植物活性氧的催化清除 体内 通过阴离子型氧化铈纳米颗粒

摘要

本文介绍了一种用于合成与表征具有活性氧（ROS）清除功能的氧化铈纳米颗粒（nanoceria）的实验方案。 体内，通过共聚焦显微镜对植物组织中的纳米氧化铈进行成像，以及 体内 通过共聚焦显微镜监测纳米氧化铈对活性氧的清除作用

摘要

活性氧（ROS）的积累是植物非生物胁迫响应的一个标志性特征。ROS在 在植物中具有双重作用：低浓度时作为信号分子，高浓度时则成为有害分子。在胁迫条件下，植物体内活性氧（ROS）的积累可损伤代谢物、酶、脂质和DNA，导致植物生长和产量下降。氧化铈纳米颗粒（nanoceria）具有催化清除活性氧的能力 体内 为理解和生物工程改造植物非生物胁迫耐受性提供了一种独特工具。本文介绍了一种合成和表征聚丙烯酸包被的纳米氧化铈（PNC）、通过叶片薄层渗透将纳米颗粒与植物结合，以及监测其分布与活性氧清除能力的实验方案。 体内 使用共聚焦显微镜。目前用于调控植物中活性氧积累的分子工具仅限于模式物种，且需要繁琐的转化方法。本方案旨在 体内 ROS清除有望应用于具有宽大叶片和叶结构的野生型植物，例如 拟南芥.

引言

二氧化铈纳米颗粒（纳米铈）因其独特的催化活性氧（ROS）清除能力，被广泛应用于从基础研究到生物工程的各类生物体中^1,2,3纳米氧化铈由于具有大量表面氧空位，可在两种氧化态（Ce³⁺ 和 Ce⁴⁺) ^4,5,6. Ce³⁺ 悬空键能有效清除活性氧，而纳米尺度下的晶格应变则通过氧化还原循环反应促进这些缺陷位点的再生⁷纳米氧化铈最近也被用于植物功能的研究与工程改造^8,9非生物胁迫下的植物会积累活性氧（ROS），导致脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤¹⁰。在 A. thaliana 植物， 纳米氧化铈对活性氧的催化清除 体内 在强光、高温和低温胁迫下提高植物光合作用⁸将纳米氧化铈施用于土壤还可增加小麦的地上....

方案

1. 培养拟南芥（A. thaliana）植株

1. 将拟南芥（A. thaliana）种子播种于装有标准土壤混合物的 5 cm × 5 cm 一次性花盆中。将 32 个花盆放入盛有水（约 0.5 cm 深度）的塑料托盘中，并将该装有植株的塑料托盘转移至植物生长室。
   1. 设定生长室条件如下：光合有效辐射（PAR）为 200 µmol/m²s，白天温度 24 ± 1 °C，夜间温度 21 ± 1 °C，相对湿度 60%，光照周期为 14 小时光照 / 10 小时黑暗。
2. 在种子萌发一周后，每盆仅保留一株植株，进行间苗。注意选择每盆中大小相近的幼苗保留。
3. 每隔两天通过向塑料托盘直接加入自来水的方式对花盆进行浇水。继续培养植株四周。拟南芥（A. thaliana）植株即可用于后续实验。

2. PNC 的合成与表征

1. 称取1.08 g硝酸铈(III)，溶于50 mL锥形管中的2.5 mL分子生物学级水中。
2. 称取4.5 g聚丙烯酸 ，溶于50 mL锥形管中的5 mL分子生物学级水中。
3. 使用数字涡旋混合器，在2,000 rpm下充分混合上述两种溶液，持续15分钟。
4. 将15 mL氨水溶液（7.2 M）转移至50 mL玻璃烧杯中。<....

结果

PNC 的合成与表征。
PNC 的合成、纯化与表征按照第 2 节实验方案中所述方法进行。图 1A 展示了硝酸铈、PAA、硝酸铈与 PAA 混合液以及 PNC 溶液的颜色变化。PNC 合成后，溶液颜色由白色变为浅黄色。使用 10 kDa 滤膜纯化后，采用紫外-可见分光光度计对 PNC 进行表征，在 271 nm 处观察到 PNC 的特征吸收峰（图 1B）。同时对最终洗脱液进行紫外-可见光谱检测，以确认未反应的化学物质已在纯化过程中被去除。采用粒径分析仪和zeta电位分析仪测定所合成PNC的流体动力学直径和zeta电位（图 1C）。

讨论

在本方案中，我们描述了PNC的合成、表征、荧光染料标记以及纳米颗粒在植物叶肉细胞内的共聚焦成像，以展示其 体内 活性氧清除活性。PNC由硝酸铈和PAA溶液在氢氧化铵中混合合成。采用吸收光谱光度法对PNC进行表征，并利用比尔-朗伯定律测定其浓度。Zeta电位测定证实PNC表面带负电荷，有助于向叶绿体的递送。⁸. 用荧光DiI染料标记PNC可实现 体内 通过共聚焦显微镜对叶片叶肉细胞进行成像，结果显示纳米颗粒与叶绿体表现出高度的共定位。利用DHE和DCF荧光染料，我们证实PNC可作为超氧阴离子和活性氧（ROS）的有效清除剂。 体内.

合成PNC的方法是一种简单的逐步操作流程，可制备出粒径可控、带负电荷且具有活性氧清除能力的二氧化铈纳米颗粒¹⁶其他方法（如热解）需要高温和昂贵的化学实验设备^21,22PNC 的合成与表征是一种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
六水合硝酸铈(III)	Sigma-Aldrich	238538-100G
分子生物学级水，Corning	VWR	45001-044
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	VWR	14-959-49A
聚丙烯酸（分子量 1,800）	Sigma-Aldrich	323667-100G
Fisherbrand 数字式涡旋混合器	Fisher Scientific	02-215-370
Fisherbrand 数字式涡旋混合器配件：插入件固定器	Fisher Scientific	02-215-391
Fisherbrand 数字式涡旋混合器配件：泡沫插入件套装	Fisher Scientific	02-215-395
氨水溶液	Sigma-Aldrich	05002-1L
PYREX Griffin 烧杯，带刻度，Corning	VWR	13912-149
RCT basic	IKA	3810001
Eppendorf 微型离心机 5424	VWR	80094-126
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Millipore-Sigma	UFC901024
Allegra X-30 系列台式离心机	Beckman Coulter	B06314
UV-2600 紫外-可见分光光度计	Shimadzu	UV-2600 120V
Whatman Anotop 10 注射式过滤器	Sigma-Aldrich	WHA68091102
BD 一次性带鲁尔锁头端注射器	Fisher Scientific	14-829-45
Zetasizer Nano S	Malvern Panalytical	Zen 1600
1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲碳菁高氯酸盐	Sigma-Aldrich	42364-100MG
二甲基亚砜，ACS 级	VWR	BDH1115-1LP
Sunshine Mix #1 LC1	Green Island Distributors, Inc	5212601.CFL080P
Adaptis 1000	Conviron	A1000
TES，>99%（滴定法）	Sigma-Aldrich	T1375-100G
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266-1KG
Air-Tite 全塑料 Norm-Ject 注射器	Fisher Scientific	14-817-25
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 精细作业擦拭纸	Fisher Scientific	06-666A
Carolina 观察凝胶	Carolina	132700
Corning 显微镜载玻片，单面磨砂，一端磨砂	Sigma-Aldrich	CLS294875X25-72EA
带手柄的打孔器套装	Fisher Scientific	S50166A
全氟十氢化萘	Sigma-Aldrich	P9900-25G
方形显微盖玻片，1 号	VWR	48366-045
Leica 激光扫描共聚焦显微镜 TCS SP5	Leica Microsystems	TCS SP5
2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯	Sigma-Aldrich	D6883-250MG
二氢乙啶	Sigma-Aldrich	D7008-10MG
Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Eppendorf Uvette 比色皿	Sigma-Aldrich	Z605050-80EA
叶绿素计	Konica Minolta	SPAD-502