本文介绍一种基于荧光的高通量检测方法，通过活细胞的荧光定量和成像分析来测定质膜修复效率。该方法可用于筛选调控哺乳动物细胞质膜修复的药物或靶基因。
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本文内容
摘要
摘要
在生理环境中，哺乳动物细胞常受到机械和生化应激，导致质膜损伤。针对这些损伤，复杂的分子机制会迅速重新封闭质膜，以恢复其屏障功能并维持细胞存活。尽管该领域已有60年的研究历史，我们对细胞膜修复机制仍缺乏全面理解。为了鉴定调控质膜修复的细胞组分或可增强修复能力的药物，我们开发了一种基于荧光的高通量检测方法，用于测定培养于微孔板中的哺乳动物细胞的质膜修复效率。作为质膜损伤的模型系统，细胞暴露于细菌来源的成孔毒素——单核细胞增生李斯特菌溶血素O（listeriolysin O, LLO），该毒素可在含胆固醇的膜上形成直径约30–50 nm的大蛋白孔。利用温度可控的多功能微孔板读板仪，可对活细胞进行快速、灵敏的光谱荧光检测，并同步获取明场和荧光显微图像。通过分析膜不通透性核酸结合荧光染料所发射荧光强度的动力学变化，可反映细胞群体水平上的膜损伤与修复程度，从而计算细胞修复效率。荧光显微成像可用于计数每个微孔中稳定表达核蛋白组蛋白2B（histone 2B）荧光融合蛋白的细胞，以校正细胞数量可能存在的差异，并可最终识别不同的细胞亚群。该高通量检测方法是一种强大工具，有望通过筛选调控质膜修复的宿主基因或外源添加化合物，进一步拓展我们对膜修复机制的理解。
引言
哺乳动物细胞会受到机械、渗透和生化应激的影响，导致细胞质膜完整性丧失。若不能迅速而有效地重新封闭，受损细胞将很快发生程序性死亡或坏死性死亡。自20世纪60年代以来，由于质膜修复功能障碍可导致严重后果，人们对质膜修复过程的理解不断深入。事实上，肢带型肌营养不良症、糖尿病和Chediak-Higashi综合征等疾病分别与编码dysferlin的基因突变、晚期糖基化终末产物的积累以及溶酶体转运调节因子CHS1缺陷导致的质膜修复功能缺陷相关1,2,3,4,5,6。然而，迄今为止，我们对质膜修复机制的理解仍然有限7。早期研究表明，质膜修复由细胞外Ca2+通过受损质膜内流所启动8,9,10。此后，已有数种非互斥的Ca2+依赖性机制被提出以解释细胞修复过程。其中“膜片假说”认为，....
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方案
1. 准备
- 细胞铺板
注意：本方案中使用了人宫颈上皮细胞、HeLa 细胞以及表达组蛋白 2B-GFP（H2B-GFP）的 HeLa 细胞，但该检测方法可适用于其他哺乳动物细胞19。- 用 2 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 洗涤细胞，使贴壁细胞从 75 cm2 的细胞培养瓶中脱离。将用过的胰蛋白酶弃去，再加入 2 mL 新鲜的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
- 在 37 ˚C 下孵育 5 分钟，直至细胞变圆并从培养瓶壁脱落。
- 用 8 mL 生长培养基（含 10% 热灭活胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM）重悬细胞。
- 使用血细胞计数板和 10 µL 细胞悬液测定细胞浓度。
- 用生长培养基将细胞稀释至 2.5 × 105 个细胞/mL。
- 将细胞悬液倒入无菌移液管接水槽中，并用 10 mL 移液管充分混匀。
- 使用 12 通道移液器和 200 µL 吸头，将 HeLa 细胞（每孔 100 µL 含 2.5 × 104 个细胞）以三复孔（或四复孔）形式加入 96 孔平底、透明底、黑色聚苯乙烯组织培养处理板中。
注意：图 1 中展....
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结果
细胞计数准确性：HeLa 细胞常被用作研究膜修复机制的模式哺乳动物细胞系。在对细胞群体水平的膜修复能力进行评估时，为确保数据解读的准确性，必须在所有孔中以相同浓度接种细胞。此外，在检测时验证各孔之间的细胞数量相等也至关重要。本实验引入了稳定表达组蛋白 2B 与绿色荧光蛋白融合蛋白（H2B-GFP）的 HeLa 细胞，通过检测其荧光细胞核实现细胞数量的自动统计。为建立细胞计数的准确性，将 HeLa H2B-GFP 细胞进行两倍系列稀释后，以每组三个复孔的形式接种于 96 孔板中，并培养 4 小时。该时间足以使细胞贴壁，同时细胞分裂极少。使用透射光（TL）和 GFP 荧光照明对整块板的各孔成像，并利用酶标仪分析软件基于 GFP 荧光进行细胞计数（图 2A 和 2B）。将各孔平均细胞计数 ± 标准差对细胞接种浓度作图，最佳拟合直线显示细胞计数与接种细胞数之比为 1.08:1，证明了该计数方法的准确性（图 2C）。通过在动力学实.......
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讨论
该实验通过高通量方式在细胞群体水平上测量细胞膜修复的效率，可用于筛选影响细胞膜修复的细胞组分或药物文库。所述实验采用96孔板格式，但也可适配为384孔板以实现更高通量。该实验的一个优势在于能够对贴壁活细胞进行实时荧光检测，无需进行细胞消化、固定或固定后荧光标记等繁琐的细胞处理步骤。多功能酶标仪（如本方案中所使用的仪器）具有足够的灵敏度，可在低至30秒的时间间隔内对96孔板进行快速荧光光谱检测。荧光图像的采集可提供额外信息，包括细胞计数、细胞形态的潜在变化以及不同细胞群体的可能识别。本实验方法不能揭示单个细胞水平上细胞膜修复的动力学过程，但可鉴定出能够以正面或负面方式影响细胞群体水平膜修复过程的实验条件（如药理学化合物或细胞组分）。
已开发出多种其他实验方法用于评估膜修复机制。例如，通过微针穿刺、微珠摩擦和激光消融等机械性损伤手段已被用于模拟机械性膜损伤。对损伤/修复的检测通常采用荧光显微镜或流式细胞术，通过定量荧光探针（FM 1-43、碘化丙啶、荧光素偶联葡聚糖）的进入，或追踪荧光蛋白嵌合体47,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢俄亥俄州立大学的Jesse Kwiek博士慷慨允许我们使用其多功能检测平台进行部分初步实验。本文报道的研究工作由美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，项目编号为RO1AI107250，授予Stephanie Seveau。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪 | Molecular Devices | i3x | |
| MiniMax 300 成像细胞仪 | Molecular Devices | 5024062 | |
| TO-PRO-3 | 赛默飞世尔科技 | T3605 | |
| 碘化丙啶 | 赛默飞世尔科技 | P3566 | |
| HeLa | ATCC | CCL2 | |
| HeLa H2B-GFP | 默克密理博 | SCC117 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 康宁96孔平底黑色聚苯乙烯组织培养处理板 | 康宁 | 3603 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| EGTA | ISC BioExpress | 0732-100G | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-(+)-葡萄糖，HybriMax | Sigma-Aldrich | G5146-1KG |
参考文献
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Current Topics in Membranes. 77, 67-96 (2016).
- Howard, A. C., McNeil, A. K., McNeil, P. L. Promotion of plasma membrane repair by vitamin E. Nature Communications. 2, 597(2011).
- Howa....
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