不同二硫 Connectivities µ-芋螺毒素 PIIIA 异构体的合成与结构测定

生物活性肽在药物研究和开发中的应用得到高度认可, 因为它们代表了特定生物靶¹的有效和高度选择性化合物。然而, 对于它们的生物活性, 三维结构是非常重要的, 以执行结构-活动关系研究^2,3,4。除影响整体构象的主要氨基酸序列外, 二硫键还能显著稳定半胱氨酸富肽⁵的结构。多重二硫化物桥接肽包括芋螺毒素, 如µ PIIIA圆锥 purpurascens , 其序列中含有六半胱氨酸。这种高半胱氨酸含量理论上允许形成15二硫化物异构体。正确的二硫化物连通性是非常重要的生物活动^6,7。然而, 出现的问题是是否有一个以上的生物活性构象自然发生的肽, 如果是这样, 哪些异构体具有最高的生物活性？在µ-芋螺毒素的情况下, 生物靶点为电压门控钠离子通道, 特别是µ-PIIIA 对亚型 Na_v1.2、na_v1.4 和 na_v1.7³最有效。

采用多种方法可实现二硫桥多肽的合成。在肽内形成二硫化物键的最方便的方法是所谓的氧化自折叠法。在此, 首先用固相肽合成法合成所需循环肽的线性前体, 即在缓冲系统中由聚合物支持氧化后的裂解。氧化还原酶活性剂, 如还原和氧化谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 往往增加, 以促进形成的二硫化物债券。缓冲支持自折叠的主要缺点是二硫化物债券不是以逐步的方式有选择地形成的。与原生肽相比, 通常只有一个特定的二硫化物异构体被描述, 有可能获得许多其他异构体以这个方法⁸。µ-PIIIA 已经被证明导致至少三种不同的折叠异构体后, 自折叠在以前的研究³。这种异构体混合物的分离是相当困难的, 由于相同的保留时间, 如果使用色谱纯化方法⁹。因此, 特定异构体的目标合成是有利的。为了专门生产具有定义的二硫化物连通性的异构体, 需要一个特殊的策略, 在其中二硫化物键连续关闭。因此, 在聚合物支持下合成了具有不同保护基团的线性前体在单个半胱氨酸对上。消除后, 半胱氨酸对分别和连续 deprotected 和连接在一个氧化反应, 以产生所期望的二硫化物债券^{10,11,12,13,14,15,16}. 在反应产物的合成和纯化后, 需要用适当的分析方法确认识别和二硫化物的连通性。许多分析方法可用于阐明主要氨基酸序列, e., ms/毫秒, 而二硫化物连通性的测定仍然很少被调查。除了这种多重二硫化物粘结肽的复杂性外, 与产品相关的杂质 (例如, 从二硫化物上的), 由于样品的制备和工作, 可以进一步复杂化分析。在本文中, 我们表明, 使用不同的分析技术是必要的, 以明确澄清二硫化物键在µ-PIIIA 异构体的身份。我们将色谱方法与质谱相结合, 并提供了相同的样品到核磁共振光谱学中。在基质辅助激光解吸/电离 (MALDI) ms/质谱分析中, 我们用部分还原和 iodoacetamide 衍生的方法确定了二硫化物键, 因为这种肽的自顶向下分析是不可能的。为了获得每种异构体的三维结构, 进行了2D 核磁共振实验。因此, 通过结合不同的复杂的分析方法, 可以正确地阐明二硫化物连通性和三维结构复杂的多重二硫化物结肽⁷。

注: 此处使用的所有氨基酸均采用 l-构型。根据 IUB 命名委员会和 IUPAC-IUB 联合委员会关于生物化学术语的建议, 使用了氨基酸和氨基酸衍生物的缩写。

1. 固相肽合成 (许可证)

注: 采用固相多肽合成器进行合成。使用 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (n-芴甲氧羰基) 化学的标准协议, 对常规序列 ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH₂的线性肽前体进行合成。应用下列受保护的氨基酸: Pyr (叔羰基), Arg (Pbf (22, 46, 7-pentamethyldihydrobenzofuran 5 磺酰)), Asn (trt)、Asp (tBu)、浆 (tBu)、赖氨酸 (中行)、系列 (tBu)、Gln (trt)、谷氨酸 (tBu)、跨国激进党 (中行)、Tyr (tBu)、(tBu) 及其(Trt)。根据预期的二硫化物连通性, 保护半胱氨酸对与 Trt, Acm, 或t步组。

1. 制备
   1. 干燥的芴甲氧羰基溜冰场-酰胺树脂 (加载: 0.28 毫摩尔/克) 使用一个冻干机过夜。
   2. 在合成器的程序中输入所需的肽序列 (1 字母代码)。该程序计算每个试剂所需的量, 并指示溶剂量。
   3. 根据该协议称个别试剂 (氨基酸, HBTU (2-1 benzotriazol-1 基)-11, 33-tetramethyluronium 六氟磷酸盐)), 并将其溶解于甲基酰胺 (DMF) 到最终浓度为2.4 米 (氨基酸) 和0.6 米 (HBTU) 分别。
   4. 转移不同的试剂 (氨基酸, HBTU, n-甲基啉) (NMM, 50% 在 dmf), 哌啶 (20% 在 dmf), dmf, 二氯甲烷 (DCM)) 到相应的容器, 并把它们放在适当的球拍的固相肽合成器。
   5. 在反应柱上加入100毫克的干树脂, 放入合成器的球拍中。开始固相肽合成。
2. 许可证协议 (由合成器提供)
   注: 该协议适用于100毫克的树脂 (加载: 0.28 毫摩尔/克) 添加到一个反应柱28µmol 规模。
   1. 树脂的制备
      1. 用2500µL 的 dmf、1400µL 的 DCM 和1400µL 的 dmf 冲洗树脂。
      2. 用空气冲洗树脂, 直到溶剂被除去, 用2500µL 的 DMF 冲洗树脂。
   2. n-芴甲氧羰基保护基团的裂解
      1. 加入20% 哌啶在 DMF (1000 µL) 到树脂和等待6分钟. 从树脂中取出溶液。重复步骤1.2.2.1。
      2. 用 dmf 冲洗两次 (1^st 4000 µL,2 和1400µL), 用空气冲洗树脂, 直到溶剂被除去, 并用2000µL 的 dmf 冲洗两次。
   3. 耦合反应
      1. 在单独的瓶子中混合下列试剂: HBTU (450 µL; 0.6 米在 dmf; 270 µmol; 9.6 eq), NMM (125 µL; 50% 在 dmf; 568 µmol; 20 eq), n-芴甲氧羰基氨基甲酸 (420 µL; 2.4 米在 dmf; 1.01 毫摩尔; 36 eq)。将混合物加入树脂中, 等待13分钟. 从树脂中取出溶液。重复步骤1.2.3.1。
      2. 用3000µL 的 DMF 洗净。用1400µL 的 DMF 洗两次。用2000µL 的 DMF 洗两次。
      3. 根据肽序列中氨基酸的数量重复步骤1.2.2 和1.2.3。
   4. 最终的 n-芴甲氧羰基裂解和树脂洗涤
      1. 加入20% 哌啶在 DMF (1000 µL) 到树脂和等待6分钟. 从树脂中取出溶液。重复步骤1.2.4.1。
      2. 用 DMF (1^st 4000 µL, 2 和 1400 µL) 冲洗两次, 用空气冲洗树脂。用2000µL 的 DMF 冲洗两次, 4 倍于1400µL 的 DCM, 并用空气冲洗两次。
3. 工作
   1. Lyophilize 在合成完成后一夜之间从反应柱上的树脂。

2. 树脂中的肽裂解 (图 1A)

注: 在卵裂过程中, 除胱氨酸 (Acm) 和胱氨酸 (t.) 的所有氨基酸侧链都将 deprotected。该协议适用于100毫克树脂。

1. 将冻干树脂结合在12毫升管中, 冷却到0摄氏度的冰上。
2. 添加150µL 的清道夫混合物 (从0.75 克苯酚, 0.5 毫升 thioanisole, 0.25 毫升 ethanedithiol) 和1毫升三氟乙酸酸 (TFA, 95% 在水 (H2O)) 在冰上的树脂。在室温下轻轻摇动3小时。
3. 通过玻璃熔块过滤混合物, 并收集在单独填充冰冷二乙基醚 (1 毫升的裂解混合物每8-10 毫升乙醚) 的滤液。肽沉淀成白色固体。
4. 用额外的 TFA (95% 在 H₂O, 大约1-3 毫升) 冲洗滤饼。
5. 关闭含有沉淀和离心机的管 (3400 x g) 悬浮液1分钟, 醒酒上清, 用8-10 毫升冰冷二乙基醚清洗颗粒。重复此步骤3次。
6. 将球团放在没有塞子的情况下5分钟, 以去除残留的二乙基醚的痕迹。在1毫升的叔丁醇中溶解粗积丸 (80% 在 H₂O)。冻干的多肽 (-80 °c)。

3. 用半制备高效液相色谱法纯化线性前驱体

注: 采用半制备反相高效液相色谱法纯化粗肽, 配以 C18 柱 (5 µm 粒径、100Å孔径、250 x 32 毫米) 和3.6 毫升注射回路。在乙腈 (MeCN)/H₂o (9:1, 淋洗 B) 中, 使用 0.1% TFA 在 H₂O (淋洗 a) 和 0.1% TFA 中的梯度洗脱系统。探测到 220 nm 的峰值。

1. 将粗肽的约70毫克添加到15毫升管中, 并将固体肽溶解于 HPLC 样品环的容积 (e., 3.6 毫升)。使用 0.1% TFA 的混合物在 MeCN/小时₂O (1:1)。漩涡直到完全溶解和离心机 (3400 x g) 溶液为1分钟。
2. 在5毫升注射器中绘制样品 (3.6 毫升), 并在注射回路中注射无气泡的样品。注入 HPLC 系统。在10毫升/分钟的流速下, 用0-50% 淋洗 B 的梯度在120分钟内分离肽混合物。
3. 收集各管的分数, 因为它们出现。在运行完成后, 为质谱 (MS) 和 HPLC 分析 (步骤 6.1-6.2) 准备选定的分数。冷冻干燥的分数和储存在-20 摄氏度。
4. 在 MS 和 HPLC 分析后, 将线性肽的纯分数组合, 并为第一氧化制备样品。

4. 选择性地形成二硫化物债券

1. 1 ^st氧化 (图 1B)
   注: 在树脂的肽解切过程中, 胱氨酸 (Trt) 为 deprotected, 导致两个不受保护的胱氨酸残留物随后被氧化形成第一硫化物键。以下协议适用于15毫克的线性纯化肽 (2864.5 克/摩尔; 5.2 µmol; 1 eq)。
   1. 将线性肽 (15 毫克) 溶于异丙醇/H₂O 型混合物 (1:2; 0.05 毫米; pH 8.5 与氢氧化钠 (氢氧化钠) 调节), 在基本条件下保持在空气中轻轻摇动 12-48 H。
   2. 通过 HPLC 和 MS 对氧化反应进行监测. 通过 iodoacetamide (IAA) 衍生 (步骤 6) 确定第一桥的形成。
   3. 冷冻干燥的肽和使用它没有进一步净化2和氧化.
2. 2^钕氧化 (图 1C)
   注: 在第二氧化过程中, 脱的半胱氨酸和第二桥的形成是由碘催化的。该协议适用于 1^st氧化后的15毫克肽 (2862.5 克/摩尔; 5.2 µmol; 1 eq)。
   1. 在异丙醇/H₂O/1 盐酸 (盐酸) 混合物的105毫升中溶解肽 (15 毫克; 最终浓度为0.05 毫米) (80:12.5: 7.5)。
   2. 在甲醇 (甲醇) (15.7 µmol; 3 eq) 中加入158µL 的0.1 米碘溶液。在室温下搅拌3-52 小时的反应, 直到氧化完成。
   3. 通过高效液相色谱和 MS 对氧化反应进行监测. 通过 iodoacetamide (IAA) 衍生 (步骤 6) 确定二次二硫化物键的形成。
   4. 在 H₂O (78.8 µmol; 15 eq) 中加入79µL 的1米抗坏血酸溶液, 停止反应。冷冻干燥反应混合物, 并使用粉末为 3^rd氧化。
3. 3^路氧化 (图 1D)
   注: 上一次氧化导致t脱保护的半胱氨酸和第三二硫化物桥梁的形成。该协议适用于2和氧化后的15毫克肽 (2718.3 克/摩尔; 5.5 µmol; 1 eq)。
   1. 在5.5 毫升的 TFA 中溶解肽 (15 毫克, 最终浓度为1毫米)。它包含一个清道夫混合物由11.2 毫克 diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 eq), 60.2 µL 甲醚 (0.6 毫摩尔; 100 eq) 和97.2 µL trichloromethylsilane (0.8 毫摩尔; 150 eq)。在室温下搅拌3-5 小时的混合物。
   2. 通过高效液相色谱和 MS 对氧化反应进行监测. 通过 iodoacetamide (IAA) 衍生 (步骤 6) 确定第三二硫化物键的形成。
   3. 在含有冷二乙基醚 (0 °c, 1 毫升的反应溶液中, 每8-10 毫升二乙基醚) 中沉淀肽。
   4. 离心机悬浮液 (3400 x 克, 1 分钟), 醒酒上清, 并用8-10 毫升的冷二乙基醚 (0 °c) 反复清洗颗粒 (4 倍)。让颗粒在空气中干燥 (3 分钟)。
   5. 将小球溶于1毫升 80%叔丁醇 (H₂O), 冷冻干燥肽并将其贮存在-20 摄氏度。

5. 肽纯化

注: 半制备高效液相色谱法纯化氧化肽, 配以 C18 柱 (10 µm 粒径、300Å孔径、250 x 22 毫米) 和3.6 毫升注射回路。使用 0.1% TFA 在 H₂o (淋洗 a) 和 0.1% TFA 的梯度洗脱系统在 MeCN/小时₂o (9:1, 淋洗 B)。探测到 220 nm 的峰值。

1. 添加15毫克的冷冻干燥的原油产品从步骤4.3.5 到15毫升管。在 HPLC 样品循环量 (3.6 毫升) 中溶解原油.使用 0.1% TFA 的混合物在 MeCN/小时₂O (1:1)。漩涡直到完全溶解和离心机 (3400 x g) 溶液为1分钟。
2. 在5毫升注射器中绘制3.6 毫升混合物, 并在注射回路中注入无气泡的样品。开始注射液相色谱系统。用0-50% 淋洗 B 的梯度以10毫升/分钟的流速纯化多肽混合物。
3. 收集各管的分数, 因为它们出现。运行完成后, 为 MS 和 HPLC 分析 (步骤 6.1-6.2) 准备选定的分数。冷冻干燥所有的分数和储存在-20 摄氏度。
4. 运行完成后, 为 MS 和 HPLC 分析 (步骤 6.1-6.2) 准备选定的分数。冷冻干燥所有的分数和储存在-20 摄氏度。

6. 肽分析

1. HPLC 分析法
   注: 用 C18 柱 (5 µm 粒度、300Å孔径、250 x 4.6 毫米) 和500µL 注射回路的分析反相 HPLC 法确定肽的纯度。使用 0.1% TFA 在 H₂O (淋洗 a) 和 0.1% TFA 中的梯度洗脱系统 MeCN (淋洗 B)。探测到 220 nm 的峰值。
   1. 将肽分数或反应控制的样本转移到 HPLC 瓶中, 并将其溶解在 MeCN/H2O (1:1、300-500 µL) 中的 0.1% TFA 混合物中。将高效液相色谱瓶放入 autosampler 分析反相色谱仪中。
   2. 每样样品注射250µL。使用 0.1% TFA 在 H₂O (淋洗 a) 和 0.1% TFA 中的梯度洗脱系统 MeCN (淋洗 B)。用10-40% 淋洗 B 的梯度以30分钟的速度纯化肽, 流速为1.0 毫升/分钟。
2. MALDI 飞行质谱仪
   注: 以αcyano-4-hydroxycinnamic 酸为基质, 通过 MALDI (飞行时间) 质谱法确定肽的特征。
   1. 将可见量的肽转移到1.5 毫升离心管中, 并将其溶解在10µL 的37毫米αcyano-4-hydroxycinnamic 酸溶液中, 混合 0.1% TFA 在 H₂O/MeCN (1:1) 中。
   2. 涡旋的解决方案为十年代, 将2µL 的样品应用到地面钢靶上, 并风干样品。
   3. 使用反射器模式的测量和多肽校准标准的摩尔质量低于6000克/摩尔。
3. Iodoacetamide 衍生
   注: 当 iodoacetamide 反应与硫醇组, iodoacetamide 衍生的肽表明游离硫醇基团。因此, 无游离硫醇基团在 1^st氧化过程中通过 MS 进行反应控制。
   1. 在1.5 毫升离心管中溶解10毫米磷酸盐缓冲液中的肽 (100 µL; 0.05 毫米; pH 7.8)。在10毫米磷酸盐缓冲器 (4 毫米) 中加入100µL iodoacetamide, 并在黑暗中轻轻摇动2小时的反应。冷冻干燥反应混合物, 并贮存在-20 摄氏度。
   2. 使用 C18-concentration 过滤器尖端和条件的提示与10µL 80% (3 倍), 50% (3 次), 30% (3 倍) 和 0% (3 倍) MeCN 在 H₂O (+ 0.1% TFA)。
   3. 将样品从步骤6.3.1 中溶解1µL 0.1% TFA 中的₂O, 并将溶液添加到过滤器的吸管尖端。吸管小心上下, 使肽绑定到珠。去除吸管尖端的 H₂O, 用10µL 0.1% TFA 在 h₂o 冲洗过滤器吸管尖端。
   4. 添加2µl 0.1% TFA 在 H₂O/MeCN (1:1) 与另一个吸管尖端 (不过滤器) 的顶部的珠, 其中含有肽。将滤液应用于地面钢靶和风干试样。
   5. 应用1µL 37 毫米的α氰化物-4-肉桂酸溶液的混合物 0.1% TFA 在 H₂O/MeCN (1:1) 对地面钢靶与样品和空气干燥样品。
   6. 使用反射器模式的测量和多肽校准标准的摩尔质量低于6000克/摩尔。
4. 氨基酸分析
   注: 用氨基酸分析仪分析肽的确切肽浓度及氨基酸组成。
   1. 将纯肽 (2604 克/摩尔; 0.04 µmol) 的100µg 转移到1.5 毫升离心管上, 并将粉末溶解在200米盐酸µL 中。
   2. 将溶液的200µL 转移到玻璃安瓿中, 将1.5 毫升离心管冲洗两次, 200 µL 6 米 HCl. 将漂洗液输送到玻璃安瓿中。
   3. 用本生燃烧器火焰加热安瓿的颈部, 关闭安瓿。把安瓿放进玻璃管里。把它放在一个加热块24小时在110°c 为水解。
   4. 打开安瓿, 将溶液转化为2毫升的离心管。用双蒸馏 H₂O 洗涤安瓿 (3 x 200 µL) 和瓶盖 (3 x 100 µL) 并将其转移到离心管中。
   5. 离心机的解决方案为6小时在60°c 和 210 x g 在旋转真空选矿厂。在样品稀释缓冲器 (200 µM) 的192µL 中溶解水解产物, 将溶液转化为微离心过滤器。
   6. 离心样品为1分钟在 2300 x g 和转移100µL 的滤液入氨基酸分析样品管。将管子放入氨基酸分析仪中, 开始分析。氨基酸标准用于校准。

7. 二硫化物连通性的 ms/毫秒分析

1. 部分还原和烷基化¹⁷
   1. 溶解600µg 的纯肽 (2604 克/摩尔; 0.23 µmol) 在1.2 毫升0.05 米柠檬酸盐缓冲 (pH 3.0; 0.14 毫米肽浓度) 含7.5 毫克的三 (2-羧乙基) 膦 (TCEP; 0.02 米; 0.03 毫摩尔)。
   2. 在室温下孵化混合物, 并采取几种反应控制样品 (100 µL), 范围从0分钟到30分钟不等。
   3. 将样品混合在1.5 毫升离心管中, 300 µL 烷基化缓冲液 (0.5 米三乙酸酯; pH 8.0; 2 毫米乙二胺四乙酸 (EDTA); 1.1 米 iodoacetamide) 停止反应并执行 carbamidomethylation 的游离硫醇基团。
   4. 在5分钟后停止反应, 加入100µL 10% TFA (在 H₂O), 并将样品储存在干冰上。按步骤6.1.2 中的描述制备 HPLC 样品, 并注入400µL. (图 2A)
   5. 使用 0.1% TFA 在 H₂O (淋洗 a) 和 0.1% TFA 中的梯度洗脱系统 MeCN (淋洗 B)。用等度分离 (10% 淋洗 b 15 分钟) 和随后的 10-35% 淋洗 b 的梯度, 以10毫升/分钟的流速来分析多肽. 检测峰值为 220 nm。
   6. 收集1.5 毫升离心管的分数, 冷冻干燥的多肽。(图 2B)
   7. 将少量的每一个分数转移到一个1.5 毫升的离心管, 用于对氧化形式的 ms/毫秒分析 (在步骤7.1.12 继续)。
   8. 将剩余的肽 (10-100 µg) 在 0.1% TFA 中溶解₂O (10-50 µL), 并添加一个适当体积的100毫米 TCEP 溶液 (在 h₂o), 以获得最终 TCEP 浓度为10毫米。
   9. 孵育反应为1小时在37°c (图 2C)。冷冻干燥反应混合物, 并贮存在-20 摄氏度。
   10. 按照步骤 6.3. 2-6. 3.5 中的说明准备 ms/ms 样品。
   11. 在 MALDI 的质谱仪上执行 ms/毫秒测量。使用 ms/毫秒盖 (激光诱导衰变) 的肽分裂, 并选择2和4倍 carbamidomethylated 物种的前体质量。处理和评估 MALDI 数据以确认所需的二硫化物连通性。

8. 核磁共振实验和结构分析

1. 溶解约 0.3-2 毫克的纯肽产品在500µL 的 H₂o/D₂o (90:10) 和转移混合物成核磁共振微细。
2. 在核磁共振光谱仪中制备测量样品
3. 记录2维 [¹h,¹h]-DQF 舒适 (双量子过滤相关光谱学), [¹h,¹h]-TOCSY (总相关光谱学), [¹h,¹h]-NOESY (核 Overhauser 增强光谱学), 和 [¹H,¹³C]-HSQC (异单量子相干) 光谱使用水抑制。
4. 分配记录光谱的质子共振, 并从 NOESY 光谱中创建原子赋值。比较 NOESY 谱中的强度, 以确定肽中不同原子之间的上限距离约束。使用生发质子的强度来校准峰值强度。
5. 用计算机程序对分子可视化进行结构计算和细化, 并将步骤7中确定的二硫化 connectivities 作为附加约束 (图 3)。
6. 选择具有最低能量的结构, 并将其用于分子动力学 (MD) 模拟。

对µ-芋螺毒素 PIIIA 的15种不同的二硫桥异构体进行了合成, 并进行了详细的描述 (图 1)。二硫化键通过部分还原和随后的 ms/毫秒分析来确定 (图 2)。对不同异构体进行了核磁共振分析 (图 3), 揭示了各自的肽结构。值得注意的是, 高效液相色谱、ms/毫秒碎片和核磁共振分析相结合, 是确定二硫化物连通性的必要条件。

图 1: µ-PIIIA 的选择性二硫键形成通过保护组策略。(A)在树脂脱的肽解切过程中, Trt 保护的半胱氨酸。(B)第一个二硫化物桥梁形成的未受保护的半胱氨酸。(C)脱和二硫化物桥梁形成的半胱氨酸保护。(D)脱和二硫化物桥梁形成的t. 保护半胱氨酸。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 通过 ms 和 ms 分析对二硫化键分配进行部分还原工作流。(A)肽的部分还原和烷基化。(B)高效液相色谱法纯化不同反应控制样品。(C)减少纯化样品。部分 carbamidomethylated 物种 (中间两个肽) 港口信息的二硫化物连通性, 这是由 ms/ms 分析。这一数字已在海默·拉斯伯恩、P等人的许可下改编。重新研究构象µ-芋螺毒素 PIIIA 异构体: 半胱氨酸配对对二硫键分配和结构澄清的影响。分析化学。90 (5), 3321-3327 (2018)。版权所有 (2018) 美国化学学会。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 顺序行走和由此产生的核磁共振溶液结构的刚性 (左) 和灵活 (右) µ-PIIIa 异构体.显示了20种结构的能量最低, 以及不同异构体的二硫化物连通性。对根均方根偏差 (均方根偏差) 值的比较阐明了刚性肽主要导致较好的核磁共振结构。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。