方法文章

通过确认小鼠和大鼠青春期启动及进行生育力检测来评估生殖能力

DOI：

10.3791/58352

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2018年10月13日

1Department of Animal Science, Michigan State University

本文内容

摘要

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许多治疗方法和基因突变会影响性成熟和生育能力的时间。本方案描述了一种非侵入性方法，用于在性成熟动物中开展生育力研究之前，评估小鼠和大鼠的青春期起始时间。

摘要

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评估生殖能力对于理解某种处理或基因操作对生殖轴（也称为下丘脑-垂体-性腺轴）的影响至关重要。生殖轴是整合环境和内部信号以将生育力调节至适宜繁殖条件的关键系统。在开展小鼠和大鼠的生育力研究之前，需评估其性成熟状态，以排除所观察到的生殖表型是由青春期启动延迟或缺失所致的可能性。本方案描述了一种非侵入性方法，通过包皮分离的确定来评估雄性动物青春期的启动，通过阴道开口和首次动情期来评估雌性动物青春期的启动。在确认青春期已完成并达到性成熟后，即可开始生育力研究。该操作流程介绍了小鼠和大鼠最佳的繁殖条件、如何建立生育力研究实验，以及应评估哪些参数，以确定处理因素或基因敲除是否对生育力产生影响。

引言

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青春期的过渡是达到性成熟和生殖能力所必需的过程。青春期的转变以及成年期生育能力的维持由生殖轴调控，该轴也称为下丘脑-垂体-性腺轴（图1）。青春期启动时间及生育能力的维持受到内在因素和环境因素的严格调控，以提高子代和亲代的生存机会1,2。本方案提供了一种非侵入性方法，用于确定小鼠和大鼠青春期的启动，以便在开展评估生殖能力的生育研究之前确认其性成熟状态。

在性成熟动物中进行生育力研究，且可在动物经历青春期后开始。在青春期开始之前，生殖轴处于静止状态，而驱动性成熟的關鍵激素——促性腺激素释放激素（GnRH）——向垂体的释放量不足以启动青春期（图1）。青春期的启动是一个复杂的过程，其结果是在正中隆起处GnRH的释放增加。GnRH促进垂体分泌黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），这两种激素对性腺的成熟和生殖功能至关重要（图1）3,4,5。

生殖轴受损....

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方案

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本文所述所有方法均经密歇根州立大学机构动物护理与使用委员会批准，并依照《实验动物护理与使用指南》进行操作。

1. 确定青春期起始

  1. 遵循机构关于着装的规定，至少必须穿戴洁净的实验服和洁净的手套。始终佩戴洁净手套操作小鼠。
  2. 通过在桌面上放置垫子来准备操作区域。
    1. 将一个洁净的小鼠笼盖网格面朝上放置在垫子上。
    2. 在操作区域设置一台天平。将一个洁净的 500–1000 mL 烧杯放在天平上并归零。
    3. 在操作区域旁放置一张记录表，用于记录体重以及包皮分离、阴道开口或首次动情期情况。
  3. 确定参与研究的小鼠个体。每日检查青春期启动情况，直至达到青春期。在整个研究过程中，每天应在相同时间进行检查。青春期启动最早可发生在出生后第 11–12 天19，但在大多数实验设置中，青春期启动的监测通常从约 22 日龄开始。
  4. 将小鼠笼子置于操作区域（步骤 1.2）。打开笼子，将笼盖、水瓶和食槽放在桌面上。
  5. 确定雄性小鼠的包皮分离情况。
    1. 抓住小鼠尾巴，将其放置在步骤 1.2.1 中准备好的洁净笼盖上。轻轻握住尾巴，让小鼠在笼盖网格上自由探索约 5 秒。
    2. 轻轻向后拉尾巴，通常会使动物前移并用前肢抓住网格。将另一只手靠近其颈部和耳....

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结果

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所展示的结果来自两种不同的转基因小鼠模型，其中转录因子腹侧前部同源框1（Vax1）在一个等位基因上全身性敲除，此处称为杂合子小鼠（HET）13，或Vax1在促性腺激素释放激素（GnRH）神经元中条件性敲除22，此处称为条件性敲除（cKO）。在开展生育力研究之前，确认所有小鼠的青春期启动至关重要。

首先，确定阴道开口和包皮分离的时间及体重。在 HET 小鼠中，阴道开口和包皮分离的发生时间与对照组小鼠相同，体重也相似（图 3A 和 F）。相比之下，cKO 雌性和雄性小鼠的阴道开口和包皮分离显著延迟，并伴随体重增加（图 3B 和 G）。青春期启.......

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讨论

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小鼠的整体健康状况对于成功进行生育力检测至关重要21。在进行生育力检测时，应避免每天对小鼠进行直接的身体检查，因为这可能会引起应激反应。同时应避免频繁更换笼具，因为这同样会造成应激。理想情况下，每周更换笼具不应超过1-2次。在黑暗阶段暴露于光照会负面影响夜行性啮齿动物的繁殖行为。在黑暗时段内不得打开繁殖室的照明灯。如果必须在黑暗时段进入房间，请使用微弱的红光照明。另一个应激源是动物房在研究期间全部或部分时间内存在过强的气味、振动或噪音。为减轻应激、改善小鼠福利和繁殖表现，可为小鼠提供筑巢材料或其他类型的环境丰富化物品。筑巢是小鼠的重要行为，有助于提高繁殖成功率。巢穴还可为小鼠提供藏身和玩耍的空间。健康且营养充足的动物繁殖能力良好，因此必须提供高质量的食物和饮水，并保证自由摄取（ad libitum）。如果繁殖配对的小鼠开始出现疾病症状，例如皮炎（在C57BL/6J小鼠中较为常见）、牙齿咬合不正或其他病症，应将这些小鼠排除出研究。此外，若研究使用免疫缺陷小鼠，则保持小鼠饲养室的清洁对维持其生育力尤为关键。

为了恰当地开.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢为本出版物奠定基础的初始研究工作做出贡献的作者们。感谢 Aitor Aguirre、Genevieve E. Ryan 和 Erica L. Schoeller 在手稿准备过程中提供的帮助。感谢 Jessica Sora Lee 和 Austin Chin 在手稿技术方面提供的协助。H.M.H. 的研究得到了尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health）的支持。 & 美国国立卫生研究院人类发展研究所，资助编号 R00HD084759。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无菌棉球Fisher22456885
表面保护剂Fisher1420637
光度计VWR21800-014
亚甲蓝 Sigma-AldrichM9140
显微镜载玻片Genesee Scientific29-101
Optimouse 笼架及笼盒动物护理系统C89100
水瓶篮 动物护理系统C61011
过滤笼盖动物护理系统C78210
优化标准饲养层动物护理系统C40100SG
笼卡架动物护理系统C43251
笼位卡动物护理系统M52010
瓶组件动物护理系统C79122P
Bed R'Nest 巢穴The AndersonsBRN4WSR
1/8" 玉米芯垫料 安德森斯8B
标准小鼠饲料Teklad7904 (7004)
量程VWR10205-004
聚丙烯烧杯Fisher14-955-111F

参考文献

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  1. Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
  2. Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2....

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