方法文章

通过蓝色天然凝胶电泳分析类囊体膜蛋白复合物

DOI：

10.3791/58369

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2018年9月28日

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1Molecular Plant Biology, Department of Biochemistry, University of Turku

本文内容

摘要

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一种利用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）和二维SDS-PAGE解析植物类囊体蛋白复合物结构与组成的实验方案被详细描述。该方案已针对 拟南芥, 但经过少量修改后也可用于其他植物物种。

摘要

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光合电子传递链（ETC）将太阳能转化为NADPH和ATP形式的化学能。嵌入类囊体膜中的四个大型蛋白复合物利用太阳能，通过两个光系统将电子从水传递至NADP+，并利用所产生的质子梯度合成ATP。光系统PSII、PSI、细胞色素b6f（Cyt b6f）和ATP合酶均为多亚基蛋白复合物，在类囊体膜中具有特定的空间取向和动态行为。通过温和去垢剂将这些复合物从保持完整性的膜中溶解出来，再经非变性凝胶电泳分离，可获得有关类囊体膜中蛋白复合物组成及其相互作用的有价值信息。蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种用于在天然且有功能的状态下分离蛋白复合物的分析方法。该方法既可用于后续精细结构分析所需的蛋白复合物纯化，也可作为解析蛋白复合物间动态相互作用的工具。该技术最初为线粒体呼吸链蛋白复合物分析而开发，现已针对类囊体蛋白复合物的研究进行了优化与改进。本文提供了一个详细且最新的实验方案，用于分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）中不稳定的光合蛋白复合物及其相互作用。

引言

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大型多亚基蛋白质复合物光系统 PSI 和 PSII、细胞色素 b6f 以及 ATP 酶共同协调光合作用光反应中 NADPH 和 ATP 的生成。在高等植物叶绿体中，这些复合物位于类囊体膜上，该膜是一种结构异质性的膜系统，由堆叠的基粒类囊体和非堆叠的基质类囊体组成。蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）是一种广泛用于分析大型多亚基蛋白质复合物天然且具有生物学活性形式的方法。该方法最初建立用于线粒体膜蛋白复合物的分离1，随后被优化用于从类囊体膜网络中分离蛋白质复合物3。该方法适用于：（i）纯化单个类囊体蛋白复合物以进行结构分析；（ii）确定蛋白复合物之间的天然相互作用；以及（iii）分析在不同环境信号变化下蛋白复合物整体组织结构的变化。

在分离之前，需使用精心选择的非离子型去垢剂从膜中分离蛋白质复合物，这类去垢剂通常较为温和，能够保持蛋白质复合物的天然结构。去垢剂含有疏水和亲水位点，在达到一定浓度（称为临界胶束浓度，CMC）以上时可形成稳定的胶束。当去垢剂浓度超过CMC时，会破坏脂质-脂质相互作用，从而使蛋白质复合物溶解。去垢剂的选择取决于目标蛋白质复合物的稳定性以及去垢剂的溶解能力。常规使用的去垢剂包括α/β-十二烷基麦芽糖苷（α/β-dodecyl-maltoside）和皂苷（digitonin）。在保持蛋白质复合物天然状态的前提下完成溶解后，通过离心去....

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方案

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1. Preparing BN Gel1,2,3

  1. Set up the gel caster with 8 cm x 10 cm plates (rectangular glass and notched alumina plate) according to manufacturer's instructions using 0.75 mm spacers.
  2. Place a gradient mixer on a stir plate and connect it with the peristaltic pump by a tubing. Attach a syringe needle to the other end of the tubing and place the needle between the glass and aluminum plate. Place magnetic stirrer to the "heavy" (H)-chamber.
  3. Prepare the 3.5% (v/v) and 12.5% (v/v) acrylamide (AA) solutions....

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结果

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一种具有代表性的二维氮化硼/SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统 图1 展示了十二烷基麦芽糖苷（digitonin）和β-DM溶解的类囊体蛋白复合物的分离及其蛋白质亚基组成的详细分析。digitonin溶解的类囊体的蛋白复合物图谱（上方水平胶顶部的） 图1A包含PSII-LHCII-PSI巨型复合体、两个大型PSII-LHCII超级复合体（sc）、PSI-LHCII超级复合体、PSI单体（m）以及PSII单体/Cyt b6f，松散结合的（L）-LHCII三聚体（图1A）。稍强的去垢剂β-DM可溶解整个类囊体膜（顶部的水平凝胶） 图1B)，但无法保留蛋白质复合物之间的弱相互作用。使用β-DM溶解类囊体通常会产生四种PSII-LHCII超级复合物（结合不同数量的LHCII天线）、PSII二聚体（d）和PSI单体、ATP酶、P.......

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讨论

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光合作用能量转换系统由嵌入类囊体膜中的大型多亚基蛋白复合物组成。本方案描述了一种利用非变性凝胶电泳（BN-PAGE）结合二维SDS-PAGE分析拟南芥（Arabidopsis thaliana）类囊体蛋白复合物的基本方法。该方案也适用于烟草和菠菜类囊体蛋白复合物的分析，但可能需要进行微小调整。

为了溶解膜蛋白复合物，通常使用非离子型去污剂，因其能够保持复合物的天然构象。本实验中采用了两种常用的去污剂：β-DM 和皂苷（digitonin）。十二烷基麦芽糖苷（dodecyl maltoside）可溶解单个蛋白复合物，而皂苷则适用于较大蛋白复合物组装体的分析10。由于皂苷分子结构较大，无法进入紧密堆叠的基粒类囊体区域，因此仅能溶解类囊体膜中非堆叠区域3,11。这使其特别适用于基质类囊体和基粒边缘区域的分析。然而，当皂苷与氨基己酸（aminocaproic acid, ACA）联合使用时，该组合可溶解整个类.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究由芬兰科学院（项目编号 307335 和 303757）以及“太阳能转化为生物质”（SE2B）玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议（675006）提供资金支持。本实验方案基于参考文献3。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6-氨基己酸（ACA）Sigma-AldrichA2504
BisTrisSigma-AldrichB4429
蔗糖Sigma-AldrichS0389
丙烯酰胺（AA）Sigma-AldrichA9099注意：具有神经毒性！
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷Sigma-AldrichD4641
TricineSigma-AldrichT0377
TrisSigma-AldrichT1503
SDSVWR442444H
尿素VWR28877.292
甘油J.T. Baker7044
氟化钠（NaF）J.T. Baker3688
EDTA 二钠盐J.T. Baker1073
皂苷Calbiochem300410注意：有毒！
Pefabloc SCRoche11585916001
Serva 考马斯亮蓝 GServa35050
β-巯基乙醇Bio-Rad1610710
APS（过硫酸铵）Bio-Rad161-0700
TEMED（四甲基乙二胺）Bio-Rad1610801
（N,N'-亚甲基）双丙烯酰胺Omnipur2610
甘氨酸FisherG0800
预染蛋白 Marker，宽范围（7-175 kDa）New England BiolabsP7708
Falcon 15 ml 锥形离心管Corning352093
双凝胶铸模器，配有 10 × 8 cm 板HoeferSE215
梯度混合器 SG5Hoefer
0.75 mm T 型间隔片HoeferSE2119T-2-.75
样品胶梳，0.75 mmHoeferSE211A-10-.75
Mighty Small SE250 垂直电泳系统HoeferSE250
IPC 泵Ismatec
电源，PowerPac HVBio-Rad164-5097
离心机Eppendorf5424R
摇床-振荡器BiosanBS-010130-AAI

PROTEAN II xi Cell		Bio-Rad1651813

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  2. Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN....

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