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一种用于测量大鼠渴求延长的条件性位置偏爱实验方案

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DOI：

10.3791/58384

⸱

2018年11月6日

 ,  ,  , 
1Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Grain College, Henan University of Technology

本文内容

摘要

本文描述了一种吗啡条件性位置偏爱（CPP）方案，用于测量大鼠渴求行为的孵育过程。

摘要

反复复发的一个主要原因是药物渴求。在戒断期间，药物渴求会逐渐增强，这一现象被称为药物渴求的“孵化”。本文介绍了一种用于测量大鼠药物渴求孵化的吗啡条件性位置偏好（CPP）实验方案。该方案主要利用躯体感觉线索建立吗啡的长期奖赏记忆。实验采用一个三室CPP装置，其两侧 chamber 的地板质地不同。首先，连续三天检测动物对两个侧室的基线偏好。随后，将动物腹腔注射吗啡或生理盐水，并分别置于其非偏好或偏好 chamber 中，持续45分钟。经过6天的条件化训练后，在末次训练后的不同时间点，测试动物对侧室的偏好情况，测试时长为15分钟。采用此范式，吗啡的奖赏记忆可持续至少18天。为验证上述方案是否能模拟渴求的增强，在戒断期间统计动物进入两个侧室的次数。结果显示，进入次数随时间增加，表明该CPP范式能够模拟渴求的孵化过程。未来的研究可利用此模型探讨长期记忆及渴求孵化背后的神经机制。

引言

药物成瘾是一种慢性疾病1，包含多个不同阶段2：暴食/中毒期、戒断/负面情绪期以及渴求/预期期。在药物成瘾循环的初始暴食/中毒阶段，个体因药物的强化效应而使用药物2。在戒断/负面情绪阶段，个体经历药物戒断带来的负面躯体和情绪状态，从而促进与成瘾发展相关的负性强化机制3。在渴求/预期阶段，个体在消退后重新恢复觅药行为，该过程可由与药物相关的线索或应激因素触发。在药物成瘾的动物研究中，条件性位置偏爱（CPP）范式被用于模拟药物的正向强化效应4,5,6，因此常用于建模药物成瘾循环的初始阶段。吗啡作为阿片类药物家族的一员，通过激活大脑中的阿片受体产生正向强化效应7,8。

条件性位置偏爱（CPP）范式基于经典（巴甫洛夫式）条件反射原理，常用于评估滥用药物（如吗啡）的奖赏效应4,5,9,10，因其在各实验室中易于实施而被广泛应用。典型的CPP范式包括三个阶段：预处理阶段、条件化阶段和测试阶段。在条件化阶段，药物的奖赏特性（非条件刺激）会与一种或多种中性的环境刺激配对；经过多次配对后，这些原本中性的环境刺激获得奖赏属性，成为条件刺激。在测试阶段，通过测量动物对与药物配对环境区域的偏好程度，反映其奖赏记忆的形成。因此，CPP范式也被用于研究学习与记忆的神经机制。为了建立稳定的吗啡长期奖赏记忆，本方案通过调整并优化影响CPP形成的多个变量，实现了高效的记忆巩固11。环境刺激由视觉、触觉和嗅觉线索组合而成，其具体构成及测试时间点可根据不同的研究目的进行调整。例如，在我们之前的一项研究中12，主要采用躯体感觉线索（不同质地的地面）作为环境刺激，以探究脑岛皮层尾部——一个具有躯体感觉功能的脑区——在长期奖赏记忆获取与维持过程中的作用。实验装置的设计以及大鼠被分配至偏好/非偏好侧的方式会影响CPP的建立。本方案采用三室装置而非两室装置，以避免强迫选择带来的干扰。两侧室的平衡性以及动物初始被分配进入的区域会影响CPP的获取4,13。因此，本方案采用对称设计的侧室结构，并对动物进行偏向性分配，以增强位置偏好的形成。长期奖赏记忆的维持需要在条件化阶段进行更多次的训练。为减少条件化阶段的时间成本，本方案每天进行两次训练，并对吗啡/生理盐水注射顺序进行交叉平衡，以避免在生理盐水配对训练中出现吗啡的急性戒断效应4。

复吸动物模型14已被建立用于模拟药物成瘾周期中的强迫性/预期阶段。条件性位置偏爱（CPP）也被用于研究模拟成瘾行为复燃的复吸过程5。复吸是药物成瘾治疗中的主要障碍之一。渴求是导致反复复吸的原因之一。在戒断期间，对药物的渴求会持续增强，这一现象被称为渴求的孵化15,16。渴求的孵化现象在药物自我给药范式中已被广泛研究，但在CPP范式中研究较少。利用CPP范式反映渴求孵化的设想最早由Li et al.17提出。他们的研究结果17显示，在戒断初期的14天内，低剂量吗啡（1 mg/kg 和 3 mg/kg）的CPP评分逐渐升高，而高剂量（10 mg/kg）则未出现该现象。类似地，注射低剂量可卡因的小鼠也表现出CPP评分随时间增加的趋势18。低剂量吗啡CPP评分的升高被用来反映孵化后的渴求状态17。在CPP范式中，动物停留在药物相关环境中的时间以及进入该环境的次数均被建议用于反映强化的条件性反应19。近期大多数研究采用CPP评分直接或间接反映动物在药物配对箱室中的停留时间，而往往忽略了侧箱进入次数这一参数。基于上述原因，我们的研究中采用了10 mg/kg的吗啡剂量，并测量了动物进入侧箱的次数11。结果显示，在戒断期间，大鼠进入侧箱的次数显著增加11。这表明CPP评分和进入次数均为评估药物渴求增强的有效参数，且CPP范式适用于模拟渴求孵化现象。然而，为了减少所需实验动物的数量，通常对同一组经历吗啡处理的动物进行多次重复测试；因此，在当前的被试内设计中无法排除消退效应的影响。采用相同实验方案的被试间设计可克服这一局限性。

以下描述的是建立长期奖赏记忆并模拟渴求增强的条件性位置偏爱（CPP）实验方案。简言之，在经历三天的预处理期后，大鼠接受为期六天的条件化训练，每天进行两次训练试验，随后在最后一次条件化试验后的不同时间点进行测试。在此CPP范式中，使用一个三室聚氯乙烯（PVC）箱作为CPP装置，装置地面保持水平。该装置由两个较大的黑色侧室（30 cm × 25 cm × 30 cm，长×宽×高）和一个中间白色室（11 cm × 25 cm × 30 cm，长×宽×高）组成，中间室具有白色光滑PVC地面。两个侧室的地面具有不同的纹理，作为躯体感觉线索：其中一个为网格状有机玻璃地面，另一个为粗糙PVC地面。

方案

实验操作均遵循《国家动物护理与使用指南》的规定，并已获得中国科学院深圳先进技术研究院动物实验伦理委员会批准。

1. 动物适应

  1. 从动物实验室获取成年雄性大鼠，并在12小时光照/12小时黑暗循环（光照时间为7:00至19:00）条件下饲养，自由饮水和进食。
  2. 在实验开始前两周内，每天两次与动物互动或轻拍以进行适应性操作。
  3. 将动物随机分配至生理盐水组或吗啡组。

2. 药物制备

  1. 将盐酸吗啡配制成 10 mg/mL，按 1 mL/kg 的剂量对大鼠进行腹腔注射（i.p.）。
  2. 作为对照，按 1 mL/kg 的剂量向大鼠注射生理盐水。

3. CPP 装置

  1. 构建一个三室条件性位置偏爱（CPP）装置，装置内具有不同的触觉（地面）线索，并测试大鼠对两个侧室的初始偏好。该装置由两个较大的黑色侧室（30 cm × 25 cm × 30 cm，长×宽×高）和一个中间白色室（11 cm × 25 cm × 30 cm，长×宽×高）组成，中间室地面为白色光滑PVC材质。两个侧室具有不同的地面纹理作为躯体感觉线索：一个为网格状有机玻璃地面，另一个为粗糙PVC地面。
  2. 调整触觉线索的组合方式，以确保装置无偏好性，因为有偏好的装置容易产生假阳性结果4。
    注意：CPP装置设计中的一个重要方法学问题是装置是否“有偏”或“无偏”4。如果一组未经训练的大鼠对任一侧室均无初始偏好，则认为该装置为“无偏”；否则视为“有偏”13。

4. CPP 实验步骤

  1. 根据以往研究建立吗啡诱导的条件性位置偏爱（CPP）范式21,22 通过调整条件化时间点、条件化次数、条件化试验周期以及检测时间点20. 下文简要描述了实验时间安排，如图所示 图1.
  2. 预处理阶段
    1. 在此阶段（第1至3天），移除隔板门以允许动物自由进入整个装置，并将动物放置于中央腔室。
    2. 记录动物活动15分钟。
    3. 计算第3天在两个侧室中停留的时间作为基线，并记为T0。
    4. 将进入任一侧室次数少于四次的大鼠从实验中剔除23 因为这些大鼠很可能存在总体健康状况方面的问题（例如，皮毛脏乱及长有肿瘤）。在整个实验期间检查动物的健康状况。
  3. 预处理阶段
    注：诱导期包括6天（第4至第9天）。
    1. 对吗啡条件化的大鼠进行注射 i.p. 分别在上午（9:00）和晚上（19:00）交替注射吗啡（10 mg/kg）或生理盐水（1 mL/kg）（间隔10小时）。
    2. 每次注射后立即将大鼠限制在其配对药物（非偏好）或配对生理盐水（偏好）的箱室中，持续45分钟图1B).
    3. 保持视频录制系统开启。
      注意：根据我们的经验，约有5%的大鼠在首次注射吗啡（10 mg/kg）后会出现呼吸抑制。在此情况下，为提高呼吸抑制大鼠的存活率，应将大鼠从条件化箱中取出，拉出其舌头，并将其置于其饲养笼内的白色纸巾上。
    4. 对于生理盐水条件化对照组，在上午时段使大鼠暴露于条件性位置偏爱装置的一侧 chamber 前，给予生理盐水注射（1 mL/kg）；在下午时段使大鼠暴露于另一侧 chamber 前同样给予生理盐水注射，每次暴露持续 45 分钟/次，操作方案与吗啡组一致。图1C).
  4. 测试阶段
    1. 在此阶段，移除隔板以使动物能够自由进入整个装置，将动物置于中央区域，使其自由探索整个装置15分钟。
    2. 记录它们在此15分钟内的活动。
    3. 进行三次后处理测试， 即， 测试1（T1）、测试2（T2）和测试3（T3），分别在最后一次条件化训练后处于无吗啡状态的第2天、第10天和第18天进行（图1A).
    4. 根据不同实验目标调整测试时间点。
      注意：为了尽量减少所需大鼠的数量，采用自身对照设计。然而，为排除消退效应的影响，需采用组间对照设计。

figure-protocol-1
图1：实验流程。 （A）整个条件化位置偏好（CPP）过程的实验流程。（B）吗啡组条件化阶段的实验时间安排。（C）生理盐水组条件化阶段的实验时间安排。 请点击此处查看该图的放大版本。

5. 数据分析

  1. 计算吗啡（生理盐水）组的条件化位置偏爱（CPP）得分：CPP 得分 = 在药物配对（非偏好）箱内停留的时间 / 在两个条件化箱内停留的总时间。
  2. 使用 SPSS 软件，采用适当的统计方法对 CPP 得分及侧箱进入次数进行数据分析。
  3. 所有行为学数据均以均值 ± 标准误（SEM）表示，其中 SEM 为均值的标准误。将 p<0.05 的值视为具有统计学显著性，并在图中用星号 (*) 和井号 (#) 标注。

结果

以下代表性结果表明，采用上述方案可成功建立吗啡条件性位置偏爱（CPP），并可维持长期的吗啡奖赏记忆（图2）。进入侧室的次数类似于自我给药范式中的有效反应次数，反映了吗啡的强化特性。使用该吗啡CPP范式可观察到进入次数增加（图3），表明渴求的孵育现象。

条件性位置偏爱记忆在最后一次条件训练后至少可维持18天。

使用吗啡组的21只大鼠和生理盐水组的10只大鼠检测长期奖赏记忆的表达。混合方差分析显示组别与测试之间的交互作用存在显著差异（F (3,87) = 4.973，p = 0.003），测试因素（F (3,87) = 18.237，p < 0.001）和组别因素（F (1,29) = 11.413，p = 0.002）也均存在显著差异。单因素重复测量方差分析发现，吗啡组在不同测试间存在显著差异（F (3,60) = 46.628，p < 0.001），而生理盐水组则无显著差异（F(3,27) = 1.576，p = 0.218）。采用Bonferroni校正的多重比较分析显示，吗啡组中三次测试与T0时间点之间均存在显著差异。如图2所示，吗啡奖赏记忆至少持续18天，并呈时间依赖性下降趋势。数据来源于先前已发表的研究11。

吗啡组侧室入口进入次数逐渐增加

吗啡组
为检验进入次数的变化趋势，采用混合设计方差分析，将组别（生理盐水配对组与吗啡配对组）设为组间因素，测试时间点（T0、T1、T2 和 T3）设为组内因素。结果显示，组别与测试时间的交互作用无显著差异（F (2.311,92.449) = 1.915, p = 0.147），组别主效应亦不显著（F(1,40) = 0.898, p = 0.349），但测试时间主效应显著（F(2.311,92.499)= 24.243, p < 0.001）。进一步采用最小显著差异法（LSD）进行多重比较分析显示，在吗啡配对组中，与T0相比，T1（p<0.001）、T2（p < 0.001）和T3（p < 0.001）的吗啡配对箱进入次数均显著增加。在生理盐水配对箱方面，T2与T0（p = 0.002）、T3与T0（p = 0.003）之间存在统计学显著性差异，而T1与T0之间差异不显著（p = 0.246），该模式与海洛因渴求的孵育现象相似24。总体而言，吗啡组动物进入侧室的次数随时间呈依赖性增加。

在 T1（t(1,21) = -2.833，p = 0.010）和 T2（t(1,21) = -4.458，p = 0.0002）时，大鼠进入吗啡配对 compartment 的频率高于生理盐水配对 compartment，但在 T3 时差异无统计学意义（t(1,21) = -0.471，p = 0.642）（双尾配对 t 检验）。

生理盐水组
与吗啡组类似，采用混合型方差分析，结果显示组别与测试之间的交互作用无显著差异（F(3,54) = 0.345，p = 0.793），测试因素（F(3,54) = 1.793，p = 0.159）和组别因素（F(1,18) = 0.151，p = 0.702）亦无显著差异。因此，生理盐水组进入侧室的次数随时间保持稳定。

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图2：条件性位置偏爱（CPP）记忆可持续至少18天，但随时间推移而减弱。 通过检测最后一次条件化后多个时间点（T1，2天；T2，10天；T3，18天）的CPP评分，评估吗啡组（n = 21）和生理盐水组（n = 10）的CPP记忆保持情况。所有CPP评分值均以均值±标准误（SEM）表示。###表示与生理盐水组相比p<0.001，##表示与生理盐水组相比p<0.01；***表示与吗啡组T0时间点相比p<0.001。 本图经修改自Sun et al., 201711。 请点击此处查看本图的放大版本。

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图3：吗啡组与生理盐水组进入侧室的情况。 在最后一次条件化处理后的多个时间点（T1，2天；T2，10天；T3，18天），对吗啡组（n = 21）和生理盐水组（n = 10）进入两个侧室的次数进行了评估，并与T0时间点进行比较。所有进入次数的数值均表示为均值 ± 标准误（SEM）。在吗啡组（A）中，进入与吗啡配对侧室的次数从T1到T3极显著增加，而进入与生理盐水配对侧室的次数仅从T2开始显著增加。对与吗啡配对和与生理盐水配对的隔室进行配对t检验，结果显示在T1和T2时间点均有极显著增加。在生理盐水组（B）中，两侧室的进入次数均无显著变化。本图经Sun et al., 201711修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文描述了一种使用吗啡条件性位置偏爱（CPP）范式的方法，通过体感线索作为条件化环境，在大鼠中建立长期奖赏记忆。为了形成这种长期奖赏记忆，对先前的方案21进行了改进，采用平衡型CPP装置，并将生理盐水和吗啡处理的时间间隔至少设置为10小时。此外，在条件化阶段增加了更多的条件化训练次数，以增强关联学习效果。除了CPP评分外，还记录了大鼠进入两侧舱室的次数，其进入次数增加的模式与自我给药范式中主动反应次数增加的模式相似。

影响上述条件性位置偏爱（CPP）范式建立的因素有多种。其中一个关键因素是实验装置的设计：大鼠通常应对两个侧室具有相似的偏好，以确保装置的平衡性。若装置不平衡，由于动物对某一侧室的初始偏好过高，可能会掩盖CPP的获得过程13。因此，在选择侧室地面质地或其他情境线索时，应避免动物对某一侧室产生极端偏好（即在任一侧室停留时间超过总时长的90%）。针对不同的实验目的，研究者可通过调整情境刺激来平衡CPP装置。对于平衡性良好的装置，通常采用两种实验设计方式4：一种是有偏设计，即将所有受试动物的药物处理均与非偏好侧室配对；另一种是无偏设计，即将一半动物的药物处理与非偏好侧室配对，另一半则与偏好侧室配对。两种设计均可建立CPP13，但采用后一种设计的研究17,25常因动物对某一侧室存在强烈偏好而不得不排除大量个体。鉴于个体对药物成瘾存在差异性26,27,28，本研究采用有偏设计，以避免健康个体被排除。有偏设计的一个局限性在于动物对侧室偏好的不一致性可能带来的影响。如图2所示，生理盐水组大鼠对初始非偏好侧室的CPP评分始终较低，因此通过设置生理盐水对照组可排除侧室偏好不一致对吗啡组CPP评分的影响。为避免偏好侧室出现天花板效应，本研究将初始非偏好侧室作为与吗啡配对的侧室。为避免新奇性和应激对侧室基础偏好的影响，共进行三次预处理阶段测试，并以第三次测试结果作为基线值。第四个因素是吗啡处理与生理盐水处理之间的间隔时间。在本范式中，我们选择至少10小时的间隔，以避免在生理盐水条件化期间出现戒断效应。吗啡的剂量也是一个重要因素。极低剂量的吗啡（如0.01 mg/kg）6无法诱导位置偏爱。10 mg/kg的剂量在大鼠中可诱导最高的CPP评分17，且在大鼠吗啡CPP研究中被广泛使用17,21,23。然而，腹腔注射（i.p.）10 mg/kg的吗啡可能导致约5%的大鼠出现呼吸抑制。未来的研究可考虑使用较低剂量的吗啡，例如5 mg/kg。对于其他物种（如树鼩），在建立CPP范式时应考虑其对药物的耐受性。由于树鼩对吗啡会快速产生耐受，因此在条件化阶段应使用更高的吗啡剂量29,30。

采用改进后的实验方案，经过6天的条件化训练后，可建立持续至少18天的长期奖赏记忆11（图2）。未来的研究应进一步检测条件位置偏好（CPP）是否能够维持更长时间。反复复吸是治疗药物成瘾的主要障碍。压力、环境线索以及药物本身均可诱发复吸。在CPP记忆消退后，该模型可用于模拟由压力或药物诱导的复吸过程。

在戒断期间，吗啡组动物进入与药物配对腔室的次数增加11（图3），这与自我给药范式中活性反应的增加相似。然而，在大鼠和树鼩中，采用条件性位置偏爱（CPP）范式时，进入与生理盐水配对腔室的次数也有所增加11，这与自我给药范式中的非活性反应不同。这种差异可能源于两种范式背后不同的原理：前者为经典条件反射，后者为操作性条件反射。此外，具有食物条件性位置偏爱经历的树鼩并未表现出进入次数增加的此类模式30。因此，吗啡经历动物对两侧腔室进入次数的增加被认为代表了药物渴求的孵化现象。尽管不能排除在同一受试个体中使用重复测量的局限性，但进入次数增加的模式在大鼠11、树鼩11,30和猴子31中均得到保留。尽管如此，未来研究在戒断期间强烈建议采用被试间设计，以排除重复测量带来的消退效应。

除了进入次数增加外，在戒断期间，使用低剂量吗啡（1 mg/kg 和 3 mg/kg）的条件性位置偏爱（CPP）得分也逐渐升高17。这些结果提示，CPP范式也可能用于模拟渴求的“孵化”现象。然而，CPP得分的升高也可能仅反映对条件刺激的记忆增强。在此方面，三室装置中侧室的进入次数——类似于自我给药范式中的主动反应——更接近于对药物的寻找行为或药物的奖赏效应。因此，考察在低剂量吗啡的大鼠CPP范式中，戒断期间进入侧室次数的变化趋势将具有重要意义。未来还需开展针对其他药物和小鼠模型的研究，以验证该现象是否在不同滥用药物或物种中具有保守性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（NSFC）31741058（Y.Z.）、深圳市人民政府资助（JCYJ20170818162613877 和 JCYJ20170818163217196）以及中国博士后科学基金资助 2017M622826（K.Z.）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吗啡沈阳第一制药厂
条件性位置偏爱装置/摄像头安来科技公司
SPSSIBM 公司

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