基因工程小鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。本文介绍了一种从小鼠泌尿生殖系统中识别并分离前列腺叶的方案，基于组织学特征对其进行区分，并分离和培养原代前列腺细胞 体外 用于后续分析的球状体。
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本文内容
摘要
摘要
基因工程小鼠模型（GEMMs）是研究包括前列腺癌（PCa）在内的大多数人类癌症的有效临床前模型。了解小鼠前列腺的解剖结构和组织学特征，对于高效利用和准确表征此类动物模型至关重要。小鼠前列腺具有四对结构明确的叶，每对叶均有其独特的特征。本文展示了用于疾病分析的小鼠前列腺叶的正确分离与鉴定方法。分离后，前列腺细胞可进一步进行培养 关键词：基因工程小鼠模型，前列腺癌，小鼠前列腺解剖，前列腺叶分离，原代细胞培养 体外 以获得机制性理解。由于小鼠前列腺原代细胞在培养过程中 tends to lose their normal characteristics when cultured 体外我们在此介绍一种分离细胞并将其培养为三维球状体的方法，该方法可有效维持细胞的生理特性。这些三维培养物可用于在接近生理条件下分析细胞形态和行为，研究疾病发生与发展过程中关键蛋白和信号通路的表达水平及定位变化，以及观察细胞对药物处理的反应。
引言
几十年来，科学界一直在努力阐明人类癌症发展的复杂机制。尽管潜在关键因子和药物靶点的鉴定始于患者细胞和组织研究，但这些发现的转化应用往往需要借助临床前动物模型。自小鼠人类癌症模型联盟（NCI-MMHCC）成立以来，利用基因工程小鼠模型（GEMMs）模拟人类癌症的研究稳步增加。该联盟旨在为全球科学家描述并统一小鼠癌症模型的特征1,2。在大多数类型癌症的临床前研究中，小鼠模型满足了对发病机制进行研究的需求，有助于理解癌症的发生、发展、治疗反应以及获得性耐药等过程3。
前列腺癌是男性中最常见的癌症，每年影响超过16万名男性4。该疾病的侵袭性形式每年导致数万人死亡。然而，疾病进展的机制仍不清楚，这导致针对晚期和转移性前列腺癌的有效治疗手段严重缺乏，晚期前列腺癌患者的高死亡率即是明证4。因此，迫切需要建立用于研究前列腺癌的临床前模型。然而，由于小鼠与人类前列腺之间存在固有的差异，直到2004年巴港分类系统（Bar Harbor Classification system）提出后，利用基因工程小鼠模型（GEMMs）模拟前列腺癌才逐渐受到重视。该系统明确了小鼠前列腺在基因操作后发生的组织病理学变化、肿瘤性病变的识别及其与人类癌症进展阶....
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方案
本文所述所有小鼠实验均按照纽约州立大学上州医科大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案指南进行。
1. 泌尿生殖系统（UGS）解剖
注意：示意图见图1。
- 使用 CO2 吸入法或其他经批准的技术处死一只 3 个月大的雄性 C57BL/6 小鼠。
注意：3 至 12 个月龄的小鼠均可成功用于本实验。年龄较大的小鼠（> 6 个月）在尿道生殖窦（UGS）周围可能含有较多脂肪，需予以清除。小于 3 个月的小鼠通常难以辨认和分离各叶。其他品系的小鼠也可用于本实验。 - 将小鼠仰卧放置，并用图钉固定四肢，使其腹侧完全暴露。
- 用 70% 乙醇喷洒小鼠腹部，并擦拭干净。
注意：解剖前无需剃除腹部毛发。 - 用中号钝头镊子提起腹部皮肤及肌肉层，用剪刀在腹部做倒 Y 形切口。
- 首先，用一把锋利的剪刀从阴茎稍上方开始，沿直线剪至胸骨（图 2a）。
- 从切口基部向两侧下肢方向剪至大腿（图 2b）。将皮肤向两侧及底部翻折，以充分暴露整个腹部区域（
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结果
小鼠前列腺叶可根据其相对于精囊和尿道的位置进行识别和分离。小鼠前列腺由4对叶组成，分别位于精囊和尿道的背侧和腹侧。 图 4a 和 4b （上图）显示完整前列腺的背侧和腹侧视图，以及精囊和尿道。下图（图 4c 和 4d) 显示为便于识别而标出的不同脑叶。脑叶可从低至3个月大的小鼠中分离。
不同的前列腺叶在组织学上存在显著差异（图5）。所有小鼠前列腺叶均由多个腺体轮廓组成，每个腺体包含由分泌性上皮细胞包围的管腔；然而，各叶在形态、细胞排列方式以及分泌物性质方面各不相同。H&E染色小鼠前列腺的鉴别特征已被Oliveira et al.12进行.......
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讨论
本文概述了小鼠前列腺的解剖方法及各个叶的鉴定。同时还描述了将小鼠前列腺细胞进行三维培养的实验方案。 体外 分析。
解剖方案中的关键步骤包括：（1）从 小鼠体内完整取出整个泌尿生殖窦（UGS），并在解剖显微镜下分离各个器官。前列腺组织非常微小，且被包围在泌尿生殖窦的其他组织之中；因此，在保持四对叶完整无损的前提下，直接从体腔中单独获取该器官几乎是不可能的。因此，必须首先完整取出整个泌尿生殖窦，然后再从中分离前列腺。本方案中的另一个关键点是（2）操作需及时进行，同时保持细致谨慎。由于解剖过程中必须尽量减少组织降解，时间控制至关重要。本文所述从小鼠中取出泌尿生殖窦的具体技术相比其他方法更为快速，强烈推荐使用。整个解剖及叶状结构分离过程通常耗时35–40分钟，随着操作熟练程度的提高，可缩短至25分钟。解剖过程中最具挑战性的环节是清除围绕泌尿生殖窦的脂肪组织，该步骤占据了总解剖时间的很大一部分。必须仔细彻底地去除脂肪，以确保其完全不残留在前列腺组织中，但同时需格外小心，避免在清理过程中意外丢失任何前列腺组织。另一个关键步骤是（3）在分离前列腺各叶之前，切勿提前移除尿道。尿道.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 R01CA161018（LK 负责）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠手术器械（小鼠解剖工具包） | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| 解剖显微镜 | |||
| RPMI 培养基 | Thermofisher Scientific | 11875093 | |
| 解剖培养基（DMEM + 10% FBS） | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| 胎牛血清 | Thermofisher Scientific | 10438018 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Thermofisher Scientific | 10010031 | |
| 胶原酶 | Thermofisher Scientific | 17018029 | 用 RPMI 配制成 10 倍储存液（10 mg/ml），过滤除菌，分装后于 -20 °C 保存 |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%） | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
| 注射器和针头 | Fisher Scientific | ||
| Fisherbran 无菌细胞筛，40μm | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| PrEGM BulletKit | Lonza | CC-3166 | 加入全部组分，分装后于 -20 °C 保存。 |
| Matrigel 基底膜基质 | Thermofisher Scientific | CB-40234 | |
| Dispase II 粉末 | Thermofisher Scientific | 17105041 | 用 PrEGM 配制成 10 倍储存液（10 mg/ml），过滤除菌，分装后于 -20 °C 保存 |
参考文献
- Marks, C. L. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).
- Marks, C. Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI. Disease Models & Mechanisms. 2 (3-4)....
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重印与许可
