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方法文章

植物活性氧的催化清除 体内 通过阴离子型氧化铈纳米颗粒

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DOI：

10.3791/58373

⸱

2018年8月26日

 ,  ,  , 
1Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 2Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于合成与表征具有活性氧（ROS）清除功能的氧化铈纳米颗粒（nanoceria）的实验方案。 体内，通过共聚焦显微镜对植物组织中的纳米氧化铈进行成像，以及 体内 通过共聚焦显微镜监测纳米氧化铈对活性氧的清除作用

摘要

活性氧（ROS）的积累是植物非生物胁迫响应的一个标志性特征。ROS在 在植物中具有双重作用：低浓度时作为信号分子，高浓度时则成为有害分子。在胁迫条件下，植物体内活性氧（ROS）的积累可损伤代谢物、酶、脂质和DNA，导致植物生长和产量下降。氧化铈纳米颗粒（nanoceria）具有催化清除活性氧的能力 体内 为理解和生物工程改造植物非生物胁迫耐受性提供了一种独特工具。本文介绍了一种合成和表征聚丙烯酸包被的纳米氧化铈（PNC）、通过叶片薄层渗透将纳米颗粒与植物结合，以及监测其分布与活性氧清除能力的实验方案。 体内 使用共聚焦显微镜。目前用于调控植物中活性氧积累的分子工具仅限于模式物种，且需要繁琐的转化方法。本方案旨在 体内 ROS清除有望应用于具有宽大叶片和叶结构的野生型植物，例如 拟南芥.

引言

二氧化铈纳米颗粒（纳米铈）因其独特的催化活性氧（ROS）清除能力，被广泛应用于从基础研究到生物工程的各类生物体中1,2,3纳米氧化铈由于具有大量表面氧空位，可在两种氧化态（Ce3+ 和 Ce4+) 4,5,6. Ce3+ 悬空键能有效清除活性氧，而纳米尺度下的晶格应变则通过氧化还原循环反应促进这些缺陷位点的再生7纳米氧化铈最近也被用于植物功能的研究与工程改造8,9非生物胁迫下的植物会积累活性氧（ROS），导致脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤10。在 A. thaliana 植物， 纳米氧化铈对活性氧的催化清除 体内 在强光、高温和低温胁迫下提高植物光合作用8将纳米氧化铈施用于土壤还可增加小麦的地上部生物量和籽粒产量（Triticum aestivum)11；油菜（Brassica napus经纳米氧化铈处理的植物在盐胁迫条件下具有更高的生物量12.

纳米氧化铈提供 为生物工程师和植物生物学家提供一种基于纳米技术的工具，用于研究非生物胁迫响应并增强植物对非生物胁迫的耐受性。纳米氧化铈 体内 ROS 清除能力与植物物种无关，且其易于递送至植物组织的特性有望推动该技术在模式生物之外的广泛应用。与其它基于基因的方法不同，纳米氧化铈 无需构建过表达抗氧化酶的植物品系以增强活性氧清除能力13纳米二氧化铈对植物叶片的浸润 实用方法 用于基于实验室的研究。

本实验方案的总体目标是描述以下内容：1）带负电荷的聚丙烯酸纳米二氧化铈（PNC）的合成与表征；2）PNC在叶片细胞内的递送与追踪；3）监测PNC介导的活性氧清除作用 体内. 在本方案中，带负电荷的聚丙烯酸 纳米氧化铈（PNC）通过其吸收光谱、流体动力学直径和泽塔电位进行合成与表征。我们描述了一种简单的叶片表皮渗透法，用于将PNC递送至植物叶片组织。对于 体内 对叶肉细胞内纳米颗粒分布进行成像时，使用荧光染料DiI标记PNC（DiI-PNC），并通过共聚焦荧光显微镜观察纳米颗粒。最后，我们解释如何监测 体内 通过共聚焦显微镜检测PNC清除活性氧的能力。

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方案

1. 培养拟南芥（A. thaliana）植株

  1. 将拟南芥（A. thaliana）种子播种于装有标准土壤混合物的 5 cm × 5 cm 一次性花盆中。将 32 个花盆放入盛有水（约 0.5 cm 深度）的塑料托盘中，并将该装有植株的塑料托盘转移至植物生长室。
    1. 设定生长室条件如下：光合有效辐射（PAR）为 200 µmol/m²s，白天温度 24 ± 1 °C，夜间温度 21 ± 1 °C，相对湿度 60%，光照周期为 14 小时光照 / 10 小时黑暗。
  2. 在种子萌发一周后，每盆仅保留一株植株，进行间苗。注意选择每盆中大小相近的幼苗保留。
  3. 每隔两天通过向塑料托盘直接加入自来水的方式对花盆进行浇水。继续培养植株四周。拟南芥（A. thaliana）植株即可用于后续实验。

2. PNC 的合成与表征

  1. 称取1.08 g硝酸铈(III)，溶于50 mL锥形管中的2.5 mL分子生物学级水中。
  2. 称取4.5 g聚丙烯酸 ，溶于50 mL锥形管中的5 mL分子生物学级水中。
  3. 使用数字涡旋混合器，在2,000 rpm下充分混合上述两种溶液，持续15分钟。
  4. 将15 mL氨水溶液（7.2 M）转移至50 mL玻璃烧杯中。
  5. 在500 rpm搅拌条件下，将步骤2.3所得混合物逐滴加入氨水溶液中，并在室温下于通风橱中继续以500 rpm搅拌反应24小时。
  6. 用一张纸覆盖烧杯，以避免过夜反应过程中溶液大量挥发损失。
  7. 反应24小时后，将所得溶液转移至50 mL锥形管中，在3,900 × g条件下离心1小时，以去除可能存在的杂质和大颗粒聚集体。
  8. 将22.5 mL上清液转移至三个15 mL、截留分子量为10 kDa的超滤管中，并用分子级水补足至每管满，总体积稀释至45 mL。
  9. 使用台式离心机对上清液进行纯化：将上清液加入15 mL、截留分子量为10 kDa的超滤管中，在3,900 × g下离心15分钟。重复此步骤至少六次，以去除游离聚合物及其他试剂。
  10. 使用紫外-可见分光光度计在220–700 nm波长范围内测定每次循环中洗脱液的吸光度，以确认最终PNC溶液中无游离聚合物和其他试剂残留。
  11. 将收集的PNC溶液吸入5 mL注射器中，通过孔径为20 nm的一次性注射器滤器过滤，并将滤后PNC溶液收集至50 mL锥形管中。
  12. 取适量稀释后的最终PNC溶液置于塑料比色皿中，使用紫外-可见分光光度计在220–700 nm范围内测定其吸光度。PNC的吸光度峰位于271 nm处。
  13. 根据比尔-朗伯定律（A = εCL）计算其浓度：A为样品在峰值处的吸光度，ε为PNC的摩尔吸光系数（cm-1 M-1），L为光程长度（本方法中比色皿宽度为1 cm），C为所测纳米粒子的摩尔浓度。
  14. 使用粒径与Zeta电位分析仪测定所合成PNC的流体动力学直径及Zeta电位（图1）。
  15. 将最终的PNC溶液储存于冰箱中（4 °C），待后续使用。
    注意：有关PNC表征的更多实验细节，请参见Wu et al.8。

3. 使用DiI荧光染料标记PNC

  1. 在20 mL玻璃小瓶中，将0.4 mL的5 mM（58 mg/L）PNC与3.6 mL分子生物学级水混合，并以500 rpm速度搅拌。
  2. 将24 µL的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐染料溶液（DiI，2.5 mg/mL；用DMSO稀释）加入176 µL DMSO（二甲基亚砜）中，配制DiI染料溶液。
  3. 将DiI染料逐滴加入PNC溶液中，在室温下以1,000 rpm速度搅拌1分钟。
  4. 将所得混合液转移至15 mL的10 kDa滤膜离心管中，并用分子生物学级水补至管顶，使总体积稀释至15 mL。
  5. 使用15 mL的10 kDa滤膜，在台式离心机中以3,900 × g离心5分钟，去除DMSO及可能存在的游离DiI染料，从而纯化DiI标记的PNC（DiI-PNC）溶液。
    1. 至少重复步骤3.5五次。
  6. 将最终的DiI-PNC溶液通过孔径为20 nm的一次性注射式滤器过滤。
  7. 使用紫外-可见分光光度法测定最终DiI-PNC的吸光度，并根据比尔-朗伯定律计算其浓度（图2）。详见步骤2.13。
  8. 将溶液储存于4 °C冰箱中以备后续使用。

4. 用 PNC 渗透植物叶片

  1. 将0.1 mL浸润缓冲液（100 mM TES，100 mM MgCl2，pH 7.5，用HCl调节）加入0.9 mL的0.5 mM PNC或DiI-PNC溶液中，并涡旋混匀。使用10 mM TES浸润缓冲液作为阴性对照。
  2. 将0.2 mL的PNC或DiI-PNC浸润溶液转移至1 mL无针头无菌注射器中，轻敲以去除可能存在的气泡。
  3. 在用纳米颗粒浸润前，立即从生长箱中取出植物，以避免在室内光照条件下气孔关闭。
  4. 浸润前，使用叶绿素仪测量大小相似的A. thaliana叶片的叶绿素含量。每片叶片进行三次重复测量（每次重复包含至少三次读数）14。选择叶绿素含量相近的A. thaliana叶片用于浸润实验。
  5. 将新配制的PNC或DiI-PNC溶液缓慢浸润入叶片，将无针头注射器的尖端轻轻压在叶片下表面（远轴面），并推动活塞（图3A）。
  6. 使用精密擦拭纸轻轻擦去残留在叶片表面的多余溶液（图3B），并标记植物（图3C）。每组叶片使用新的精密擦拭纸。
  7. 将浸润后的A. thaliana植株置于实验台上，进行叶片适应及与PNC或DiI-PNC的孵育，持续3小时。
    注意：浸润后的A. thaliana植株即可用于后续实验（图3D）。

5. 共聚焦显微镜用叶片样品的制备

  1. 取豌豆大小的一团观察胶，揉成半径约1 cm的球体（图4A），然后将其在载玻片上摊开至厚度约为1 mm（图4B）。
  2. 使用直径为0.3 cm的打孔器，在载玻片上的观察胶中央切出一个圆形区域（图4C）。
  3. 将切割出的孔完全填充全氟十氢萘（PFD），以实现对叶片组织更深层且更清晰的共聚焦成像。
  4. 使用直径为0.2 cm的打孔器，从经DiI-PNC渗透处理的A. thaliana植株上采集叶圆片（图4D）。
  5. 将叶圆片置于盛有PFD的孔中，使渗透处理面（远轴面）朝上。
  6. 在叶圆片上方盖上方形盖玻片，并均匀轻压盖玻片，使其与观察胶上的孔完全密封，确保无气泡残留（图4E）。

6. 通过共聚焦显微镜成像叶片组织中的DiI-PNC

  1. 在倒置激光扫描共聚焦显微镜上使用 40X 物镜。
  2. 在 40X 物镜顶部滴加 2 至 3 滴 ddH2O。
  3. 将制备好的 DiI-PNC 渗透叶片样本载玻片放置在倒置的 40X 物镜上方。
    1. 确保盖玻片一侧与物镜上的 ddH2O 直接接触，而非载玻片玻璃面。
  4. 在显微镜下使用激光光源或明场观察，找到样本中的目标区域。
  5. 启动显微镜软件，并打开氩离子激光器（设定为 20%）。
  6. 设置针孔以采集小于 2 µm 的光学切片，并设置线平均为 4。
  7. 采用以下共聚焦显微镜参数对样本进行成像：514 nm 激光激发（30%）；Z-Stack 层厚：2 µm；PMT1：550–615 nm（用于 DiI-PNC 成像）；PMT2：700–800 nm（用于叶绿体成像）。
  8. 从不同个体中采集具有代表性的叶片样本共聚焦图像，至少进行三次生物学重复。

7. PNC成像 体内 共聚焦显微镜检测活性氧清除能力

  1. 分别在1.5 mL离心管中，用TES渗透缓冲液（pH 7.5）配制25 µM的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCFDA，一种用于指示总活性氧的染料）和10 µM的二氢乙啶（DHE，一种用于指示超氧阴离子的染料）。
  2. 使用直径为0.2 cm的打孔器，从已适应PNC渗透的A. thaliana植株叶片上采集叶圆片。
    1. 用镊子尖端在叶圆片上刺3至4个小孔，以加快染料加载过程。
  3. 将叶圆片分别转移至含有H2DCFDA和DHE的离心管中，在避光条件下孵育30分钟。
  4. 孵育结束后，用ddH2O清洗叶圆片三次，并将其置于载玻片上，加入观察用凝胶（见方案第5节）。
  5. 将载玻片置于共聚焦显微镜下，手动聚焦至叶肉细胞区域。具体操作详见方案第6节。
  6. 用UV-A（405 nm）激光照射叶圆片3分钟以诱导活性氧生成，并记录每个叶圆片的时间序列（"xyt"）中ROS信号强度的变化。
  7. 使用以下共聚焦显微镜参数对叶圆片进行成像：40倍水镜；496 nm激光激发；PMT1：500–600 nm（用于DHE和DCFDA染料检测）；PMT2：700–800 nm（用于叶绿体检测）。以仅用渗透缓冲液处理的植株作为阴性对照。

8. PNC 对 H 的清除作用2O2 体外

  1. 进行合成PNC的CAT（过氧化氢酶）模拟活性检测 体外 通过采用先前已发表文献中的方法3,8,15
  2. 加入45.4 µL的1x TES浸润缓冲液（10 mM TES，10 mM MgCl₂，200 µM乙酰丁香酮）2，pH 7.5（用 HCl 调节）、PNC（60 nM，3 µL）和 H2O2 （2 µM，1 µL）加入至孔板中（白色圆底96孔板），用移液器轻柔混匀。
  3. 加入10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪（工作浓度100 µM，0.5 µL）和辣根过氧化物酶（HRP；工作浓度0.2 U/mL，0.1 µL）至孔中，用移液器轻轻混匀，孵育30分钟。10-乙酰基-3,7-二羟基吩噁嗪与HRP反应2O2 在 HRP 存在下转化为试卤灵。
    1. 用铝箔包裹培养板，以避免孵育过程中光照。
    2. 使用反应缓冲液或水替代 H 制备阴性对照2O2.
    3. 除储备液外，其余溶液均在室温下配制。
  4. 孵育结束后，使用酶标仪在560 nm处检测吸光度，以刃天青作为指示剂来反映H₂O₂的水平2O2设置时间点为 0、2、5、10、20 和 30 分钟。

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结果

PNC 的合成与表征。
PNC 的合成、纯化与表征按照第 2 节实验方案中所述方法进行。图 1A 展示了硝酸铈、PAA、硝酸铈与 PAA 混合液以及 PNC 溶液的颜色变化。PNC 合成后，溶液颜色由白色变为浅黄色。使用 10 kDa 滤膜纯化后，采用紫外-可见分光光度计对 PNC 进行表征，在 271 nm 处观察到 PNC 的特征吸收峰（图 1B）。同时对最终洗脱液进行紫外-可见光谱检测，以确认未反应的化学物质已在纯化过程中被去除。采用粒径分析仪和zeta电位分析仪测定所合成PNC的流体动力学直径和zeta电位（图 1C）。

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讨论

在本方案中，我们描述了PNC的合成、表征、荧光染料标记以及纳米颗粒在植物叶肉细胞内的共聚焦成像，以展示其 体内 活性氧清除活性。PNC由硝酸铈和PAA溶液在氢氧化铵中混合合成。采用吸收光谱光度法对PNC进行表征，并利用比尔-朗伯定律测定其浓度。Zeta电位测定证实PNC表面带负电荷，有助于向叶绿体的递送。8. 用荧光DiI染料标记PNC可实现 体内 通过共聚焦显微镜对叶片叶肉细胞进行成像，结果显示纳米颗粒与叶绿体表现出高度的共定位。利用DHE和DCF荧光染料，我们证实PNC可作为超氧阴离子和活性氧（ROS）的有效清除剂。 体内.

合成PNC的方法是一种简单的逐步操作流程，可制备出粒径可控、带负电荷且具有活性氧清除能力的二氧化铈纳米颗粒16其他方法（如热解）需要高温和昂贵的化学实验设备21,22PNC 的合成与表征是一种...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作由加州大学河滨分校以及美国农业部国家食品与农业研究所Hatch项目（项目号1009710）资助，项目负责人：J.P.G。本材料基于美国国家科学基金会资助项目（项目号1817363）支持的工作，项目负责人：J.P.G。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
六水合硝酸铈(III)Sigma-Aldrich238538-100G
分子生物学级水，CorningVWR45001-044 
Falcon 50 mL 圆锥形离心管VWR14-959-49A
聚丙烯酸（分子量 1,800）Sigma-Aldrich323667-100G
Fisherbrand 数字式涡旋混合器Fisher Scientific02-215-370
Fisherbrand 数字式涡旋混合器配件：插入件固定器Fisher Scientific02-215-391
Fisherbrand 数字式涡旋混合器配件：泡沫插入件套装Fisher Scientific02-215-395
氨水溶液Sigma-Aldrich05002-1L
PYREX Griffin 烧杯，带刻度，CorningVWR13912-149 
RCT basicIKA3810001
Eppendorf 微型离心机 5424VWR80094-126
Amicon Ultra-15 离心过滤装置Millipore-SigmaUFC901024
Allegra X-30 系列台式离心机Beckman CoulterB06314
UV-2600 紫外-可见分光光度计ShimadzuUV-2600 120V
Whatman Anotop 10 注射式过滤器Sigma-AldrichWHA68091102
BD 一次性带鲁尔锁头端注射器Fisher Scientific14-829-45
Zetasizer Nano SMalvern PanalyticalZen 1600
1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲碳菁高氯酸盐Sigma-Aldrich42364-100MG
二甲基亚砜，ACS 级VWRBDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1Green Island Distributors, Inc5212601.CFL080P
Adaptis 1000ConvironA1000
TES，>99%（滴定法）Sigma-AldrichT1375-100G
氯化镁Sigma-AldrichM8266-1KG
Air-Tite 全塑料 Norm-Ject 注射器Fisher Scientific14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 精细作业擦拭纸Fisher Scientific06-666A
Carolina 观察凝胶Carolina132700
Corning 显微镜载玻片，单面磨砂，一端磨砂Sigma-AldrichCLS294875X25-72EA
带手柄的打孔器套装Fisher ScientificS50166A
全氟十氢化萘Sigma-AldrichP9900-25G
方形显微盖玻片，1 号VWR48366-045
Leica 激光扫描共聚焦显微镜 TCS SP5Leica MicrosystemsTCS SP5
2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯Sigma-AldrichD6883-250MG
二氢乙啶Sigma-AldrichD7008-10MG
Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Uvette 比色皿Sigma-AldrichZ605050-80EA
叶绿素计 Konica MinoltaSPAD-502

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植物非生物胁迫共聚焦显微镜叶片叶肉组织渗透紫外-可见分光光度计粒径分析仪流体动力学直径荧光DiI染料活性氧清除
植物活性氧的催化清除 体内 通过阴离子型氧化铈纳米颗粒
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