体外3D 球形培养模型小鼠前列腺叶的鉴定、组织学特征及解剖

Summary

基因工程鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。在这里, 我们提出了一个协议, 以识别和解剖小鼠泌尿生殖系统前列腺裂片, 区分他们的组织学, 并分离和培养的原发性前列腺细胞体外作为球体的下游分析。

Abstract

基因工程鼠模型 (GEMMs) 是研究大多数类型的人癌症, 包括前列腺癌 (PCa) 的有效的前临床模型。了解小鼠前列腺的解剖和组织学, 对于有效使用和正确描述这种动物模型是很重要的。小鼠前列腺有四不同的裂片, 各有各自的特点。本文对小鼠前列腺叶的解剖和鉴定方法进行了分析。解剖后, 前列腺细胞可以进一步培养,在体外为机械的理解。由于小鼠前列腺原代细胞在体外培养时往往失去正常的特征, 我们在此概述了一种分离细胞并将其生长为3D 球形培养的方法, 这对保持生理细胞的特征。这些3D 文化可用于分析近生理条件下的细胞形态和行为, 调查在疾病发展和进展过程中所涉及的关键蛋白质和通路的变化水平和定位, 并观察对药物治疗的反应。

Introduction

科学界一直在试图阐明几十年来人类癌症发展的复杂机制。虽然潜在的关键参与者和药物靶点的识别始于患者细胞和组织研究, 但这种发现的转化应用往往需要使用临床前动物模型。自从建立了人类癌症联盟 (MMHCC) 的老鼠模型, 一个试图描述和统一小鼠癌症特征的委员会以来, 利用基因工程小鼠模型 (GEMMs) 来建模人类癌症的模型已经稳步上升。模型为全世界科学家^1,2。老鼠模型满足了机械研究的需要, 在临床前研究的大多数类型的癌症, 了解的发展, 进展, 反应治疗和后天抵抗³。

前列腺癌是男性最常见的癌症, 影响超过16万人, 每年⁴。这种疾病的侵袭性形式每年要求数以万计的生命。然而, 疾病进展的机制仍然是不清楚的。这导致严重缺乏有效的治疗方案的晚期和转移性前列腺癌, 这证明了高死亡率的高级前列腺癌患者⁴。因此, 研究前列腺癌的临床前模型越来越需要。然而, 由于老鼠和人前列腺之间的内在差异, GEMMs 的前列腺癌的建模直到2004年引入了酒吧港口分类系统, 才获得普及, 其中概述了小鼠的组织病理学变化。前列腺在基因操作, 肿瘤变化的鉴定和他们的关系到癌症进展的阶段在人⁵。在研究任何前列腺 GEMM 模型时, 必须考虑到小鼠前列腺的一个重要特征, 那就是存在四种截然不同的裂片: 前、侧、腹和背。叶在组织病理学和基因表达模式上存在显著差异⁶。Probasin 蛋白表达模式可以不同的裂片之间的年轻后青春期小鼠⁷, 这必须考虑, 因为基于 GEMM 模型主要是设计使用一个 Probasin 的助剂称为 Pb-Cre4⁷。由此产生的空间和时间差异, 在创新表达往往导致差异的肿瘤启动和进展时限, 以及差异的癌症变化之间的裂片。因此, 在研究前列腺 GEMMs 肿瘤的发展时, 必须考虑到这种差异, 而个别的裂片可能需要单独评估以获得可重现的结果。本文的第一部分介绍了解剖小鼠前列腺的正确方法, 识别和分离每个裂片, 并识别出裂片之间的组织学差异。

而肿瘤生长和组织病理学的分析可以为肿瘤的发展提供有价值的见解, 但并没有提供关于分子机制的大量信息。为了研究肿瘤的发展和进展机制, 对肿瘤细胞的体外分析往往是有益的。多年来, 有几种方法涉及这些细胞的文化, 包括悬浮培养, 3D 文化⁸和最近, 正规2D 文化⁹。虽然这些方法中的大多数导致细胞存活率和增殖率很好, 但3D 的文化提供了一个最接近生理条件的环境。在基底膜细胞外基质 (ECM) 中生长的3D 或球形培养中, 完全分化的腔内细胞通常具有极低的生存率;然而, 基底和中间细胞 (主要是干细胞) 能够繁殖和产生细胞簇称为球体¹⁰。这使得它适合于癌症研究, 因为上皮癌被认为是来源于干细胞 (俗称癌症干细胞)¹¹。本议定书的第二部分描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法。所产生的球体可用于几种下游分析, 包括通过活细胞成像、免疫荧光染色、不同蛋白的 organoid 形态学和行为研究, 以及对化疗反应的研究。治疗。

总体而言, 本协议的目标是通过描述小鼠前列腺的解剖和解剖技术以及球形培养的组织处理和体外分析, 勾勒出在前列腺癌中使用小鼠模型的最佳方法。.

Protocol

这里描述的所有鼠标实验都是根据 IACUC 州立大学北部医学院的机构批准的协议中所概述的指导原则进行的。

1. 泌尿生殖系统 (UGS) 解剖

注意: 示意图显示在图 1中。

1. 弄死3月大的雄性 C57BL/6 鼠使用₂吸入安乐死方法或另一种批准的技术。
   注: 在3岁至12月之间的老鼠可以成功地用于实验。年长的老鼠 (> 6 月) 最有可能在 UGS 周围有更多的脂肪, 这将需要清除。在小于3月的小鼠中, 叶的鉴别和分离往往是困难的。其他菌株也可用于实验。
2. 将鼠标放在背部, 用别针固定腿, 使动物的腹侧暴露。
3. 在老鼠的腹部喷洒70% 乙醇, 擦拭干净。
   注意: 不需要在解剖前剃掉腹部毛发。
4. 从腹部抬起皮肤, 连同肌肉层, 用一对中等钝钳, 用剪刀在腹部上做一个倒置的 Y 形切口。
   1. 首先, 用一把锋利的剪刀从小弟弟上方到胸骨上做一个直切口 (图 2a)。
   2. 从切口的底部切向每个脚趾, 直至大腿 (图 2b)。折叠背部两侧和底部的皮肤查看整个腹部区域 (图 2c-e)。
      注意: 切割尺寸的变化取决于鼠标的年龄和大小。初始直切口的大小可能从1.5 到4厘米不等, 这取决于鼠标的大小。
5. 移过其他器官以暴露 UGS。提起并移动棕色黄色的肠道 (图 2f)。用镊子拿起腹部脂肪垫 (不透明的白色海绵组织) 并将其移动到两侧 (图 2g)。
   注: UGS 包括精囊、尿道、前列腺、输精管 (输精管) 和膀胱。它可以识别的特点对不透明的白色半圆拱 (即精囊), 与液体填充膀胱囊附着在基地。位于精囊下的半透明组织为前列腺。
6. 定位 UGS, 用钝钳牢牢地抓住膀胱, 从小鼠腹部向上提起整个 UGS。
   注: 如果膀胱已满, 先用小注射器将其排出, 以提供更好的抓钳和减少膀胱破裂的危险。
7. 继续拉上膀胱, 在膀胱和前列腺下面滑动一把剪刀到脊柱, 并作出削减。切断与腹腔的任何剩余连接 (图 2h和2i)。小心不要切断太靠近 UGS, 以避免意外切割通过任何前列腺组织。
   注: 在 UGS 下进行切割时, 剪刀应插入到鼠标的后端, 这样切口也会对椎体柱进行切割。这种方法的结果是切断几乎所有的连接之间的 UGS 和腹腔在一个剪, 减少了需要的时间, 从老鼠提取的组织。
8. 移除 UGS 并将其放在2-6 毫升 (足以覆盖组织) 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 或 Dulbecco 的修饰鹰培养基 (DMEM, 高葡萄糖) 在6厘米培养皿 (图 2j和2k), 并将其移动到解剖显微镜 (10X放大)。
   注意: 根据需要在其余步骤中更改解剖介质。

2. 解剖前列腺

1. 用一对细钳和显微切割剪刀清除背部和腹侧两侧的脂肪 (图 3a)。在解剖协议的其余部分使用类似的手术器械。
   注: 脂肪通常与 UGS 紧密交织 (可由其白色海绵状外观识别);因此, 这一步骤必须小心地执行, 以避免意外地切断任何前列腺组织。清除所有的脂肪可能需要10-15 分钟。
2. 用镊子按住并拔出膀胱, 用剪刀将其剪下 (图 3b)。
3. 将其余的组织腹侧放置。用镊子按住一输精管, 用剪刀把它追踪到底座上, 剪掉 (图 3c), 然后在另一侧重复。切除输精管, 现在留下前列腺 (半透明和 verminous), 精囊 (不透明和白色, 半圆) 和尿道 (粉红色-红色和不透明管) (图 3d和3e)。
4. 在精囊内拱与前列腺组织前叶之间插入镊子。撬除精囊和前列腺, 并根据需要剪去任何结缔组织 (图 3f)。在尿道中追踪精囊, 并取出它们 (图 3g和3h)。小心不要刺穿他们。
5. 开始解剖个别的前列腺裂片。

3. 前列腺及个别裂片显微解剖 (图 3 i.)

1. 用一对钝钳翻转组织, 使背部侧面朝上, 显示背叶, 这将像蝴蝶的翅膀。
2. 用剪刀把耳垂和钳夹在底座上收集背叶 (图 3j)。
3. 将剩余的组织翻转到腹侧。
4. 收集的侧面裂片, 这是小的, 通常包在一侧的尿道, 这是楔形之间的前, 腹, 和背叶 (图 3k)。
5. 接下来, 收集腹叶, 这是大于侧面裂片和躺在尿道腹部 (图 3l)。
6. 最后, 通过切割和丢弃尿道 (图 3m), 收获前叶, 最大的四。
7. 根据实验需要处理组织件。进入4节进行组织学, 或5节的球体培养。

4. 由苏木精和红红染色的幻灯片的裂片鉴定和形态学

1. 修复前列腺组织并将其嵌入石蜡切片。用苏木精和伊红 (H & E) 进行染色, 根据奥利维拉的特点, 根据组织学观察和鉴别前列腺裂片的差异. ¹² (图 5)。

5. 加工3D 培养的组织¹⁰

注:图 6中概述了这一点。

1. 根据实验需要, 进行整个前列腺或单个裂片的培养。将前列腺组织转移到含有2-3 毫升 DMEM 的10厘米皿中。用手术刀, 在解剖显微镜下, 尽可能细和均匀地将前列腺小管切碎。
2. 在无菌条件下, 在组织培养罩下继续余下的步骤。
3. 将组织件连同 DMEM 转移到15毫升管, 并将 DMEM 的体积增加到9毫升。加入1毫升的10x 胶原酶溶液, DMEM 组织混合物和涡流混合。
   注: 胶原酶的溶液是10毫克/毫升在罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 培养基, 最后集中在15毫升管是1毫克/毫升。
4. 将管放在旋转振动筛或管转子上2小时, 在37摄氏度, 用于胶原酶降解细胞外基质。
5. 在室温下离心管在 400 x g 处5分钟。
6. 在2毫升的温0.05% 胰蛋白酶-EDTA 中去掉上清和并用重悬, 以切割细胞细胞和细胞基质粘连。把管子转到37摄氏度, 5 分钟。
   注: 如果组织块太大, 不能混合好, 用剃刀刀片切开吸管尖端, 使其更宽的孔。
7. 用一 P1000 吸管将吹打的组织团簇分解8-10 次, 然后用 P200 吸管重复。
8. 用3毫升完整的 DMEM 中和胰蛋白酶。添加 500 U 的 DNAase 和混合好。
9. 通过一个5毫升注射器5-10 倍, 18 克针。然后用20克针穿过5次。
10. 如果解决方案仍包含大的组织块, 请再次重复步骤4-8。
11. 通过放置在50毫升管上的40微米过滤器过滤细胞悬浮。冲洗15毫升管与5毫升的 DMEM, 并通过相同的过滤器。重复冲洗。
12. 在室温下, 丢弃过滤器和离心机, 该管包含流经在 400 x g 处的5分钟。

6. 细胞的电镀和培养

1. 并用重悬0.5 毫升完全前列腺上皮细胞生长培养基 (PrEGM) 中的颗粒。使用细胞计数器或 hemocytometer 计数细胞密度, 并将细胞稀释至 5 x 10⁵细胞/毫升, 完全 PrEGM。
   注: 3 月大的老鼠全前列腺的产量可从 3 x 10⁵-10⁶细胞不等。因此, 重要的是最初并用重悬颗粒在不超过0.5 毫升的 PrEGM (如上所述), 以便达到所需的细胞密度, 即使低产量。
2. 根据实验需要, 将所需的细胞与基底膜 ecm 在2:3 体积比 (60% 基底膜 ecm 和40% 细胞悬浮液) 和板在多孔板或室滑动中混合。
   注: 用于染色, 板在玻璃底板或会议厅幻灯片, 覆盖整个井或中间的井。板块周围的井边如果计数产生的 organoids, 或板块作为几个水滴在井中, 如果电镀更高的容量。注意不要把它涂得太厚或太薄。板材至少100µL 的基质细胞混合物每1厘米²的电镀面积;例如, 在具有2厘米²井表面积的腔内滑动中, 应镀上200µL, 其中含有 5 x 10⁴细胞的基质细胞混合物。
3. 将板/滑块转移到一个37°c 孵化器与 5% CO₂为30分钟为地下室膜 ECM 巩固。然后, 添加预热完整的 PrEGM 盖好, 注意不要打扰地下室膜 ECM 插头。
4. 删除一半的媒体, 并添加新鲜的媒体每2-3 天。长球体5-10 天。
5. 继续收割 (步骤 7), 染色 (步骤 8), 和/或成像的下游应用。

7. 收割球体

1. 要收获球体, 小心地吸入介质, 而不干扰基底膜 ecm 凝胶插头, 并在基底膜 ecm PrEGM 每100µL 中加入1毫升的1毫克/毫升酶溶液。
   注: 如果在井边或边缘 (而不是覆盖整个井) 中镀球体, 以确保能将足够数量的酶溶液添加到井中, 就更容易收获。
2. 用细胞刮板刮下底板, 将基底膜 ECM 凝胶酶-PrEGM 溶液中。
3. 用宽口径1000µL 吸管尖或5毫升吸管将整个溶液一次上下移一次, 将凝胶塞分解成较小的部分。
   注: 用剃刀刀片切下1000µL 吸管尖端的尖端, 使之成为宽口径的尖端。
4. 孵化在一个37°c 孵化器与 5% CO₂ 1-2 小时, 直到地下室膜 ECM 完全溶解。
   注意: 这可以通过目视检查井底, 同时倾斜板, 以确认没有更多的凝胶块保持。
5. 在15毫升锥形管中收集细胞悬浮液。
6. 离心机球体在室温下为 250 x 克5分钟, 并继续下游应用。

8. 球形的染色¹³

注: 球体在所需的时间内生长后, 基底膜 ECM 可以溶解, 球体可以被染色, 如 Colicino等所述。¹³。

1. 简要地, 冲洗的文化与 PBS 和添加4% 多聚甲醛 (粉煤灰) 直接到地下室膜 ECM 凝胶插头。室温下孵育30-90 分钟, 缓慢晃动, 直到基底膜 ECM 完全溶解, 每30分钟更换新鲜的粉煤灰。
   注: 在这个过程中, 粉煤灰会溶解凝胶插头并修复球体。
2. 接下来, 用 PBS 清洗3次, 加入50毫米氯化铵10分钟, 从粉煤灰中淬火任何自体荧光。重复3与 PBS 清洗。
3. Permeabilize 与0.1% 非离子洗涤剂5分钟和块与 PBSAT (PBS, 1% BSA, 0.5% 海卫 X-100) 为30分钟。
4. 在 PBSAT 中以一夜间4摄氏度孵育一个主抗体, 其次是 3 PBSAT 和 PBSAT 中的二级抗体, 室温下为2小时。
5. 如果需要, 按照制造商的协议, 重复清洗与 PBSAT 和染色 DAPI。用 PBS 清洗3次以上。
6. 添加 PBS 与200毫米14杂双环 [2.2. 2] 辛烷 (DABCO) antifade 试剂, 并进行成像。

Results

小鼠前列腺裂片可以被辨认和解剖使用他们的位置关于精囊和尿道。小鼠前列腺由4对背和腹部的裂片组成, 用于精囊和尿道。图 4a和4b (顶部) 显示完整的前列腺的背部和腹部的看法, 连同精囊和尿道。底部的面板 (图 4c和4d) 显示了不同的裂片概述的标识。裂片可与小鼠分离3月。

不同的前列腺裂片在组织学上有显著差异 (图 5)。所有小鼠前列腺叶均由由分泌上皮细胞包围的腔组成的多腺体剖面组成;然而, 叶的形状, 细胞的组织, 和分泌物的性质是不同的从裂片到裂片。从 H & E 染色小鼠前列腺的识别特性得到了奥利维拉等的有效概述。¹², 简要...

Discussion

本文概述了小鼠前列腺的解剖方法和单个裂片的鉴定。还描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法, 用于体外分析。

解剖协议的一个关键步骤是 (1) 从鼠标中采集整个 UGS, 并在解剖显微镜下分离各个器官。前列腺组织非常小, 周围的 UGS 的其余部分;因此, 在获取所有四对裂片完好无损的情况下, 从体腔直接收割器官几乎是不可能的。因此, 重要的是从老鼠身上收获整个 UGS, 然后开始提取前列腺。在本议定书中, (2) 及时执行这些步骤并保持细致是非常重要的。在解剖过程中, 时间是最基本的, 以减少组织的退化。此处描述的用于从鼠标中提取 UGS 的特定技术比替代方法更快, 并且非常推荐。整个解剖和裂片隔离程序通常采取35-40 分钟, 可以降低到25分钟, 以更多的实践。解剖的最具挑战性的部分是清理周围的脂肪 UGS, 占整个解剖时间的一个很大一部分。脂肪必须精心清除, 以确保没有任何它留在前列腺, 但重要的是要非常小心, 不要意外失去任何前列腺组织的过程中。另一关键步骤是 (3) 在分离前列腺裂片之前, 不要取出尿道。尿道基本上形成的基础上, 所有四对前列腺裂片...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
小鼠手术器械（小鼠解剖试剂盒）	World Precision Instruments	MOUSEKIT
解剖显微镜
RPMI 培养基	Thermofisher Scientific	11875093
解剖培养基 （DMEM + 10%FBS）	Thermofisher Scientific	11965-084
胎牛血清	Thermofisher Scientific
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	Thermofisher Scientific	10010031
胶原酶	Thermofisher Scientific	17018029	在 RPMI 中制备 10x 原液 （10mg/ml），过滤灭菌，分装并储存在 -20 °C;C
胰蛋白酶-EDTA （0.05%）	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
注射器和针头	Fisher Scientific
Fisherbran 无菌细胞过滤器，40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	加入所有成分，分装并储存在 -20 °C 下。
基质胶膜基质	Thermofisher Scientific	CB-40234
分散酶 II 粉末	Thermofisher Scientific	17105041	在 PrEGM 中制备 10x 原液 （10mg/ml），过滤灭菌，分装并储存在 -20 °C;丙