体外3D 球形培养模型小鼠前列腺叶的鉴定、组织学特征及解剖

Summary

基因工程鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。在这里, 我们提出了一个协议, 以识别和解剖小鼠泌尿生殖系统前列腺裂片, 区分他们的组织学, 并分离和培养的原发性前列腺细胞体外作为球体的下游分析。

Abstract

基因工程鼠模型 (GEMMs) 是研究大多数类型的人癌症, 包括前列腺癌 (PCa) 的有效的前临床模型。了解小鼠前列腺的解剖和组织学, 对于有效使用和正确描述这种动物模型是很重要的。小鼠前列腺有四不同的裂片, 各有各自的特点。本文对小鼠前列腺叶的解剖和鉴定方法进行了分析。解剖后, 前列腺细胞可以进一步培养,在体外为机械的理解。由于小鼠前列腺原代细胞在体外培养时往往失去正常的特征, 我们在此概述了一种分离细胞并将其生长为3D 球形培养的方法, 这对保持生理细胞的特征。这些3D 文化可用于分析近生理条件下的细胞形态和行为, 调查在疾病发展和进展过程中所涉及的关键蛋白质和通路的变化水平和定位, 并观察对药物治疗的反应。

Introduction

科学界一直在试图阐明几十年来人类癌症发展的复杂机制。虽然潜在的关键参与者和药物靶点的识别始于患者细胞和组织研究, 但这种发现的转化应用往往需要使用临床前动物模型。自从建立了人类癌症联盟 (MMHCC) 的老鼠模型, 一个试图描述和统一小鼠癌症特征的委员会以来, 利用基因工程小鼠模型 (GEMMs) 来建模人类癌症的模型已经稳步上升。模型为全世界科学家^1,2。老鼠模型满足了机械研究的需要, 在临床前研究的大多数类型的癌症, 了解的发展, 进展, 反应治疗和后天抵抗³。

前列腺癌是男性最常见的癌症, 影响超过16万人, 每年⁴。这种疾病的侵袭性形式每年要求数以万计的生命。然而, 疾病进展的机制仍然是不清楚的。这导致严重缺乏有效的治疗方案的晚期和转移性前列腺癌, 这证明了高死亡率的高级前列腺癌患者⁴。因此, 研究前列腺癌的临床前模型越来越需要。然而, 由于老鼠和人前列腺之间的内在差异, GEMMs 的前列腺癌的建模直到2004年引入了酒吧港口分类系统, 才获得普及, 其中概述了小鼠的组织病理学变化。前列腺在基因操作, 肿瘤变化的鉴定和他们的关系到癌症进展的阶段在人⁵。在研究任何....

Protocol

这里描述的所有鼠标实验都是根据 IACUC 州立大学北部医学院的机构批准的协议中所概述的指导原则进行的。

1. 泌尿生殖系统 (UGS) 解剖

注意: 示意图显示在图 1中。

1. 弄死3月大的雄性 C57BL/6 鼠使用₂吸入安乐死方法或另一种批准的技术。
   注: 在3岁至12月之间的老鼠可以成功地用于实验。年长的老鼠 (> 6 月) 最有可能在 UGS 周围有更多的脂肪, 这将需要清除。在小于3月的小鼠中, 叶的鉴别和分离往往是困难的。其他菌株也可用于实验。
2. 将鼠标放在背部, 用别针固定腿, 使动物的腹侧暴露。
3. 在老鼠的腹部喷洒70% 乙醇, 擦拭干净。
   注意: 不需要在解剖前剃掉腹部毛发。
4. 从腹部抬起皮肤, 连同肌肉层, 用一对中等钝钳, 用剪刀在腹部上做一个倒置的 Y 形切口。
   1. 首先, 用一把锋利的剪刀从小弟弟上方到胸骨上做一个直切口 (图 2a)。
   2. 从切口的底部切向每个脚趾, 直至大腿 (图 2b)。折叠背部两侧和底部的皮肤查看整个腹部区域 (

Results

小鼠前列腺裂片可以被辨认和解剖使用他们的位置关于精囊和尿道。小鼠前列腺由4对背和腹部的裂片组成, 用于精囊和尿道。图 4a和4b (顶部) 显示完整的前列腺的背部和腹部的看法, 连同精囊和尿道。底部的面板 (图 4c和4d) 显示了不同的裂片概述的标识。裂片可与小鼠分离3月。

不同的前列腺裂片在组织学上有显著差异 (图 5)。所有小鼠前列腺叶均由由分泌上皮细胞包围的腔组成的多腺体剖面组成;然而, 叶的形状, 细胞的组织, 和分泌物的性质是不同的从裂片到裂片。从 H & E 染色小鼠前列腺的识别特性得到了奥利维拉等的有效概述。¹², 简要.......

Discussion

本文概述了小鼠前列腺的解剖方法和单个裂片的鉴定。还描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法, 用于体外分析。

解剖协议的一个关键步骤是 (1) 从鼠标中采集整个 UGS, 并在解剖显微镜下分离各个器官。前列腺组织非常小, 周围的 UGS 的其余部分;因此, 在获取所有四对裂片完好无损的情况下, 从体腔直接收割器官几乎是不可能的。因此, 重要的是从老鼠身上收获整个 UGS, 然后开始提取前列腺。在本议定书中, (2) 及时执行这些步骤并保持细致是非常重要的。在解剖过程中, 时间是最基本的, 以减少组织的退化。此处描述的用于从鼠标中提取 UGS 的特定技术比替代方法更快, 并且非常推荐。整个解剖和裂片隔离程序通常采取35-40 分钟, 可以降低到25分钟, 以更多的实践。解剖的最具挑战性的部分是清理周围的脂肪 UGS, 占整个解剖时间的一个很大一部分。脂肪必须精心清除, 以确保没有任何它留在前列腺, 但重要的是要非常小心, 不要意外失去任何前列腺组织的过程中。另一关键步骤是 (3) 在分离前列腺裂片之前, 不要取出尿道。尿道基本上形成的基础上, 所有四对前列腺裂片.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
小鼠手术器械（小鼠解剖试剂盒）	World Precision Instruments	MOUSEKIT
解剖显微镜
RPMI 培养基	Thermofisher Scientific	11875093
解剖培养基 （DMEM + 10%FBS）	Thermofisher Scientific	11965-084
胎牛血清	Thermofisher Scientific
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	Thermofisher Scientific	10010031
胶原酶	Thermofisher Scientific	17018029	在 RPMI 中制备 10x 原液 （10mg/ml），过滤灭菌，分装并储存在 -20 °C;C
胰蛋白酶-EDTA （0.05%）	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
注射器和针头	Fisher Scientific
Fisherbran 无菌细胞过滤器，40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	加入所有成分，分装并储存在 -20 °C 下。
基质胶膜基质	Thermofisher Scientific	CB-40234
分散酶 II 粉末	Thermofisher Scientific	17105041	在 PrEGM 中制备 10x 原液 （10mg/ml），过滤灭菌，分装并储存在 -20 °C;丙