我们描述了一种具有多囊卵巢综合征样特征的精瘦型小鼠模型的建立过程 二氢睾酮缓释颗粒用于研究多囊卵巢综合征的病理生理学及其子代特征
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
高雄激素血症在女性生殖和代谢功能中起着关键作用，是多囊卵巢综合征的标志性特征。建立一种模拟患有多囊卵巢综合征女性的非肥胖型PCOS小鼠模型具有重要的临床意义。在本方案中，我们描述了这样一种模型。通过植入一段4毫米长的双氢睾酮（dihydrotestosterone, DHT）晶体粉末丸剂（丸剂总长度为8毫米），并每月更换一次，我们能够建立一种血清DHT水平比未植入DHT（no-DHT）小鼠高出两倍的PCOS样小鼠模型。该模型在不改变体重和体成分的情况下表现出生殖和代谢功能障碍。尽管这些PCOS样雌性小鼠表现出高度不育，但其中一小部分仍可怀孕，其子代成年后出现青春期延迟和睾酮水平升高。这种非肥胖型PCOS样小鼠模型是研究PCOS病理生理机制以及PCOS样母鼠子代特征的有力工具。
引言
高雄激素血症是根据美国国立卫生研究院（NIH）标准诊断多囊卵巢综合征（PCOS）的主要特征 雄激素过多与多囊卵巢综合征（AE-PCOS）学会。多囊卵巢综合征女性患者受孕困难，且妊娠并发症风险增加1即使成功怀孕，其雌性后代也会出现不良健康后果2,3已采用多种策略开发了动物模型4,5,6,7,8,9,10,11,12 并表现出多囊卵巢综合征（PCOS）的多种特征（无排卵和/或葡萄糖与胰岛素耐受性受损），伴有体重增加和肥胖，且与脂肪细胞体积增大及脂肪细胞重量增加相关。目前用于研究PCOS的动物模型主要有两种构建策略：一种是在出生后直接给予高水平雄激素（外源性雄激素注射....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
在此，我们提供了详细的双氢睾酮（DHT）缓释颗粒制备与植入操作流程，以及生殖与代谢功能检测方法。本研究所用小鼠为混合遗传背景（C57/B6、CD1、129Sv），饲养过程中提供食物与饮水。 随意摄取 在约翰斯·霍普金斯大学医学院百老汇研究大楼动物实验设施中，以24 °C、14/10小时明暗循环条件饲养。所有实验程序均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。
1. 建立类似多囊卵巢综合征的小鼠模型
- DHT颗粒制备
- 高压灭菌硅胶管以进行消毒。用剃刀片将硅胶管切割成15 mm长度。
- 用20 G针头将医用粘合硅胶注入管中，封闭一侧 钝化针头连接至3 mL注射器。应先将活塞从注射器中抽出，然后将粘合剂注入储液腔内。重新插入活塞并推动粘合剂，直至其开始从针头端露出。钝化针头可通过使用任何坚固的剪刀剪去20 G针头的尖锐端制成。导管内硅胶的长度应超过2 mm，以预留出产后修整余量。
- 过夜干燥；检查密封面是否存在气泡。无气泡者用于DHT颗粒，其余可用于无DHT对照颗粒。
- 在通风橱中制备DHT药丸时，应佩戴手套、口罩、护目镜和实验服，以避免DHT接触皮肤。
- 将DHT粉末倒入塑料称量舟中，然后将A1.1步骤中制备的带粘性帽的开口试管压入DHT粉末中。
- 可用拉直的大号回形针....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
血清双氢睾酮水平和葡萄糖耐量试验
根据方案 1.24–1.25 以及 2.9、3.0，采用 ELISA 和 LC-MS 两种方法检测采集血清中的双氢睾酮（DHT）水平。质谱法与 ELISA 所测得的 DHT 绝对值存在差异，但两种检测方法及各实验之间，DHT 插入组相对于无 DHT 插入组的相对倍数（约 2 倍）结果相似15,23,24（图 2A）。在 DHT 插入小鼠和无 DHT 插入小鼠中，从受孕前到妊娠期间 DHT 水平均显著升高，但在受孕前（交配前一天）和妊娠期（约 14 天）两个时间点，DHT 小鼠体内的 DHT 水平均比无 DHT 小鼠高出约 2 倍（图 2B<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
高雄激素血症是多囊卵巢综合征（PCOS）的关键特征。本方案中使用的血清双氢睾酮（DHT）水平（DHT 小鼠中的水平比无 DHT 小鼠高两倍）低于以往其他研究者报道的水平，并经过校准以成比例地模拟 PCOS 女性的状况5,19,20,21。与其他模型不同，该两倍 DHT 模型在植入 DHT 后长达 3.5 个月内，与无 DHT 小鼠相比，并不改变体重和全身组成23,24。这些成年植入 DHT 的小鼠通过持续外源性给予 DHT 进行维持。尽管全身组成未发生改变，但在瘦型 PCOS 女性中已观察到脂肪细胞结构和功能的改变20。因此有必要对不同脂肪储存部位进行细致检查。我们在 DHT 植入后一周内观察到动情周期受损
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（S.W. 获资助号 R00-HD068130）和巴尔的摩糖尿病研究中心：试点与可行性资助（S.W. 获资助）支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 结晶型 5α-DHT 粉末 | Sigma-Aldrich | A8380-1G | |
| 道康宁硅胶管 | Fisher Scientific | 11-189-15D | 内径 0.04 英寸/1 毫米 × 外径 0.085 英寸/2.15 毫米 |
| 医用硅胶粘合剂 | Factor II, InC. | A-100 | |
| 护目镜、实验服、手套和口罩 | |||
| 10 µL 无滤芯移液器吸头 | USA Scientific | 11113700 | |
| 用于涂片的显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Diff Quik 细胞染色试剂 | Fisher Scientific | NC9979740 | |
| 采血针 | Fisher Scientific | NC9416572 | |
| 3 mL 注射器 | Becton, Dickinson and Company (BD) | 30985 | |
| 配套针头：20 G | BD | 305176 | |
| 直尺：长度超过 10 cm，带毫米刻度 | |||
| 赛拉嗪 | Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise | NDC13985-704-10 | 100 mg/mL |
| 盐酸氯胺酮 | Hospira, Inc | NDC 0409-2051-05 | 100 mg/mL |
| 外科缝合钉 | AutoClip® System, Fine Science Tool | 12020-00 | |
| 胰岛素注射器 | BD | 329461 | 1/2 CC，低剂量 U-100 胰岛素注射器 |
| 套管针 | Innovative Research of America | MP-182 | |
| 显微镜 | Carl Zeiss Primo Star | 415500-0010-001 | 德国 |
| 耳标打孔器 | Fisher Scientific | 13-812-201 | |
| 睾酮大鼠/小鼠 ELISA 试剂盒 | IBL | B79174 | |
| DHT ELISA 试剂盒 | Alpha Diagnostic International | 1940 | |
| 稳豪型血糖仪 | Life Scan, Inc. | ||
| 稳豪型血糖试纸 | Life Scan, Inc. | ||
| Eppendorf 管 | Fisher Scientific | 05-402-18 | |
| 剃须刀片 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 克菌定 | Fisher Scientific | NC0089321 | |
| 手术垫单 | Fisher Scientific | 50587953 | 制造商：Andwin Scientific 56616018 |
| 聚维酮碘消毒液 | Walgreens | ||
| 3M Vetbond（正丁基氰基丙烯酸酯） | 3M Science. Applied to Life |
参考文献
- Palomba, S., de Wilde, M. A., Falbo, A., Koster, M. P., La Sala, G. B., Fauser, B. C. Pregnancy complications in women with polycystic ovary syndrome. Hum. Reprod. Update. 21 (5), 575-592 (2015).
- Doherty, D. A., Newnham, J. P., Bower, C., Hart, R. Implicati....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
