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方法文章

采用荧光细胞条形码技术的磷酸化流式细胞术用于单细胞信号通路分析与生物标志物发现

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DOI：

10.3791/58386

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2018年10月4日

1Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo, 2K. G. Jebsen Centre for B cell malignancies and K. G. Jebsen Centre for Cancer Immunotherapy, University of Oslo

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于在细胞水平上进行中至高通量蛋白质磷酸化事件分析的实验方案。磷酸化流式细胞术是一种强大的方法，可用于表征信号转导异常、鉴定和验证生物标志物，以及评估药物效应动力学。

摘要

异常的细胞信号转导在癌症的发生和发展中起着核心作用。大多数新型靶向治疗确实以蛋白质及其功能为靶点，因此细胞信号转导的异常可作为生物标志物，用于提示个体化治疗方案的选择。与DNA和RNA分析相比，蛋白质活性的变化能更有效地评估药物敏感性和耐药性的潜在机制。磷酸化流式细胞术是一种强大的技术，可在细胞水平上检测蛋白质的磷酸化事件，这一重要特征使其区别于其他基于抗体的方法。该方法能够同时分析多种信号蛋白。结合荧光细胞条形码技术，可在短时间内利用标准流式细胞仪硬件获取中到高通量的大规模数据集。磷酸化流式细胞术既可用于基础生物学研究，也广泛应用于临床研究，包括信号通路分析、生物标志物发现以及药效动力学评估。本文提供了一项详细的实验方案，以慢性淋巴细胞白血病细胞为例，对纯化的外周血单个核细胞进行磷酸化流式分析。

引言

磷酸化流式细胞术用于在单细胞水平上分析蛋白质磷酸化水平。该方法的总体目标是在特定条件下绘制细胞信号传导模式。通过利用流式细胞术的多参数能力，可以在外周血等异质细胞群体的不同亚群中同时分析多条信号通路。这些特性使该方法相较于其他基于抗体的技术（如免疫组织化学、酶联免疫吸附测定（ELISA）、蛋白质芯片和反相蛋白质芯片（RPPA））具有优势1。磷酸化流式细胞术可与荧光细胞条形码技术（FCB）结合使用，即用独特的荧光染料组合对单个细胞样本进行标记，使其能够混合后作为单一样本进行染色和分析2。这种方法可减少抗体消耗，通过将对照样本与处理样本合并提高数据的稳健性，并加快检测速度。合并后的FCB细胞群体可进一步分为多个小样本，并根据起始材料的量使用多达35种不同的磷酸化特异性抗体进行染色。因此，利用标准流式细胞仪硬件即可完成大规模的信号谱型分析实验。磷酸化流式细胞术已被应用于分析多种血液系统恶性肿瘤患者样本中的信号通路，包括慢性淋巴细胞白血病（CLL）3,4,5、急性髓系白血病（AML）6和非霍奇金淋巴瘤7。因此，磷酸化流式细胞术是一种强大的方法，可用于表征信号转导异常、识别和验证生物标志物以及评估药物效应动力学。

本文提供了采用磷酸流式细胞术分析慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者样本的优化实验方案（图1A）。内容包括基础信号通路表征、抗IgM/B细胞受体刺激以及药物干预的示例。文中详细描述了荧光细胞条形码（FCB）矩阵的构建方法。该方案可轻松适用于其他悬浮细胞类型。

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方案

所有供体在签署知情同意书后提供血液样本。本研究已获挪威东南地区医学与健康研究伦理委员会批准，涉及人类血液的研究均按照《赫尔辛基宣言》进行8。

注意：步骤 1-3 应在组织培养罩内的无菌条件下进行。

1. 从慢性淋巴细胞白血病患者血液样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs）

注意：人类血液应按照生物安全二级标准的规定进行操作。

  1. 用磷酸盐缓冲液（PBS: 136.9 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10.1 mM Na2HPO4 x 2H2O, 1.8 mM KH2PO4，pH 7.4）转移至50 mL离心管（每管30 mL）。
  2. 小心地将10 mL密度梯度介质铺层例如，使用10 mL移液管将Lymphoprep加入到试管底部。
  3. 在 4℃ 下以 800 × g 离心 20 分钟 °C. 此时，外周血单个核细胞可见于密度梯度介质层的上方。
  4. 使用巴斯德吸管将细胞转移至两个新的50 mL离心管中。用PBS洗涤两次（加满试管）。
  5. 350 × g 离心 15 分钟。弃去上清液，加入 3 mL PBS 重悬。
  6. 使用首选方法对细胞进行计数。
  7. 以 350 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。 注意： 步骤 1.8 至 3.2 为可选步骤，可直接进行至步骤 3.3。
  8. 用含10%二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FBS）重悬细胞，并分装至冻存管中，进行冷冻保存。
    注意： DMSO 对细胞具有毒性。细胞与 FBS/DMSO 混合后应尽快操作。细胞可在液氮中长期保存。

2. 细胞解冻

  1. 在37 °C水浴中快速解冻细胞。
    注意：DMSO对细胞有毒性。操作需迅速，以尽量减少细胞暴露于DMSO的时间。
  2. 用10 mL冷的罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI 1640，含补充的GlutaMAX，参见材料表）洗涤细胞一次。
  3. 以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
  4. 将细胞重悬于添加了丙酮酸钠、MEM必需氨基酸（按说明书以1×稀释度加入）和青霉素/链霉素以及10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中。将细胞转移至小型细胞培养瓶中，置于含5% CO2、37 °C的培养箱中孵育1小时，使细胞恢复状态。

3. 细胞的制备

  1. 使用首选方法计数活细胞。
  2. 将细胞转移至50 mL离心管中，在300 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
  3. 用添加1% FBS的RPMI 1640培养基（步骤2.2）重悬细胞，细胞浓度不超过50 × 106 个细胞/mL。
  4. 将所需体积的细胞悬液转移至96孔V型底板的孔中。
    注意：孔数应与待检测的实验条件数量相对应。时间进程刺激实验的样本来自同一孔。每时间点预留50 µL样本，另加50 µL死体积。保留用于补偿对照的样本（一个未染色样本和每种条形码染料各一个样本）。
  5. 将96孔板置于预热至37 °C的水浴中，静置细胞10分钟。

4. 细胞的刺激与固定

注意：步骤 4-8 请在实验台（i.e., 非无菌条件下）进行。

注意：固定缓冲液 I 的主要成分为多聚甲醛，具有毒性（可经吸入和皮肤接触），请小心操作。

  1. 在37 °C水浴中，为每个样本的96孔V型底板每孔加入60 µL固定缓冲液I。
    注意：细胞与固定缓冲液的比例应为1:1。为补偿37 °C下的蒸发损失，初始时固定缓冲液应过量加入。
  2. 可选：在刺激前用药物处理细胞。
  3. 将50 µL对照样本转移至固定板中，通过反复吹打混匀。
  4. 可选：通过向细胞中加入10 µg/mL抗IgM抗体启动刺激时间进程，通过反复吹打混匀。
  5. 在每个时间点将50 µL样本转移至固定板中，通过反复吹打混匀。
    注意：抗IgM诱导的信号转导通常在早期（数分钟内）启动。
  6. 在最后一个样本加入后，将固定板在37 °C下孵育10分钟。

5. 荧光细胞条形码（FCB）

注意： 条形码试剂列表见表1。

  1. 用 PBS 洗涤固定后的细胞 3 次（加满孔板孔）。
  2. 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  3. 在96孔V型底板中加入条形码试剂。用移液器加入5 µ每种条形码试剂按染色矩阵中所需组合数量，每孔加入 L 例如， 在 图1B每个样本将具有不同条形码浓度的独特组合。
  4. 将细胞重悬于190 µ加入1 mL PBS，转移至条形码板中，充分混匀。
    注意： 使用每种条形码试剂的最高终浓度对一个补偿样本进行染色，并保留一个未染色的样本。
  5. 室温避光孵育细胞20分钟。
  6. 用流式洗涤液（PBS、1% FBS、0.09% 叠氮化钠）洗涤染色后的细胞 2 次（加满孔板各孔）。
  7. 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  8. 加入 190 µ向细胞中加入流式洗涤液，并将条形码标记的样本合并至一个15 mL离心管中。将每份补偿对照分别转移至独立的1.7 mL离心管中。
  9. 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。

6. 细胞通透化以进行细胞内抗原染色

注意：固定缓冲液 III 的主要成分为甲醇，具有毒性（可通过吸入和皮肤接触），且易燃。请小心操作。

  1. 将 2 mL Perm Buffer III 转移至 15 mL 离心管中，置于 -20 °C 预冷，确保使用时呈冰冻状态。
    注意：Perm Buffer 可自实验开始起一直保存在 -20 °C 条件下。
  2. 将 1.5 mL 冰冷的 Perm Buffer 逐滴加入含条形码标记细胞群的 15 mL 离心管中，同时涡旋混匀；每个 1.7 mL 离心管中的补偿对照组则加入 100 µL，滴加过程中持续涡旋，以避免细胞聚集。
  3. 将细胞直接转移至 -80 °C 保存，至少放置 30 分钟。
    注意：实验在此步骤暂停是合理的。细胞在 Perm Buffer 中可于 -80 °C 长期保存。

7. 抗体染色

注意：有关已报道的磷酸化特异性抗体列表，请参见材料表。

  1. 将细胞从 -80 °C 转移至冰盒中。
  2. 用流式洗涤液洗涤 3 次。
    注意：加入过量的流式洗涤液以观察到细胞沉淀非常重要，例如，向条形码标记的细胞群体中加入 3 mL 流式洗涤液，每个补偿对照中加入 1 mL。
  3. 在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  4. 将条形码标记的细胞群体重悬于一定体积的流式洗涤液中，使每种磷酸化抗体染色时含有 25 µL 细胞悬液；将补偿对照重悬于 200 µL 流式洗涤液中。
  5. 在 96 孔 V 型底板中配制染色用抗体，每孔终体积为 50 µL。每孔加入用流式洗涤液稀释的磷酸化特异性抗体至终体积 10 µL，用流式洗涤液稀释的表面标志物抗体至终体积 15 µL，以及 25 µL 细胞悬液。
    注意：抗体稀释度应在实验前进行滴定优化，并设置同型对照。
  6. 将细胞在室温下避光孵育 30 分钟。
  7. 用流式洗涤液洗涤染色后的细胞 2 次（加满各孔）。
  8. 以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  9. 将细胞重悬于 150 µL 流式洗涤液中。

8. 补偿对照的制备

  1. 在进行抗体染色的同时，平行制备抗体偶联荧光染料的补偿对照。按照供应商的说明使用补偿微球。

9. 流式细胞术分析

注意：本实验可在配备高通量进样器（HTS）的流式细胞仪上进行。

  1. 使用未染色对照优化光电倍增管（PMT）电压。
  2. 运行补偿对照并计算补偿矩阵。
  3. 运行样本。事件速率应符合仪器的技术规格。

10. 门控策略与数据分析

  1. 将实验的 FCS 文件导入流式细胞术分析软件，如 FlowJo 或 Cytobank（https://cellmass.cytobank.org）。
  2. 设门策略
    1. 通过绘制SSC-A选择淋巴细胞 与 密度点图中的FSC-A。
    2. 显示淋巴细胞，并通过绘制SSC-A选择单细胞 与 FSC -W
    3. 通过绘制SSC-A来显示单个细胞并圈定细胞类型 与 表面标志物
    4. 用太平洋蓝显示细胞类型群 与 SSC-A 密度图，并根据其太平洋蓝染色强度选择不同的 FCB 群体（参见 图1A).
    5. 将磷酸化抗体通道与FCB通道作图，或以热图形式呈现（参见 图1A) 以展示磷酸化事件。
  3. 使用荧光中位强度（MFI）的反双曲正弦（arcsinh）值计算磷酸化信号 对照 同型对照（基础磷酸化水平，参见 图 1D），或经刺激后 与 未刺激的细胞群（参见 图1E).

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结果

磷酸流式细胞术实验方案的主要步骤如图所示 图1A在本示例中，CLL细胞使用Pacific Blue标记试剂在四个不同稀释浓度下进行染色。如图所示，通过组合三种条形码染料可实现三维条形码编码。 图1B随后通过依次对每个条形码试剂进行设门，对单个样本进行解卷积。 与 SSC-A（图1C）。条形码试剂的详细信息列于 表1.

根据此处描述的实验步骤，分析了慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者和正常对照组B细胞在不同条件下的磷酸化蛋白水平3。检测了B细胞受体（BCR）信号通路下游20种信号分子的基础磷酸化水平及刺激诱导后的磷酸化水平（所用磷酸化特异性抗体列表见材料表

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讨论

磷酸流式细胞术是一种用于检测单个细胞中蛋白质磷酸化水平的强大技术。由于该方法依赖于抗体染色，其应用受限于抗体的可获得性。此外，为了获得可靠的结果，所有抗体在使用前均需进行滴定和验证。有关磷酸化特异性抗体滴定的详细实验方案已在其他文献中描述。12在面板设计过程中，信噪比的考量至关重要。在本示例中，所有磷酸化抗体均偶联至 Alexa Fluor 647。该荧光染料通常可在低信号样本与高信号样本之间提供最佳分辨效果 与 高水平的磷酸化蛋白。此外，通过仅使用一种荧光颜色标记磷酸化蛋白，可留出其他通道用于荧光细胞条形码（FCB）和表面标志物染色。该面板设计可减少信号溢出至磷酸化蛋白检测通道。所有磷酸化抗体均偶联至同一荧光素，亦可简化数据分析。

在本方案中，所有抗体染色均在细胞固定和透化后进行。然而，需要注意的是，固定和透化步骤可能导致表面抗原变性或非特异性染色增加，从而对表面标志物的染色产生不利影响13。因此，使用者应针对具体情况逐一测试抗体的反应性。有关兼容克隆的信息资源也可能...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作在 Kjetil Taskén 教授的实验室完成，由挪威癌症协会和Kristian Gerhard Jebsen基金会资助。感谢Johannes Landskron和Marianne Enger对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640 GlutaMAXThermoFisher Scientific61870-010细胞培养基
胎牛血清ThermoFisher Scientific10270169细胞培养基添加剂
丙酮酸钠ThermoFisher Scientific11360-039细胞培养基添加剂
MEM非必需氨基酸ThermoFisher Scientific11140-035细胞培养基添加剂
LymphoprepAlere Technologies AS1114547密度梯度介质
抗IgMSouthern Biotech2022-01用于B细胞受体刺激
BD Phosflow 固定缓冲液 IBD557870固定缓冲液
BD Phosflow 穿膜缓冲液 IIIBD558050穿膜缓冲液
Alexa Fluor 488 5-TFPThermoFisher ScientificA30005条形码试剂
Pacific Blue 琥珀酰亚胺酯ThermoFisher ScientificP10163条形码试剂
Pacific Orange 琥珀酰亚胺酯，三乙基铵盐ThermoFisher ScientificP30253条形码试剂
补偿微珠由用户定义正确的种属反应性
Falcon管由用户定义
Eppendorf管由用户定义
96孔V型底板由用户定义与流式细胞仪兼容
离心机由用户定义适用于Eppendorf管、Falcon管和板
水浴锅由用户定义温度可控
流式细胞仪由用户定义配备高通量采样器（HTS）
名称公司货号备注
抗原
AKT (pS473)Cell Signaling Technologies4075克隆号: D9E
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少…, Haematologica, 101(2):e59-62
Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
ATF-2 (pT71)Santa Cruz Biotechnologysc-8398克隆号: F-1
参考文献: Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
BLNK (pY84)Beckton Dickinson Pharmingen558443克隆号: J117-1278
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少…, Haematologica, 101(2):e59-62
Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY223)/Itk (pY180)Beckton Dickinson Pharmingen564846克隆号: N35-86
参考文献: Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式…, Blood, 129(6): 759-770
Btk (pY551)Beckton Dickinson Pharmingen558129克隆号: 24a/BTK (Y551) 
参考文献: Kalland 等, 2012, 正常与转化细胞中近端信号通路的调控…, Exp Cell Res, 318(14):1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)Beckton Dickinson Pharmingen558134克隆号: 24a/BTK (Y551) 
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少…, Haematologica, 101(2):e59-62
CD3ζ (pY142)Beckton Dickinson Pharmingen558489克隆号: K25-407.69
参考文献: Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
Histone H3 (pS10)Cell Signaling Technologies9716克隆号: D2C8
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
IκBαCell Signaling Technologies5743克隆号: L35A5
参考文献: Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式…, Blood, 129(6): 759-770
LAT (pY171)Beckton Dickinson Pharmingen558518克隆号: I58-1169
参考文献: Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)Beckton Dickinson Pharmingen558577克隆号: 4/LCK-Y505 
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
MEK1 (pS298)Beckton Dickinson Pharmingen560043克隆号: J114-64
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κB p65 (pS529)Beckton Dickinson Pharmingen558422克隆号: K10-895.12.50
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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NF-κB p65 (pS536)Cell Signaling Technologies4887克隆号: 93H1
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
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p38 MAPK (pT180/Y182)Cell Signaling Technologies4552克隆号: 28B10
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
p44/42 MAPK (pT202/Y204)Cell Signaling Technologies4375克隆号: E10
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少…, Haematologica, 101(2):e59-62
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p53 (pS20)Cell Signaling TechnologiesNN克隆号: 多克隆
参考文献: Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS37)Cell Signaling TechnologiesNN克隆号: 多克隆
参考文献: Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS46)Cell Signaling TechnologiesNN克隆号: 多克隆
参考文献: Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达…, Blood, 109(6):2589-96
p53 (pS392)Cell Signaling TechnologiesNN克隆号: 多克隆
参考文献: Irish 等, 2007, Flt3 Y591重复与Bcl-2过表达…, Blood, 109(6):2589-96
PLCγ2 (pY759)Beckton Dickinson Pharmingen558498克隆号: K86-689.37
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Rb (pS807/pS811)Beckton Dickinson Pharmingen558590克隆号: J112-906
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
S6核糖体蛋白 (pS235/236)Cell Signaling Technologies4851克隆号: D57.2.2E
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
SAPK/JNK (pT183/Y185)Cell Signaling Technologies9257克隆号: G9
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Pollheimer 等, 2013, 白细胞介素-33驱动促炎性内皮细胞…, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2):e47-55
SLP76 (pY128)Beckton Dickinson Pharmingen558438克隆号: J141-668.36.58 
参考文献: Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)Beckton Dickinson Pharmingen612597克隆号: 4a 
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式…, Blood, 129(6): 759-770
STAT3 (pY705)Beckton Dickinson Pharmingen557815克隆号: 4/P-STAT3
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
STAT4 (pY693)Zymed/ThermoFisher Scientific71-7900克隆号: 多克隆
参考文献: Uzel 等, 2001, 通过流式细胞术检测细胞内磷酸化STAT-4, Clin Immunol, 100(3): 270-6
STAT5 (pY694)Beckton Dickinson Pharmingen612599克隆号: 47/Stat5(pY694)
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
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Myklebust 等, 2017, B细胞受体信号传导的不同模式…, Blood, 129(6): 759-770
STAT6 (pY641)Beckton Dickinson Pharmingen612601克隆号: 18/P-Stat6
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SYK (pY525/Y526)Cell Signaling Technologies12081克隆号: C87C1
参考文献: Myhrvold 等, 2018, 单细胞磷酸化蛋白水平分析.., Oncotarget, 9(10):9273-9284
Parente-Ribes 等, 2016, 脾酪氨酸激酶抑制剂减少…, Haematologica, 101(2):e59-62
ZAP70/SYK (pY319/Y352)Beckton Dickinson Pharmingen557817克隆号: 17A/P-ZAP70
参考文献: Skånland 等, 2014, T细胞通过CD2和CD28共刺激…, Biochem J, 460(3):399-410
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