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方法文章

利用双光子活体显微镜成像流感病毒感染期间气管黏膜中的细胞相互作用

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DOI：

10.3791/58355

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2018年8月17日

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究中，我们介绍了一种在流感病毒感染后对小鼠气管黏膜进行双光子活体成像及细胞相互作用分析的实验方案。该方案对于研究呼吸道感染过程中免疫细胞动态变化的研究人员具有重要意义。

摘要

细胞间或细胞与病原体相互作用的分析 体内 是理解免疫应答动态变化的重要工具。双光子活体显微成像技术（2P-IVM）能够在活体动物深层组织中观察细胞间的相互作用，同时最大限度减少图像采集过程中产生的光漂白效应。迄今为止，已有多种针对淋巴器官和非淋巴器官的2P-IVM模型被报道。然而，由于动物呼吸周期引起的运动干扰，呼吸器官的成像仍然面临挑战。

在此，我们介绍一种用于可视化的实验方案 体内 利用双光子活体显微镜（2P-IVM）研究流感病毒感染小鼠气管中的免疫细胞相互作用。为此，我们建立了一套定制的成像平台，包括气管的外科暴露与插管，随后对黏膜上皮中的中性粒细胞和树突状细胞（DC）进行动态成像。此外，我们详细描述了流感病毒鼻内感染的操作步骤以及气管免疫细胞的流式细胞术分析方法。最后，我们分析了在视频记录过程中中性粒细胞与DC的运动行为及其相互作用。本方案可获得稳定且高亮度的四维图像，适用于评估气管内细胞间的相互作用。

引言

双光子活体显微技术（2P-IVM）是一种用于实时成像细胞间相互作用的有效方法，可在细胞所处的自然环境中直接观察其动态过程1。该方法的主要优势之一在于，与其他传统成像技术相比，它能够对更深层的组织样本（500 µm 至 1 mm）进行观测2。同时，双光子激光产生的两个低能量光子可最大限度地减少成像过程中通常伴随发生的组织光损伤2。在过去十年中，2P-IVM 已被应用于多个研究领域，以探索不同类型的细胞间相互作用3,4,5。这些研究在免疫细胞的观察中尤为关键，因为免疫细胞具有高度动态性，并会根据其他细胞及环境信号迅速形成显著的细胞接触。此外，2P-IVM 也被用于研究病原体与宿主之间的相互作用6。已有研究证实，某些病原体能够改变免疫细胞之间接触的类型和持续时间，从而干扰免疫应答7。

气道黏膜是针对空气传播病原体产生免疫反应的初始部位8。因此，对该组织中病原体与宿主相互作用进行体内分析，对于理解感染过程中宿主防御机制的启动至关重要。然而，气道的双光子活体显微成像（2P-IVM）具有较大挑战性，主要原因是动物呼吸周期所引起的成像伪影，会影响图像采集过程。近年来，已有多种手术模型被用于小鼠气管9,10,11,12和肺组织13,14,15,16的成像研究。气管2P-IVM模型是观察上呼吸道免疫反应初期阶段的理想体系，而肺泡2P-IVM模型则更适用于研究感染的后期阶段。已建立的肺部成像模型存在一个局限性，即充满空气的肺泡会限制激光的光学穿透深度，导致肺内气道的黏膜层无法进行体内成像17。相比之下，气管由连续的上皮构成，其结构更有利于图像采集。

本文介绍了一种实验方案，详细描述了进行流感病毒感染、动物手术准备以及气管双光子活体成像（2P-IVM）所需的各个步骤。此外，我们还描述了一种特定的实验设置，用于可视化中性粒细胞和树突状细胞（DC）——这两种免疫细胞在介导抗流感病毒防御机制中发挥着重要作用18,19。最后，我们介绍了一种分析中性粒细胞与DC相互作用的方法。研究表明，这些细胞间的接触能够调节DC的活化，进而影响机体对病原体的免疫应答20。

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方案

所有涉及小鼠的动物实验均按照瑞士联邦兽医办公室的指南进行，并已获得当地兽医主管部门批准的动物实验方案。

1. CD11c-YFP 小鼠的流感病毒感染

  1. 生物安全
    注意：甲型流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 H1N1（PR8）的小鼠适应株在受精卵中增殖，经纯化和滴定，方法如前所述21所有涉及感染动物或生物样本的操作均在生物安全二级（BSL-2）条件下于生物安全柜中进行。
    1. 在感染操作前后，使用70%乙醇溶液清洁生物安全柜。
    2. 按照世界卫生组织（WHO）生物安全指南的规范处理本实验过程中产生的所有废弃物（http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf）。固体废弃物应弃置于可高压灭菌的垃圾桶中，被污染的液体应弃置于盛有70%乙醇溶液或医用消毒剂的塑料袋中。
  2. 流感鼻腔感染
    注意：B6.Cg-Tg(Itgax-Venus)1Mnz/J（CD11c-YFP）22 在本研究中使用了C57BL/6J背景的小鼠。小鼠饲养于生物医学研究所的无特定病原体设施中。
    1. 每笼最多放置5只年龄和性别相匹配的CD11c-YFP小鼠（6至8周龄）。在感染操作前，需等待至少两天，使小鼠适应饲养环境。
    2. 解冻PR8病毒原液，使用预冷的不含氯化钙和氯化镁的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）进行相应稀释，以获得30 µL体积中含有200斑块形成单位（PFU）的终浓度。整个操作过程中将病毒稀释液置于冰上保存。
      注意： 建议在使用每批流感病毒前进行滴定，以确保感染剂量的准确性。
    3. 使用26 G针头的1 mL注射器，通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合剂量。
    4. 等待小鼠完全麻醉（翻正反射和足底回缩反射均完全消失）。深度麻醉对于获得理想的感染效果至关重要，因为未完全麻醉的小鼠可能会吞咽或排出病毒接种物，导致感染剂量不一致。
    5. 将麻醉后的小鼠置于仰卧位。收集15 µL病毒接种液。将移液器吸头靠近小鼠左侧鼻孔，逐滴加入病毒接种液。由于液滴需经小鼠吸入，切勿将液体直接注入鼻腔内。
    6. 等待2–5分钟，将含有剩余15 µL病毒接种物的移液器吸头置于右侧鼻孔中。
      注意：为避免窒息，应以大约20秒的间隔滴加小体积液滴。
    7. 检查小鼠呼吸是否正常，然后将其侧卧放入笼中 侧卧位监测小鼠呼吸及麻醉复苏情况（诱导后约60分钟）。
      注意：可以同时感染多只小鼠。在此情况下，依次向所有小鼠的左鼻孔给予病毒接种物，等待2–5分钟后，再向右鼻孔给予病毒。为避免个体间差异，同时感染的小鼠数量不应超过3只。
    8. 每日监测动物健康状况和体重变化。
    9. 根据主管部门指南确定的人道终点对小鼠实施安乐死。安乐死方法必须经动物实验管理机构批准，并遵守当地伦理法规。双光子实验结束后，通过注射过量的氯胺酮/赛拉嗪实施安乐死，随后进行颈椎脱位。其他所有实验均采用 CO2 吸入法作为一种安乐死方法。
      注意：为了测定感染气管中的病毒滴度，可按照先前所述方法进行50%组织培养感染剂量（TCID50）实验或实时聚合酶链式反应（RT-PCR）实验。23.
  3. 通过流式细胞术评估气管中中性粒细胞的募集
    注意：本部分实验步骤为可选内容，旨在评估流感病毒感染后气管黏膜中中性粒细胞的募集情况。
    1. 在感染后第3天（p.i.）通过CO₂处死感染小鼠和未感染的对照小鼠2 吸入
      注意：为防止气管损伤，避免使用颈椎脱位法对动物实施安乐死。此外，建议对已实施安乐死的小鼠进行灌注，以避免血液中性粒细胞的污染。
    2. 用70%乙醇溶液喷洒小鼠颈部，并使用手术剪从胸部向下巴做皮肤切口。
    3. 使用镊子分离唾液腺并暴露气管。
    4. 使用镊子和剪刀解剖气管周围的肌肉。
      注意：此步骤必须小心操作，因为气管在操作过程中容易受损。
    5. 用镊子夹住气管，通过解剖仔细分离食管。
    6. 用镊子夹住气管的胸腔内部分，在支气管树起始处做一切口。随后将气管从喉部分离，并仔细清除残留的肌肉组织。
    7. 将器官置于含有 RPMI 1640 + HEPES 培养基（RPMI）的 1.5 mL 离心管中，并置于冰上。
    8. 在RPMI中配制用于气管消化的酶混合液，包含0.26单位/毫升的胶原酶（I型和II型）以及0.2毫克/毫升的DNase I。
    9. 将解剖得到的气管置于含有1 mL酶混合液的6孔板中。
    10. 用镊子和剪刀将器官切成小块。此步骤中应将培养皿置于冰上。
    11. 37 °C 下孵育 45 分钟，期间每 15 分钟摇板一次。
    12. 通过加入1 mL FACS洗涤缓冲液（PBS中含2 mM EDTA和2%热灭活滤膜除菌的胎牛血清（FBS））终止酶消化反应。
    13. 用1 mL移液器重悬溶液，以帮助解离未完全消化的组织碎片。
    14. 将溶液通过40 µm滤网转移至另一孔中。然后，使用2 mL注射器推杆轻轻碾压滞留在滤网上方的组织残块。
      注意：在过滤器上碾碎部分未完全消化的气管组织是流式细胞术分析过程中获得足够数量细胞的关键步骤。
    15. 用FACS洗涤缓冲液清洗孔板和滤网，并将悬液转移至预置在冰上的5 mL离心管中。
    16. 将离心管在166 x g下离心 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100 µL FACS洗涤缓冲液中。
    17. 进行流式细胞术的抗体表面染色。简言之，使用抗CD16/32抗体阻断分离细胞的Fc受体，随后进行表面染色。为准确鉴定中性粒细胞，流式细胞术检测 panel 应包含以下抗体：αLy6G、αCD11b、αCD45，以及一种活率染料以排除死细胞。
    18. 将样品的全部内容上流式细胞仪运行并分析数据。
      1. 为获得最佳数量的免疫细胞，应以不超过 3,000 事件/秒的速度运行单细胞悬液。这将减少采集过程中被排除的事件数量。采用本方案，每根气管可获得 100 万至 200 万个细胞。

2. 中性粒细胞的分离与注射

注意：本实验中使用了 B6.129(ICR)-Tg(CAG-ECFP)CK6Nagy/J 小鼠（CK6-ECFP）24。这些动物在人源 β-肌动蛋白启动子驱动下，在所有细胞类型中表达 CFP。此外，也可使用 C57BL/6J 小鼠分离细胞，并按照步骤 2.6 中所述方案进行染色。中性粒细胞的纯化与操作可能会提高其活化状态，从而可能改变其迁移和功能特性。

  1. 通过吸入 CO2 处死动物。
  2. 取出双侧股骨和胫骨，并使用镊子轻轻清理。
  3. 剪除骨骺，用装有无菌冷 PBS 的 1 mL 注射器冲洗骨髓，收集至置于冰上的 50 mL 管中。
  4. 用 18 G 针头重悬细胞，并通过 40 μm 滤网过滤细胞悬液。在 4 °C 条件下，以 110 × g 离心 5 分钟，用 PBS 洗涤一次，然后将细胞重悬于 2 mL 冷 PBS 中。
  5. 将 100% Percoll 与 10× PBS 按 9:1 比例稀释，使用 1× PBS 配制 72%、64% 和 52% 的 Percoll 梯度溶液。在 15 mL 管中，从浓度最高的开始，小心地依次加入 2 mL 三种梯度溶液。
    1. 小心地将 2 mL 骨髓细胞悬液加至梯度液上方，在室温（RT）下以 1,100 × g 离心 30 分钟，不启用加速和刹车。
  6. 小心收集 64% 与 72% 之间的界面条带，在 4 °C 条件下用冷 PBS 以 200 × g 离心 5 分钟洗涤一次。将细胞重悬于 100 μL PBS 中，并置于冰上保存。中性粒细胞纯度应高于 90%。
  7. 可选步骤：根据试剂盒生产商的说明书，使用细胞增殖试剂盒对中性粒细胞进行标记。将染料加入细胞悬液中，终浓度为 10 μM，总体积为 1 mL，在 37 °C 孵育 30 分钟，然后洗涤（166 × g，5 分钟）。
  8. 使用血细胞计数板估算细胞浓度，并在成像前 12 小时，通过 26 G 针头和 1 mL 注射器，将 5 × 106 个细胞以不超过 100 μL 的体积静脉注射至先前感染的 CD11c-YFP+ 小鼠体内。

3. 准备用于成像的小鼠

  1. 麻醉
    1. 在感染后的第3天，按照步骤1.2.3对CD11c-YFP+小鼠进行麻醉。
    2. 当小鼠进入深度麻醉状态后，准备用于重复给药麻醉剂的导管。
      1. 使用镊子从注射器上取下30 G针头。
      2. 将该针头插入一段20 cm长的PE-10医用硅胶管中。
      3. 在管子的另一端连接一支装有氯胺酮/赛拉嗪混合液的30 G针头注射器。
      4. 排出管内的空气。
    3. 准备一个连接至氧气灌注机管道的20 G导管，以维持自动通气（图1Ai）。设置呼吸频率为每分钟130次（b.p.m.），潮气量为0.2 mL，使用100%氧气供气。
  2. 手术前准备小鼠
    1. 在整个手术过程中，将小鼠置于特制的定制手术板（图1Aii-iii）上，并放置于设定为37 °C的加热板或加热手术台上。
    2. 使用电动剃刀和脱毛膏去除小鼠颈部的毛发（图1Bi）。
    3. 将小鼠置于塑料体位固定装置上方（图1Aii-a），使动物头部位于固定装置之外（图1Bii），以形成有利于气管插管的角度。
    4. 用手术胶带固定前肢、脚掌和尾巴，用富含维生素A的凝胶湿润小鼠眼睛，并对小鼠颈部进行消毒（图1Bii）。
  3. 手术操作
    1. 准备好经过适当高压灭菌的器械，包括剪刀、显微外科剪和镊子。
    2. 在颈部中线稍偏长轴方向做一小切口，长度约1 cm，位置位于胸部上缘与下颌最低点连线之间的中段区域（图1Biii）。
    3. 将皮肤瓣和唾液腺向侧方推开，暴露被肌肉覆盖的气管，然后使用镊子小心分离气管周围的肌肉组织（图1Biii）。
    4. 使用导管对小鼠进行气管插管，并开始人工通气（图1Biv）。
      注：该导管由外部塑料部分和内部金属针组成，其中塑料部分可保护气管黏膜。金属针的存在有助于拉直并稳定气管，调节其暴露程度。通过导管进行的人工通气可确保小鼠正常呼吸。
    5. 立即开始人工通气以监测小鼠呼吸情况。
    6. 使用连接在手术板特定杆上的手术钩（图1Aii-b）固定导管的高度和方向（图1Bv），使气管暴露高度与下巴齐平。
    7. 用凡士林环绕气管，并滴加数滴预热的PBS覆盖，以保证器官的充分水合（图1Bvi）。
    8. 将盖玻片安装于制备物上方。此步骤中，先将盖玻片粘附于金属支架上（图1Bvii），再将支架旋紧至XYZ位移器（图1Aii-c）。调节XYZ位移器，使盖玻片准确置于手术区域上方。
    9. 放置用于腹腔内给予麻醉剂的导管（图1Bviii）。
    10. 每30分钟注射初始剂量氯胺酮/赛拉嗪混合液的50%。
      注：每隔30分钟追加初始剂量的50%至25%是一种安全且有效的替代方案25。然而，由于本实验为终末性操作，且整个过程中需严格保持动物不动，因此建议使用较高剂量以维持深度外科麻醉水平。

4. 体内 延时成像

注意：图像采集使用配备两个钛宝石激光器、温度控制培养室和25倍/数值孔径1.1水浸物镜的直立式双光子显微镜进行。用于图像采集的光电倍增管（PMT）为混合型探测器或高灵敏度GaAsP探测器。

  1. 将麻醉后的小鼠置于显微镜培养箱（预热至 37–38 °C）内的手术板上，并在盖玻片上加一滴水。
  2. 对准气管组织并找到焦点。
  3. 设置扫描频率为 800 Hz，分辨率为 520 × 520 像素，视野为 440 × 440 μm2，线平均为 1。
    1. 调节钛蓝宝石激光器至 830 nm，以激发胶原蛋白的二次谐波（SHG），光源输出功率约为 150 mW；将第二台钛蓝宝石激光器调至 920 nm，光源输出功率为 94 mW，用于同时激发 CFP 和 YFP。
    2. 设置三维及时间序列采集模式，并进行同步激发
      注：保持激光功率尽可能低，以最小化光漂白和光毒性。
  4. 使用非去扫描模式下的两个通道进行荧光采集，主二向色镜设置为 560 nm。在本方案所用的系统中，第二个二向色镜在 495 nm 处分光，将信号分离至通道 1（发射滤光片 475/50）和通道 2（发射滤光片 525/50）（图 2A）。该配置在通道 1 中收集来自胶原蛋白的 SHG 信号，CFP 发射信号同时在通道 1 和通道 2 中收集，而 YFP 信号仅在通道 2 中收集。
  5. 沿 Z 轴定义 50 μm 的扫描范围，步长为 3 μm（体素尺寸为 0.86 μm × 3 μm）。每 30 秒记录一次图像，总时长为 30 分钟。
  6. 如需要，可采集多个区域。在开始下一轮采集前，检查动物生命体征，并根据需要通过导管追加麻醉剂（见步骤 3.3.10）。
  7. 成像过程结束后，通过过量注射氯胺酮/赛拉嗪实施安乐死，随后进行颈椎脱臼。

5. 中性粒细胞-树突状细胞运动性及相互作用的图像处理与定量分析

注意：在本方案中，使用了专门的成像软件来分析显微镜数据。

  1. 4D 图像采集完成后，将文件（数据和元数据）传输至具备充足计算资源的工作站（建议最低系统配置：32 GB 内存、高速固态硬盘、近期发布的 CPU、基于大规模并行架构的独立 GPU）。
  2. 在成像软件中打开文件。
  3. 播放视频，确保目标细胞清晰可见，并且无成像伪影。
    注意： 为此，需验证样品的移动和亮度变化均被充分限制。事实上，这些因素会对自动分析造成挑战。26如果相邻帧之间样本的移动过大，可使用例如SHG通道作为固定参考，进行漂移校正。这有助于更准确地测量细胞的运动，而非样本的整体移动。此外，当存在明亮背景或碎片时，可利用体积作为筛选参数，对重建的表面进行修剪。
  4. 生成针对CFP的共定位通道+ 细胞，以分离CFP与胶原蛋白（SHG）之间的信号。为此，标记一个门控多边形（图2Bi) 仅选择绿色通道和蓝色通道中均具有正强度的体素。
    注意：该步骤可能因显微镜的滤光片组和细胞染色情况的不同而有所调整。可通过仅选择绿色和蓝色通道中均具有足够强度的体素来实现。在现有工具中，可使用“coloc”功能，基于强度阈值自动计算共定位通道。此外，在专家监督下，也可采用基于机器学习的方法完成此步骤。27.
  5. 检测与追踪 CFP+ 细胞，通过在适当的共定位通道上使用自动表面重建与追踪（表面工具）。
    注意：需手动校正可能出现的追踪错误，并排除持续时间短于设定阈值的轨迹即， 可能需要150秒。
  6. 生成针对 CD11c-YFP 的共定位通道+ 细胞，以分离CFP和YFP信号。为此，标记一个门控多边形（图2Bii选择绿色通道中具有正强度但蓝色通道中强度较低的体素。
    注意： 代表性显微图像显示了通道1、通道2、CFP的共定位通道、YFP的共定位通道以及所有通道合并后的信号，可参见于 图2Biii.
  7. 重建CD11c-YFP表面+ 细胞并随时间追踪其位置（表面工具）。
    注意：此步骤无需手动校正可能出现的追踪错误。事实上，由于树突状细胞（DC）具有复杂的时空动态特性，从双光子活体显微成像（2P-IVM）数据中精确重建其细胞表面是一项极具挑战性的任务，现有分割软件尚无法实现。造成该任务困难的原因包括：细胞的细长突起和荧光亮度变化，使得某些图像处理技术（如平滑滤波或固定阈值分割）无法适用；此外，在DC形成的网络结构中，仅依据其在2P-IVM图像中的表观特征难以准确区分单个细胞。鉴于上述原因，我们不建议通过调整软件参数来追求精确的细胞分割，而是提出重建DC的非精确表面轮廓，并如5.8节所述，采用鲁棒性度量方法来处理可能由此引入的误差。
  8. 测量细胞迁移。
    1. 导出CFP的常规迁移度量指标+ 和 CD11c-YFP+ 细胞。其中，“平均轨迹速度”表示细胞的平均迁移速率，而“轨迹直线性”表示细胞迁移的方向性。这些参数可从成像软件导出为电子表格文件。
    2. 在导出的电子表格文件中，计算CFP的“校正轨迹直线度”（也称为校正限制比率）+ 和 CD11c-YFP+ 细胞迁移效率，定义为“轨迹直线性”乘以“轨迹持续时间”的平方根，再除以视频总时长的平方根。相较于“轨迹直线性”，该指标在存在较短轨迹的情况下具有更高的稳健性。28，例如由追踪误差引起。
      注意：仅可使用此方法比较时长相等的视频。
  9. 测量细胞相互作用。
    1. 定义CFP之间的接触+ 细胞与CD11c-YFP+ 细胞，如果它们之间的距离（最近的体素）小于或等于某一阈值（即， 2 μm
      注意：该阈值应足够严格，以确保仅在细胞彼此紧密靠近时才检测到接触。然而，建议将该阈值保持大于0，理想情况下为体素半径的N倍（N > 1） > 2），因为边界平滑可能导致重建的细胞尺寸小于实际细胞大小。
    2. 统计CFP之间的接触次数和持续时间+ 和 CD11c-YFP+ 细胞。在成像软件中，可通过执行“kiss and run”插件来实现此操作。这些测量数据可从统计选项卡导出为电子表格文件。
  10. 将先前计算的指标导入统计软件，生成图表并进行统计检验。

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结果

在本研究中，我们描述了一种用于研究的详细实验方案 体内 小鼠气管中流感感染期间中性粒细胞与树突状细胞的迁移能力及其相互作用图 3A）。为此，我们分离了 CFP+ 中性粒细胞（92% 纯度； 图3B) 来自CK6-ECFP小鼠，并将其过继转移至感染流感病毒的CD11c-YFP小鼠体内。随后，在感染后第3天进行气管的双光子活体显微成像（2P-IVM）。在此时间点，我们观察到中性粒细胞被显著招募至感染区域，流式细胞术分析结果如图所示（图3C）。双光子体内显微成像（2P-IVM）方案需要使用特定的手术板和为啮齿类动物提供的氧气供应装置（图1A）。通过插入气管的导管供氧有助于动物呼吸，便于暴露气管，并控制与呼吸相关的器官运动（图1B）。在此实验设置...

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讨论

本研究提供了一项详细的实验方案，用于生成4D图像，以展示在流感病毒感染的小鼠气管中，过继转移的中性粒细胞的迁移过程及其与树突状细胞（DC）的相互作用。所述的双光子活体显微镜（2P-IVM）模型将有助于研究呼吸道感染过程中免疫细胞的动态行为。

近年来，已开发出多种基于气道内细胞动态可视化研究的模型9,10,11,12,13,14,15,16。然而，考虑到肺脏的解剖位置以及在呼吸周期中难以有效控制运动等因素，肺部的体内成像仍然具有挑战性

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由瑞士国家基金会（SNF）资助（资助号：176124、145038 和 148183）、欧盟委员会玛丽·居里返岗资助（612742）以及 SystemsX.ch 对 D.U.P. 的资助（2013/124）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吉加塞普特 instru AFSchülke & Mayr GmbH4% 溶液
CD11c-YFP 小鼠Jackson Laboratories008829小鼠在本机构内部繁育
CK6-ECFP 小鼠Jackson Laboratories004218小鼠在本机构内部繁育
1x 改良型杜尔贝科磷酸盐缓冲液（不含氯化钙和氯化镁）SigmaD8537-500ML
10x 改良型杜尔贝科磷酸盐缓冲液（不含氯化钙和氯化镁）SigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1L4°C 保存
氯胺酮 LabatecLabatec Pharma7680632310024室温保存；配制成氯/赛拉嗪混合溶液后需在 4 °C 保存
赛拉嗪 2%（赛拉嗪）Bayer6293841.00.00室温保存；配制成氯/赛拉嗪混合溶液后需在 4 °C 保存
26 G 1 mL 皮下注射 BD PlastipakBD Plastipak305501
30 G，0.3 mL BD Micro-Fine 胰岛素注射器BD324826
Falcon 40 µm 细胞筛Corning352340
2 mL 注射器BD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G 针头BD304622
Introcan Safety 20 G（导管）Braun4251652.01
6 孔细胞培养板Costar3516
RPMI 1640 培养基 + HEPES（1x）ThermoFisher Scientific42401-0184°C 保存
Liberase TL 研究级酶Roche5401020001-20 °C 保存 / 胶原酶（I 型和 II 型）混合物
脱氧核糖核酸酶 IAmresco (VWR)0649-50KU-20 °C 保存
CellTrace Violet 染料ThermoFisher ScientificC34557-20 °C 保存
EDTASigmaEDS-500G
胎牛血清Gibco10270-106-20 °C 保存
PE-10 微型医用导管2Biological Instruments SNC#BB31695-PE/1
外科塑料胶带M Plast
维滋透滴眼液Bausch & Lomb室温保存
橡皮泥Ohropax
高耐受性玻璃盖玻片，直径 15 mmWarner Instruments64-0733
SomnoSuite 便携式动物麻醉系统Kent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag（气体麻醉与加热平台）Tem Sega
手术板伯尔尼大学
TrimScope II 双光子显微镜LaVision Biotec
Chameleon Vision 钛蓝宝石激光器Coherent Inc.
25X NA 1.05 水浸物镜OlympusXLPLN25XWMP2
The Cube&The Box 培养室及温度控制器Life imaging Services
Imaris 9.1.0Bitplane成像软件
GraphPad Prism 7GraphPad统计分析软件

参考文献

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利用双光子活体显微镜成像流感病毒感染期间气管黏膜中的细胞相互作用
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