后第0天或第5天（P0或P5）或成年小鼠，使用剪刀断头处死（适用于P10....

结果

通过细胞内 Ca²⁺ 浓度升高介导的荧光强度变化的多个实例，展示了该方法在神经肌肉接头（NMJ）特定细胞类型中的应用价值。这些结果以空间荧光强度图的形式呈现，不仅可显示响应细胞的位置，还能反映其响应强度，从而评估有多少细胞对特定刺激产生反应以及每个细胞的反应程度。例如，如图1所示，我们记录了出生后第7天（P7）Wnt1-Cre; 条件性表达GCaMP3 小鼠膈肌神经肌肉接头处终末/突触周施万细胞（TPSCs）群体在膈神经刺激下的 Ca²⁺ 反应，并利用空间荧光强度图鉴定了响应细胞的亚群。这些荧光强度图以热图形式呈现，并依据“火焰”颜色查找表（Fire CLUT）进行颜色编码。我们在分割图像以同时观察膈肌中部经α-BTX标记的乙酰胆碱受体（AChRs）簇的情况下和未分割图像的情况下均进行了视频记录（视频1 和 视频2），该方法可轻松改进用于同时捕获两种不同细胞类型的动态.......

讨论

本文提供了利用表达GECI的小鼠在完整神经肌肉组织中特定细胞内测量Ca²⁺反应的一些示例。为了成功实施这些实验，解剖过程中必须避免损伤膈神经。在施万细胞中以低倍或高倍（即，20X或60X）成像Ca²⁺反应时，必须使用BHC或µ-芋螺毒素来抑制组织运动。在低倍镜下对肌细胞的Ca²⁺反应进行成像时，可在不使用上述药物的情况下进行测量，从而能够在高频神经刺激期间同时获取肌细胞Ca²⁺瞬时信号强度和肌肉长度变化⁶。当在同一标本上进行多个实验时，每次实验之间必须间隔至少15分钟，在此期间可对组织进行灌流。这些步骤使得在同一标本的同一视野中，至少在3至5小时内可重复成像刺激诱导的Ca²⁺反应。此外，对于溶解于DMSO中的药物，必须按照BHC的处理方法预先稀释，因为将DMSO直接施加到表达GCaMP的组织上会引发不可逆的、与刺激无关的荧光反应。

我们发现，原因尚不明确，Wnt1-Cre; cond.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Myf5-Cre 小鼠	Jax	#007893	可在 E13 时期即驱动肌细胞表达6
Wnt1-Cre 小鼠	Jax	#003829	在 E13 时期驱动所有 施万细胞的表达，但在 P20 时期无此作用9
Sox10-Cre 小鼠	Jax	#025807	在较年长的小鼠中驱动施万细胞表达
条件性 GCaMP3 小鼠	Jax	#029043	以细胞特异性方式表达 GCaMP3
条件性 GCaMP6f 小鼠	Jax	#024105	以细胞特异性方式表达 GCaMP6f
BHC（3-(N-丁基乙亚胺酰基)-4-羟基-2H-香豆素-2-酮）	Hit2Lead	#5102862	可阻断骨骼肌肌球蛋白，但不影响神经传递6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	标记神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体簇
µ-芋螺毒素 GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	阻断 Nav1.4 电压依赖性钠通道8
硅胶介电凝胶；又称 Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	可通过细针将膈肌固定于其上
细针（0.1 mm 直径）	Fine Science Tools	26002-10	将膈肌固定在硅胶介电凝胶上
Eclipse FN1 直立显微镜	Nikon	MBA74100	用于样本的定位与观察
带手动 XY 显微镜位移器的基本固定显微镜平台	Autom8	MXMScr	实现样本的移动
手动显微操作器	Narishige	M-152	用于固定记录电极和刺激电极
微电极放大器	Molecular Devices	Axoclamp 900A	实现尖锐电极的细胞内电生理记录
微电极低噪声数据采集系统	Molecular Devices	Digidata 1550	实现电生理数据的采集
微电极数据分析系统	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	进行电生理数据分析
方波刺激器	Grass	S48	刺激神经以兴奋肌肉
刺激隔离单元	Grass	PSIU6	降低 刺激伪迹
硼硅酸盐毛细管，外径 1.0 mm，内径 0.5 mm	Sutter	FG-GBF100-50-15	用于刺入并记录神经诱发的肌肉电位
硼硅酸盐毛细管，外径 1.5 mm，内径 1.17 mm	Sutter	BF150-117-15	经拉长后用作吸吮电极
微电极拉制仪	Sutter	P-97	拉制并制备记录电极
1200×1200 像素背照式 cMOS 相机	Photometrics	Prime 95b	高灵敏度相机，支持高分辨率、高速成像
光源	Lumencor	Spectra X	提供 LED 照明，用于荧光观察
无限远校正荧光浸水物镜，工作距离 2 mm	Nikon	CFI60	提供较长工作距离，便于样本观察
带卤素灯的光纤照明器	Sumita	LS-DWL-N	提供明场观察所需的照明
W-View Gemini 图像分光器	Hamamatsu	A12801-01	通过二向色镜将一对双波长图像投射至单个相机
单波段带通滤光片 （512/25-25 和 630/92-25）	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	支持双波段成像
560 nm 单边二向色分光镜	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	作为二向色镜，分离光束以实现双波长成像
成像数据采集系统	Nikon	NIS Elements - MQS31000	实现成像数据的采集
波长控制模块	Nikon	MQS41220	用于成像数据采集的模块
发射光分光硬件模块	Nikon	MQS41410	用于成像数据采集的模块
成像数据分析系统	NA	Volumetry 8D5, Fiji	用于分析荧光强度及其他成像数据