逆向解剖与DiceCT揭示灵长类面部演化中难以察觉的数据

摘要

面部表情是由表情肌产生的视觉交流方式。本文介绍了反向解剖和DiceCT这两种新技术的操作方案，以全面可视化和评估表情肌。这些结合使用的技术可同时检测表情肌的形态学和生理学特征，从而确定其功能特性。

摘要

许多哺乳动物类群会通过面部表情或面部展示来传达社会性或情绪意图，以此作为在近距离内与同种个体进行视觉交流的方式。这些面部展示由表情肌的收缩实现，表情肌是附着于面部真皮层的骨骼肌。逆向解剖法是一种有效但具有破坏性的方法，通过将完整的面部组织从颅骨上剥离并反向观察表情肌，从而揭示其形态结构。DiceCT是一种用于可视化骨骼肌（包括表情肌）并分离单个肌束以进行定量测量的新技术。此外，DiceCT提供了一种非破坏性的肌肉可视化手段。结合使用逆向解剖法与DiceCT技术，可用于评估表情肌系统的进化形态及其潜在的收缩强度与速度。本研究进一步证明，DiceCT能够准确且可靠地可视化表情肌，同时结合逆向解剖法，为表情肌的取样提供一种非破坏性方法。

引言

拟态肌，即面部表情肌，属于骨骼肌，在哺乳动物纲（Mammalia）中广泛存在¹。尽管大多数哺乳动物的骨骼肌附着于明确的骨性标志点，拟态肌的独特之处在于其主要附着于面部、头皮以及颈部腹侧的皮肤^1,2,3,4。拟态肌的收缩可使"面部面具"产生表情或面部展示，以传达社会与情绪意图；同时调节用于摄食、呼吸及发声的眼、鼻腔和口腔括约肌的大小与形状；并构成大多数哺乳动物近距离视觉交流机制的重要组成部分^2,3,4,5。在哺乳动物中，由拟态肌产生的面部展示有助于通过向同种个体传递发送者的情绪与行为意图，从而调节和维持领地边界、社会纽带以及群体结构^2,5。

在哺乳动物中，灵长类动物的部分特征是在整个生命周期中表现出高度的社会行为，所有物种均生活在社会群体中^2,5虽然某些物种（如夜行性的婴猴和懒猴）可能仅以母子组合的小群体生活，但其他物种（如昼行性的猕猴和狒狒）则可能形成超过100只个体的群体。⁶无论社会群体的规模如何，灵长类动物常使用与等级和领地性相关的刻板社会行为，这些行为通常包含面部展示成分。面部展示是维持群体成员间联系、优势等级、繁殖以及日常生活中交流过程的一部分，尤其在昼行性物种中更为显著。^2,5,7虽然长期以来人们已经清楚面部肌肉用于产生这些面部表情，但直到最近才逐渐明确面部肌肉的形态和生理特征与社会因素功能需求相关联。^2,8先前对系统发育和行为多样性广泛的灵长类动物的研究表明，生活在大型复杂社会群体中的昼行性物种往往具有较多的独立面部表情，这些表情主要涉及嘴唇、眉毛和眼睑的运动，并且在嘴唇和眼眶区域聚集了较多的面部肌肉。⁹相比之下，关于生活在小型群体中的夜行性物种的研究较少，但这些物种具有大量独立的面部肌肉，其附着点位于外耳和嘴唇周围，可能与耳朵和嘴唇的运动有关（在某些夜行性物种中已记录到在与同种个体发生对抗性互动以及定位声音时会出现此类动作）。^2,9,10,11此外，人类在表情肌中慢肌球蛋白纤维所占的比例相对高于恒河猴和黑猩猩，这可能与 "减缓速度" 在发音过程中用于唇部周围人类仿生肌肉的收缩，或指这些肌肉的总体抗疲劳能力⁸.

人类可以说是所有灵长类动物中社会性最强的物种，并已将语言作为社会交流的组成部分之一。然而，人类仍然使用面部表情作为视觉交流的方式，并在灵长类动物中拥有已知最丰富的面部表情展示能力。为了更全面地理解人类及灵长类动物社会行为演化的相关因素，深入认识灵长类动物表情肌的形态学与生理学特征显得尤为必要。由于表情肌直接附着于皮肤，且在某些物种中可能异常纤薄而难以观察，我们开发出一种独特的方法，用于可视化此类肌肉结构，既可用于记录其宏观存在与否及其附着点，也可用于取样以进行显微解剖学处理。

"逆向解剖"是一种通过将整个面部组织从头部分离以保留面部表情肌并增强观察细微肌肉可见度的方法。由于逆向解剖是一种破坏性过程，稀有且珍贵的标本并不总是可用于该方法。DiceCT是一种有效的方法，能够可视化即使在极小型物种中也存在的多种面部表情肌^12,13,14。该方法可与逆向解剖联合使用，或用于无法进行解剖的稀有珍贵标本，从而在无需移除面部组织的情况下提供大量信息，避免了"逆向解剖"的需要^12,13,14。本实验方案描述了一套将逆向解剖与DiceCT相结合的方法，用于研究灵长类动物的面部表情肌系统。

方案

由于这些实验程序所使用的动物均因动物园内的自然原因死亡，或在研究实验室中因不相关研究而被处死，因此这些方案无需经过动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 逆向解剖

注意：逆向解剖方案适用于从小型哺乳动物（如实验小鼠）到大型陆生哺乳动物（如家马）的多种物种。当仿肌肌肉与表层真皮一同保留，而非留在颅骨上时，通常能获得最佳的保存和可视化效果。参见 图 1-3。

1. 在进行解剖操作前，将头部从脊柱的颈椎部分分离。如果尸体处于冷冻状态，请先完全解冻后再进行此步骤。
   1. 无论保存状态如何，触诊颅骨的枕部区域以及第二颈椎（C2）的棘突。注意第一颈椎（C1）无棘突，因此通过触诊C2和颅骨枕部区域可大致确定C1的位置。
   2. 使用手术刀，在颅骨枕部区域与C2之间做水平切口，以开始在C1处将颅骨与脊柱分离。持续切割直至颅骨完全与脊柱分离。
   3. 若标本为新鲜且未固定的，步骤1.1.2–1.2需在较短时间内完成。此外，若脑组织仍完整保留在颅腔内，神经组织可能迅速发生坏死，因此强烈建议在标本保持未固定状态时将其脑组织取出。
      ​注意：作为可选步骤，可将标本浸入10%缓冲福尔马林中固定24小时，以利于从容地进行数据采集。
   4. 若标本已用乙醇或10%缓冲福尔马林固定，则需用清水冲洗数小时。
2. 做切口以将面部筋膜从颅骨上松解。若在尸检过程中脑组织及覆盖的颅顶骨已被移除，则在颅骨眉间区域附近做一条切口，并在颅骨尾侧（后部）颅骨结构完整的区域做另一条切口。
   1. 待标本经数小时冲洗后，用纸巾轻轻擦干，并转移至工作台。
   2. 触诊颅骨尾侧（后缘）的枕外隆凸，该结构标志颅骨与脊柱的连接区域。对于大标本使用#4手术刀，小标本使用#3手术刀，从枕外隆凸开始沿中线做切口，向前（头侧）经过顶骨和额骨区域、眶区及两眼之间，沿鼻区向下，直至鼻孔之间的外鼻区域。
   3. 在下颌骨的下中切牙之间做切口，并向尾侧（向后）延伸至锁骨方向。
   4. 选择面部筋膜的一侧进行移除，保留另一侧原位不动。
3. 将面部筋膜的一侧从颅骨上松解。
   1. 从枕部区域开始，使用手术刀将面部筋膜（包括表情肌）从颅骨的枕骨部分切开，同时将筋膜向前（头侧）及侧方牵拉。将枕肌从颅骨上切下，但在颅骨上保留少量肌肉组织，以便在面部筋膜移除后仍能观察其附着点。通过在骨性或软骨性颅骨上保留部分肌肉，可保存附着结构，供后续记录使用。
   2. 当操作至外耳区域时，定位耳肌群。切断这些肌肉，但每块肌肉在颅骨上保留一小部分。切断连接外耳与颅骨的弹性软骨。
   3. 继续向前牵拉筋膜，并在逐个松解各表情肌时，于颅骨上保留每块肌肉的一小部分。
   4. 当一侧颅骨的面部筋膜完整剥离后，将其平放于空气中暴露1小时（如实验大鼠等小标本）至3小时（如家马等大标本），使肌肉面朝上。此步骤可使面部筋膜上的部分结缔组织脱水，增强肌肉与结缔组织之间的颜色对比。
4. 去除足够的结缔组织以清晰显示肌肉结构。
   1. 使用#3手术刀、镊子和显微剪，拔除分隔各表情肌之间的结缔组织。
   2. 为了在本"逆向解剖"中暴露表情肌的浅层，需轻柔地将深层肌肉与浅层肌肉抬起并分离，同时去除包围浅层肌肉的结缔组织。处理后的面部筋膜可重新放回福尔马林中保存，操作可在此暂停，再进入后续解剖或染色步骤（步骤2）。在后续每一步解剖操作之间，应使面部筋膜充分干燥，以便于清晰区分结缔组织与肌肉组织。

2. DiceCT 染色流程

注意：如果要使用 DiceCT 技术，标本必须用 10% 缓冲福尔马林固定，以在漫长的染色过程中保存组织。如果标本尚未固定，请将其放入容器中，加入足量的 10% 缓冲福尔马林以完全浸没所有组织，并静置 48 小时。

1. 配制用于染色面部模型的1.75% (m/v) 卢戈氏碘液（I₂KI）。
   ​注意：需配制足量的I₂KI溶液，以确保能完全浸没所选容器中的面部模型。若需调整溶液体积，请按相同比例同步增减步骤2.1.1和2.1.2中溶质与溶剂的用量。
   1. 在通风橱内，将3.50 g碘化钾（KI）加入盛有200 mL蒸馏水的大玻璃烧杯中，用玻璃搅拌棒搅拌至完全溶解。
      警告：碘化钾（KI）可能引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激或损伤。操作时应佩戴护目镜，并在通风橱中进行。
   2. 缓慢加入1.75 g碘晶体（I₂），边加边搅拌，直至完全溶解。此过程需数分钟。
      警告：碘晶体（I₂）可能引起眼睛、皮肤和呼吸道刺激或损伤。操作时应佩戴眼部和皮肤防护装备，并在通风橱中进行。
   3. 使用孔径为11微米的滤纸将溶液过滤至棕色玻璃瓶中，以去除未溶解的晶体，避免染色不均。
      警告：该溶液对水生生物具有高毒性。请勿将溶液倒入下水道。若发生泄漏，应使用5% (m/v) 硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）将水溶液中的三碘化物（I₃^-）还原为碘离子（I^-）进行中和。请查阅所在机构的废弃物处理政策，并据此妥善处置含碘废液。
2. 对面部模型进行染色。
   1. 将面部模型切面朝下放入一个足够大的棕色玻璃容器或避光容器中，确保模型可自然展开并完全浸入溶液中，同时避免光照。
   2. 将卢戈氏碘液倒入容器，直至完全浸没面部模型。可能需要使用重物压住模型，防止其上浮。密封容器以防止溶液蒸发并避免光照。
   3. 将容器持续置于电动摇床或定期手动摇动，以促进染色均匀，并防止晶体沉淀，持续至少两周。若肌肉束染色仍不足，可更换为新鲜卢戈氏碘液继续染色。
   4. 两周后，将面部模型从溶液中取出。用少量蒸馏水冲洗模型两面。用湿润的纸巾包裹面部模型，放入密封塑料袋中静置至少24小时，使其轻微干燥后再进行下一步操作。
      注意：本方案可暂停最多一周，期间需确保面部模型保持轻微湿润。

3. DiceCT 扫描

1. 准备用于CT扫描的面部模型。
   1. 将面部模型固定在低密度材料（如插花泡沫）上，以消除模型上的任何褶皱，并限制扫描过程中模型轻微干燥引起的移动。使用木质牙签将面部模型固定在泡沫上。
2. 设置CT扫描参数并进行扫描。
   1. 此类扫描应使用高分辨率，因为较低分辨率会遮蔽细小的束状结构。层间间距和像素间距离应设置为约0.05 mm。
   2. 在高分辨率X射线计算机断层扫描仪上对已固定的面部模型进行扫描。
   3. 如果由于染色过深导致束状结构无法完全显示，可将面部模型放入10%福尔马林溶液或5%硫代硫酸钠溶液中，以去除部分染色；如果染色不足，则将其重新放入卢戈氏碘液中。调整染色后，再次扫描面部模型。持续进行必要的调整并重复扫描，直至束状结构能够被完全清晰显示。

4. 准备用于长期保存的面罩。

1. 使用化学方法中和口罩上的碘染色剂，去除染色过程中产生的颜色残留。
   1. 将染色后的口罩放入5% (m/v) 硫代硫酸钠溶液中，以化学方法中和标本。此过程可能需要数小时至数天。在脱色过程中需定期搅动。
   2. 将脱色后的口罩重新放回10% 甲醛溶液中以进行保存。如果染料仍持续从标本中渗出并进入溶液，需更换变色的甲醛溶液为新鲜甲醛溶液，直至溶液保持清澈，以实现长期保存。

结果

本部分展示了通过结合“反向解剖”与 DiceCT 扫描技术所获得的面部肌肉形态学结果示例。采用“反向解剖”方法制备面部肌膜，有时能够比传统解剖方法更完整地呈现表情（面部）肌肉的结构。该方法适用于多种体型的灵长类动物，从小型小型灵长类动物（例如普通狨猴 Callithrix jacchus，图4），到大型灵长类动物如黑猩猩 Pan troglodytes（图5），以及中等体型的恒河猴 Macaca mulatta（图6）。传统解剖方法在具有发达表情肌的大型灵长类动物中可能效果良好；然而，传统的“前入路”解剖方法在面部肌肉纤细的小型灵长类动物中可能效果不佳。在这些情况下，部分面部肌肉可能与周围结缔组织难以区分，从而在解剖过程中丢失。

讨论

按照"逆行解剖"方案的步骤操作，通常可获得一个面部组织标本，可逐步且系统地进行解剖，以暴露表情肌，且不受头部大小的影响。操作过程中尤其需要注意缓慢进行，并持续评估肌肉是否被意外完全切断，这一点在体型较小的物种中尤为重要。

为了确定肌肉组织的位置，尤其关键的是要使正在制作的标本分阶段干燥，以便持续区分结缔组织与肌肉组织。如果结缔组织残留在标本上，肌肉组织将无法显现，因此尽可能去除全部结缔组织非常重要。

尽管逆向解剖法为评估灵长类动物（或其他哺乳动物）的面部肌肉提供了一种可靠且详尽的方法，但该方法具有破坏性，且需要大量时间和专业知识^2,11。DiceCT 为评估灵长类动物面部肌肉提供了另一种方法，且已成功用于可视化其他骨骼肌组织^17,18。在逆向解剖中可见的许多肌肉在 DiceCT ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nikon XTH 225 ST	Nikon		无目录编号
10% 缓冲福尔马林	菲舍尔科技公司	SF98-4
碘，ACS 级	Lab Chem, Inc.	LC155901
硫代硫酸钠	Acros Organics	AC450620010
碘化钾	Alfa Aesar	A1270430