一种利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和二维SDS-PAGE解析植物类囊体蛋白复合物结构与组成的实验方案被详细描述。该方案已针对 拟南芥, 但经过少量修改后也可用于其他植物物种。
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摘要
摘要
光合电子传递链（ETC）将太阳能转化为NADPH和ATP形式的化学能。嵌入类囊体膜中的四个大型蛋白复合物利用太阳能，通过两个光系统将电子从水传递至NADP+，并利用所产生的质子梯度合成ATP。光系统PSII、PSI、细胞色素b6f（Cyt b6f）和ATP合酶均为多亚基蛋白复合物，在类囊体膜中具有特定的空间取向和动态行为。通过温和去垢剂将这些复合物从保持完整性的膜中溶解出来，再经非变性凝胶电泳分离，可获得有关类囊体膜中蛋白复合物组成及其相互作用的有价值信息。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种用于在天然且有功能的状态下分离蛋白复合物的分析方法。该方法既可用于蛋白复合物的纯化以进行更深入的结构分析，也可作为研究蛋白复合物间动态相互作用的工具。该技术最初为线粒体呼吸链蛋白复合物分析而开发，现已针对类囊体蛋白复合物的研究进行了优化和改进。本文提供了一个详细且最新的实验方案，用于分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）中不稳定的光合蛋白复合物及其相互作用。
引言
大型多亚基蛋白复合物光系统PSI和PSII、细胞色素b6f以及ATP合酶共同协调光合作用光反应中NADPH和ATP的生成。在高等植物叶绿体中，这些复合物位于类囊体膜上，该膜是一种结构异质性的膜系统，由堆叠的基粒类囊体和非堆叠的基质类囊体组成。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种广泛用于分析大型多亚基蛋白复合物天然且具有生物学活性形式的方法。该方法最初建立用于线粒体膜蛋白复合物的解析1，随后被优化用于分离类囊体膜网络中的蛋白复合物3。该方法适用于：（i）纯化单个类囊体蛋白复合物以进行结构分析；（ii）确定蛋白复合物之间的天然相互作用；以及（iii）分析在不同环境信号变化下蛋白复合物整体组织结构的变化。
在分离之前，需使用精心选择的非离子型去垢剂从膜中分离蛋白质复合物，这类去垢剂通常较为温和，能够保持蛋白质复合物的天然结构。去垢剂含有疏水和亲水位点，在达到一定浓度（称为临界胶束浓度，CMC）以上时可形成稳定的胶束。当去垢剂浓度超过CMC时，会破坏脂质-脂质相互作用，从而使蛋白质复合物溶解。去垢剂的选择取决于目标蛋白质复合物的稳定性以及去垢剂的溶解能力。常规使用的去垢剂包括α/β-十二烷基麦芽糖苷（α/β-dodecyl-maltoside）和皂苷（digitonin）。在保持蛋白质复合物天然状态的前提下完成溶解后，通过离心去除不溶性物质。在高等植物中，类囊体膜在结构上具有高度异质性，某些去垢剂（例如，digitonin）仅选择性地溶解膜的特定部分3。因此，为了表征蛋白质复合物的组织结构或复合物之间的相互作用，必须通过测定上清液中的叶绿素含量以及上清液与沉淀中叶绿素a/b比值，来评估所选去垢剂的溶解能力，分别反映可溶部分的得率及其代表的类囊体（亚）区域。在适应生长光条件的植物中，完整类囊体的叶绿素a/b比值通常约为3，而富含基粒或基质类囊体的类囊体组分，其叶绿素a/b比值则分别低于（约2.5）或高于（约4.5）总类囊体的该比值。
为了给蛋白质复合物提供负电荷，将考马斯亮蓝（CBB）染料加入溶解后的样品中。由于电荷的改变，蛋白质复合物向阳极迁移，并根据其分子质量和形状在丙烯酰胺（AA）梯度凝胶中实现分离。通过使用线性丙烯酰胺浓度梯度，可实现高效且高分辨率的分离。在电泳过程中，蛋白质复合物向阳极迁移，直至达到与其大小相关的孔径极限。聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于（i）总丙烯酰胺/bis-丙烯酰胺浓度（T）以及（ii）交联剂bis-丙烯酰胺单体浓度（C）相对于总单体的比例4。在通过BN-PAGE完成分离后，可通过第二维（2D）SDS-PAGE将蛋白质复合物进一步分离为其各自的蛋白质亚基。本文详细描述了利用BN-PAGE/2D-SDS-PAGE分析类囊体膜蛋白质复合物的实验方案。
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方案
1. 准备BN凝胶1,2,3
- 根据制造商说明，使用 0.75 mm 间隔垫，将 8 cm × 10 cm 的玻璃板（矩形玻璃板和带凹槽的氧化铝板）安装到凝胶铸模器中。
- 将梯度混合器置于磁力搅拌器上，并通过一段软管将其与蠕动泵连接。将注射器针头连接到软管的另一端，并将针头置于玻璃板与铝板之间。将磁力搅拌子放入“重”（H）室中。
- 在 15 mL 圆锥形离心管中配制用于分离胶梯度的 3.5%（v/v）和 12.5%（v/v）丙烯酰胺（AA）溶液（参见表 1中的配方）。为防止过早聚合，在配制过程中将离心管置于冰上。
注意：丙烯酰胺具有神经毒性和致癌性，操作时应穿戴防护服和手套。 - 在将溶液移入梯度混合器前，立即加入 5% 过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）。将 12.5% 的溶液移入 H 室。
- 打开连接“轻”（L）室与 H 室的阀门，使溶液流入 L 室，以排除连接通道中的气泡。关闭阀门，并将残留溶液重新移回 H 室。
- 最后，将 3.5% 的溶液移入 L 室。
- 启动磁力搅拌器（搅拌速度无需精确，但应确保重液与轻液充分混合），打开阀门并启动蠕动泵。使凝胶溶液在玻璃板与铝板之间流动，流速约为 0.5 mL/min。针头必须始终位于液面之上，可用胶带将其固定在玻璃板上端。
- 当 H 室和 L 室中的溶液排空后，向其中加入超纯水，使水 缓慢覆盖凝胶表面。凝胶在室温下聚合约需 1–2 小时。
- 在室温下配制 3% 丙烯酰胺溶液（参见表 1中的配方）用于浓缩胶。在聚合完成的分离胶上层灌注浓缩胶（灌胶前需去除覆盖在凝胶表面的水），并在玻璃板与铝板之间插入样品梳，避免产生气泡。
- 在室温下静置聚合 30–60 分钟。在超纯水中轻轻取出梳子。将凝胶储存于 +4 ˚C。
暂停点：凝胶可在 +4 ˚C 下保存数天。应保持湿润环境，防止加样孔和凝胶表面干燥。
- 在室温下静置聚合 30–60 分钟。在超纯水中轻轻取出梳子。将凝胶储存于 +4 ˚C。
2. 类囊体膜的溶解1,2,3
注意：所有步骤均应在极弱光条件下进行。样品和缓冲液需保持在冰上。
- 用预冷的25BTH20G缓冲液稀释分离的类囊体，使叶绿素终浓度为1 mg/mL。用于2D-BN-SDS-PAGE分析时，大约需要4-8 µ每克叶绿素/样品较为合适。
注意：实验中所用的类囊体必须从新鲜叶片中分离（类囊体分离方案详见3) - 加入等体积的去污剂缓冲液， 即， 2% β-DM（w/v）或 2% 皂苷（w/v）。用移液枪头轻轻将去垢剂与类囊体样品混合，避免产生气泡。最终去垢剂浓度为 1%，类囊体浓度为 0.5 mg Chl/mL。
- 在冰上孵育 2 分钟以溶解类囊体（β-DM）或在室温下用摇床/振荡器持续轻柔混匀10分钟（皂苷）。
注意：皂苷素（digitonin）和 β-DM 通常用于溶解类囊体蛋白复合物。若使用其他非离子型去污剂，必须首先优化去污剂浓度和溶解时间。去污剂浓度通常在 0.5%–5%（v/v）范围内。
注意：皂苷毒性强，操作时需穿戴防护服和手套
- 在冰上孵育 2 分钟以溶解类囊体（β-DM）或在室温下用摇床/振荡器持续轻柔混匀10分钟（皂苷）。
- 在 4 °C、18,000 × g 条件下离心 20 分钟，去除不溶物 ˚C.
- 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并向样品中加入1/10（v/v）的CBB缓冲液。
注意：当检测类囊体膜蛋白复合物的整体组成时，建议确定可溶化组分的得率及其代表的类囊体结构域。为确定可溶化物质的得率，取5 µ将上清液 1 L 转移至新试管（加入考马斯亮蓝之前），测定叶绿素含量及叶绿素 a/b 比值5.
3. BN-PAGE1,2,3
- 将凝胶安装至垂直电泳系统中例如， Hoefer SE 250）。将蓝色阴极缓冲液加入上层缓冲液室（参见 表1）并将阳极缓冲液倒入下层缓冲室。
- 上样类囊体样品（例如， 5 µg 叶绿素）加入到加样孔中。
- 开始电泳并逐步提高电压：75 V 运行 30 分钟，100 V 运行 30 分钟，125 V 运行 30 分钟，150 V 运行 1 小时，然后 175 V 持续运行直至蛋白复合物完全分离。将凝胶在 +4 °C 条件下运行˚C，可使用低温室或通过冷却系统调节凝胶温度。
注意：当样品前沿迁移至凝胶约三分之一处时，将蓝色阴极缓冲液更换为透明阴极缓冲液。 - 电泳结束后，使用照片扫描仪扫描凝胶以存档图像。
4. 二维SDS-PAGE
- 组装垂直电泳系统（凝胶尺寸为 16 cm × 20 cm），使用 1 mm 间隔垫片。
- 制备标准 SDS 凝胶（12% 丙烯酰胺，6 M 尿素，配方见表 2），使用 2D 梳子（一个大孔用于胶条，一个标准孔用于分子量标记）。
- 切下 BN 凝胶的泳道，放入 (5 mL) 离心管中。加入 2 mL Laemmli 缓冲液（含 5% β-巯基乙醇），在室温下轻轻振荡孵育 45 分钟。
- 借助e.g., 间隔垫片等工具，将胶条置于凝胶上方，避免产生气泡。
- 将 5 µL 分子量标记液加到一小片滤纸上，然后将滤纸放入标准加样孔中。
- 为密封 BN 凝胶条和标记滤纸，在胶条上方加入 0.5% 琼脂糖（溶于电泳缓冲液中），待其凝固。
- 按照标准电泳程序进行电泳。电泳结束后，使用e.g., Sypro Ruby 染色或银染法对蛋白质进行显色6。
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结果
一种具有代表性的二维氮化硼/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统 图1 展示了皂苷素和β-DM溶解的类囊体蛋白复合物的分离及其蛋白质亚基组成的详细分析。皂苷素溶解类囊体的蛋白复合物图谱（上方水平胶） 图1A包含PSII-LHCII-PSI巨型复合物、两个大型PSII-LHCII超级复合物（sc）、PSI-LHCII超级复合物、PSI单体（m）以及PSII m/Cyt b6f，松散结合的（L）-LHCII三聚体（图1A）。稍强的去垢剂β-DM可溶解整个类囊体膜（顶部的水平凝胶） 图1B)，但无法保留蛋白质复合物之间的弱相互作用。使用β-DM溶解类囊体通常会产生四种PSII-LHCII超级复合物（结合不同数量的LHCII天线）、PSII二聚体（d）和PSI单体、ATP酶、PSII单体以及细胞色素b6f、...
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讨论
光合作用能量转换系统由嵌入类囊体膜中的大型多亚基蛋白复合物组成。本方案描述了一种利用非变性凝胶电泳（BN-PAGE）结合二维SDS-PAGE分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）类囊体蛋白复合物的基本方法。该方案也适用于烟草和菠菜类囊体蛋白复合物的分析，但可能需要进行少量调整。
为了溶解膜蛋白复合物，通常使用非离子型去污剂，因其能够保持复合物的天然构象。本研究中采用了两种常用的去污剂：β-DM 和皂苷（digitonin）。十二烷基麦芽糖苷（dodecyl maltoside）可溶解单个蛋白复合物，而皂苷则适用于较大蛋白复合物组装体的分析10。由于皂苷分子结构较大，无法进入紧密堆叠的基粒类囊体区域，因此仅能溶解类囊体膜中非堆叠区域3,11。这使其适用于基质类囊体和基粒边缘区域的分析。然而，当皂苷与氨基己酸（aminocaproic acid, ACA）联合使用时，该组合可溶解整个类囊体...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由芬兰科学院（项目编号 307335 和 303757）以及“太阳能转化为生物质”（SE2B）玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议（675006）提供资金支持。本实验方案基于参考文献3。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6-氨基己酸（ACA） | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| 丙烯酰胺（AA） | Sigma-Aldrich | A9099 | 注意：具有神经毒性！ |
| n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| 尿素 | VWR | 28877.292 | |
| 甘油 | J.T. Baker | 7044 | |
| 氟化钠（NaF） | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA 二钠盐 | J.T. Baker | 1073 | |
| 皂苷 | Calbiochem | 300410 | 注意：有毒！ |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva 考马斯亮蓝 G | Serva | 35050 | |
| β-巯基乙醇 | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS（过硫酸铵） | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED（四甲基乙二胺） | Bio-Rad | 1610801 | |
| （N,N'-亚甲基）双丙烯酰胺 | Omnipur | 2610 | |
| 甘氨酸 | Fisher | G0800 | |
| 预染蛋白 Marker，宽范围（7–175 kDa） | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon 15 ml 锥形离心管 | Corning | 352093 | |
| 双凝胶铸模装置，配有 10 × 8 cm 板 | Hoefer | SE215 | |
| 梯度混合器 SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T 型间隔片 | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| 样品胶梳，0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 垂直电泳系统 | Hoefer | SE250 | |
| IPC 泵 | Ismatec | ||
| 电源，PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 摇床-振荡器 | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell | Bio-Rad | 1651813 |
参考文献
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- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).
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- Aro, E. -M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
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