本方案旨在描述猪肝细胞的分离方法 离体 通过自体细胞移植实现基因递送以治愈代谢性疾病模型。尽管该特定模型具有利于治疗成功的独特优势，但其应用仍为应对其他疾病和适应症提供了重要基础。
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摘要
摘要
基因治疗是治愈多种肝脏先天性代谢缺陷的理想选择。Ex-vivo（离体）方法中，慢病毒载体已成功用于治疗人类多种造血系统疾病，因其能够整合到宿主基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。本方法展示了将ex vivo（离体）基因治疗技术应用于遗传性酪氨酸血症I型大型动物模型的肝细胞治疗。该过程包括：1）从自体供体/受体动物中分离原代肝细胞；2）通过慢病毒载体对肝细胞进行ex vivo（离体）基因递送；3）经门静脉注射将基因修复后的肝细胞进行自体移植。该方法的成功通常依赖于高效且无菌地切除肝脏组织，小心处理切除样本以分离出足够数量且具有活性、可用于再植入的肝细胞，实现高比例的细胞转导，以及全程采用无菌外科操作以防止感染。上述任一步骤的技术失败均可能导致可用于自体移植的活性转导肝细胞产量过低，或导致供体/受体动物发生感染。本研究所选用的人类1型遗传性酪氨酸血症（HT-1）猪模型特别适用于该方法，因为即使仅有少量修复细胞成功植入，也可凭借其相对于天然病变肝细胞的强大选择性优势，实现健康肝细胞对肝脏的重新占据。尽管这种生长选择优势并非在所有适应证中均存在，但该方法为拓展至其他适应证奠定了基础，并允许对该环境进行调控，以研究更多肝脏内外的疾病，同时可控制病毒载体的暴露水平以及脱靶毒性与致瘤风险。
引言
肝脏代谢先天性缺陷是一组遗传性疾病，总体发病率可高达每800名活产婴儿中就有1例1。其中许多疾病由单基因突变引起2，通过将一个正常的基因拷贝导入足够数量的肝细胞中，即可实现功能上的治愈3。所需纠正的肝细胞比例因疾病而异4，主要取决于该基因所编码蛋白的性质，例如是分泌性蛋白还是胞质蛋白。在大多数情况下，可通过检测血液循环中常可获得的生物标志物来便捷地评估任何针对代谢性疾病的治疗效果。
HT-1 是一种由延胡索乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）缺陷引起的肝脏先天性代谢疾病5，该酶是酪氨酸代谢途径中的最后一个酶促步骤6。FAH 缺乏会导致肝脏内毒性代谢产物蓄积，可能引发急性肝衰竭并导致死亡；在慢性病程中则可能导致肝硬化和肝细胞癌。该病的临床治疗采用 2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰)-1,3-环己二酮（NTBC）进行管理，这是一种作用于酪氨酸代谢通路中 FAH 上游酶的小分子抑制剂。该疾病为基因治疗技术的测试提供了理想模型，因为在小型和大型动物模型中，即使仅有少量肝细胞得到成功纠正，最终也能实现整个肝脏被纠正细胞重新填充7,8。其机制在于，由于未纠正细胞内毒性代谢物的积累，纠正后的细胞具有显著的生存优势。未纠正肝细胞的丢失为纠正肝细胞的选择性扩增创造了条件，这一过程符合肝脏自身的再生能力。治疗效果可通过移植后循环中酪氨酸和琥珀酰丙酮水平的下降进行便捷监测。
为了证明该操作（包括部分肝切除术）具有侵入性的合理性，此方法的目标必须是实现持久性治愈。因此，采用复制缺陷型慢病毒载体，因其能够稳定整合到肝细胞基因组9，从而在肝脏生长并扩增以替代大量未纠正细胞的过程中，将纠正后的基因持续传递至所有子代细胞。这一特性相较于腺相关病毒（AAV）载体具有优势，后者主要以附加体形式存在，在有丝分裂过程中仅能传递给一个子代细胞10，因而治疗效果在数周内便会丧失。
尽管越来越多的文献支持慢病毒的安全性11，但通过将宿主细胞的转导限制在受控的体外（in vitro）环境中，可减轻对基因毒性事件的担忧。采用该方法时，游离载体不会全身性地引入宿主体内，从而限制了对肝细胞的暴露，这些肝细胞将通过门静脉自体移植重新回输至体内。
本报告描述了手术及 离体 用于基因治疗的肝细胞分离方法 离体 以及随后的自体移植12 用于HT-1猪的治疗8完整的流程包括：1）部分肝切除术，既作为肝细胞的来源，又可刺激宿主肝脏的再生；2）从切除的肝脏中分离肝细胞，随后 离体 基因校正，最后是3）将校正后的肝细胞重新导入宿主体内。所述方法经适当修改后可适用于所有大型动物模型，但目前仅在FAH缺陷型猪中实现。13 将具有针对校正肝细胞的选择性环境优势。
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方案
所有动物实验操作均遵循机构指南，并在研究开始前经机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查和批准。本文所述操作均在健康且适合手术的雄性和雌性大型白猪（50%兰德瑞斯/50%大白猪遗传背景）上进行，年龄不超过3个月。 动物通常群养，除非机构兽医护理人员判断其存在不相容情况。 动物每日饲喂标准饲料两次，并由护理人员每日至少观察一次临床体征。
1. 手术准备
- 肌肉注射泰拉唑（telazol）5 mg/kg 和赛拉嗪（xylazine）2 mg/kg 以诱导镇静。皮下注射长效布托啡诺（buprenorphine SR）0.18 mg/kg 用于术后镇痛（预计该剂量镇痛效果可持续长达 72 小时）。手动检查动物对刺激的反应以确认镇静效果。
- 动物镇静后，于外周耳缘静脉插入静脉导管，以便给药。
- 术前静脉注射头孢唑林（cefazolin）25 mg/kg，肌肉注射头孢噻呋（ceftiofur）5 mg/kg。
- 术中持续静脉输注生理盐水，以维持血压和心率在正常生理范围内。
- 插入经口胃管以减压胃腔。使用合适尺寸的气管插管进行气管插管，通过手动按压胸壁观察呼气以确认插管位置正确，随后使用 1–3% 异氟烷进行机械通气。
- 连接心电图（ECG）导联、血压袖带、体温探头和脉搏血氧仪以监测并记录生命体征。将动物置于仰卧位，使用聚维酮碘（betadine）对从肋缘至骨盆区域的腹部进行消毒，并进行无菌铺巾。
- 术中以 1–3% 异氟烷维持麻醉手术深度。持续监测生命体征变化，并根据需要调整异氟烷浓度，以维持心率 在切皮前水平。若血压显著下降，应减少异氟烷用量，并启动机构批准的复苏药物以恢复生命体征，例如静脉注射肾上腺素。
- 根据机构特定政策，在手术记录表中记录心率、呼吸频率、血压和体温，以追踪并保障动物福利，确保符合大型动物福利标准。
2. 腹腔镜部分肝切除术
- 在脐部头侧采用开放式Hasson技术进行初始穿刺口进入。当观察到腹膜时，将12 mm套管安全置入腹腔。通过此穿刺口插入5 mm、30°的腹腔镜。
- 以CO2气腹使腹内压达到15 mmHg。在腹腔镜直视下，于肝脏左外叶处呈三角形布置另外两个5 mm穿刺口。穿刺口的具体位置需根据动物的体型和解剖结构而定。
- 此时，将腹腔镜插入其中一个5 mm穿刺口。
- 在左叶主裂处识别肝脏左外段。该裂隙分隔了左内段与左外段。沿此裂隙使用外科吻合器（见材料表）夹闭门脉结构及肝静脉。使用吻合器连续击发，配合60 mm、45 mm或30 mm血管钉仓，横断该裂隙处的肝实质。
- 完成实质切除后，评估残余肝脏，确保充分止血。如有肝实质出血，使用电凝或缝合进行控制。
- 使用内镜抓钳及内镜组织取出袋取出肝脏标本。
- 移除穿刺套管，分三层缝合12 mm穿刺口：中线筋膜层使用间断0号缝线，深层真皮层使用连续2-0缝线，皮下层使用连续4-0缝线。5 mm穿刺口可使用2-0缝线单层缝合。
- 在切口处覆盖无菌敷料（见材料表）。
- 若细胞在4小时内即可准备就绪，则术后维持动物处于全身麻醉状态，直至自体移植时。
- 或者，若细胞操作需要更长时间（例如为形成肝细胞球状体，或根据本方法的具体应用需要更长的转导/筛选时间），可允许动物从麻醉中恢复，并在细胞准备就绪后，于自体移植前重复麻醉诱导步骤。
3. 肝细胞分离
- 连接蠕动泵与灌注装置，以输送温热的分散液（置于43 °C水浴中保温） 将导管插入肝组织切片中暴露的较大血管，确保溶液进入组织时温度为 38 °C。所有管路、设备和溶液均须保持无菌，以确保细胞适用于移植。
- 用Per II对泵和管路进行预灌注，直至通向组织的三通阀处，该三通阀用于切换Per I与Per II向组织的灌注。将三通阀切换至Per I位置，预灌注剩余的管路组件，并完全充满管路中的在线气泡捕集器，以防止向组织中引入气泡。
- 沿肝血流方向做一清洁的横向切口，以垂直于肝循环的方式暴露门静脉分支和肝静脉的横截面，便于插管。
- 用贴合的导管插管所有可及的暴露静脉，以防止灌注液泄漏。至少插管1支门静脉和1支肝静脉，以确保组织得到充分灌注。
- 确保在将导管置入静脉前，导管已预冲并排尽空气。
- 以每分钟100 mL的速度灌注温热的Per I，每隔30秒至1分钟将出液管从一条静脉移至另一条静脉，轮流灌注所有可用静脉，持续15–20分钟。在Per I灌注期间，设置引流管，在负压条件下将操作托盘中的液体排入废液容器。
- 以100 mL/min的流速切换至Per II，如同Per I一样循环通过静脉，总时长为30分钟。在Per II期间，使用回流泵将Per II循环回储液器，以重新给药，从而节约活性酶的制备。将回流泵的流速设置为低于流出泵即， 94 mL/min），注意避免将过多空气返回至原瓶。
- 如果肝包膜破裂，此时间可缩短。
- 如果肝脏未完全消化（轻压局部区域后未出现凹陷），可再进行5分钟灌注。
- 偶尔（约每5分钟）记录气泡捕集器和/或肝脏的表面温度，以确保肝细胞不会变冷。如果肝脏开始变冷（<35 °C）时，提高水浴温度，使肝脏温度恢复至接近 38 °C。随着灌注的进行，肝脏应逐渐变白。
- 将肝脏移至无菌平板或培养皿中，用于转运至细胞培养操作台。用无菌巾覆盖无菌区域，以在肝细胞处理过程中保持无菌环境的完整性。
- 暴露无菌铺巾中的肝组织切片，用冷肝细胞洗涤液（HWM）浸没肝脏。用剪刀划开肝包膜表面以破坏包膜结构。佩戴无菌手套，轻轻按摩肝脏，使肝细胞释放到溶液中。
- 将含有肝细胞的HWM通过无菌纱布过滤至大容量（约200 mL）离心瓶中。按照以下步骤对肝细胞进行三次洗涤，在首次重悬后（如适用）合并多个离心瓶中的细胞沉淀：
- 50 × g 离心 5 分钟，4 °C。
- 吸弃并重悬于150 mL HWM中。
- 3次洗涤后，将沉淀物留在HWM中rd 洗涤。
- 使用血细胞计数板或其他可用设备进行细胞浓度计数。这些细胞现在可用于后续实验。 离体 包括基因治疗、细胞分选或其他自体移植前的特殊处理。HWM 的最终体积可调整至目标浓度（细胞/毫升）。
4. 肝细胞转导
- 将肝细胞重悬于预冷的锥形管中，每毫升培养基含100万至200万个细胞。培养基成分为：杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium [DMEM]）、10% 胎牛血清（fetal bovine serum [FBS]）、青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid [HEPES]）、地塞米松（dexamethasone）、表皮生长因子（epidermal growth factor [EGF]）和NTBC。
- 将慢病毒载体在室温下解冻后，加入预置于冰上的锥形管中，按目标感染复数（MOI）20与细胞结合。在4 °C、10 rpm条件下旋转孵育90分钟，使病毒载体与细胞表面结合。
- 将试管转移至37 °C孵育30–40分钟，每5分钟颠倒混匀一次，以促进载体转导结合的细胞。
- 在 4 °C 条件下以 50 × g 离心 4 分钟。将细胞沉淀在冰上用生理盐水重悬至所需浓度。重复此洗涤步骤，以确保去除制备物中任何未结合的载体。
- 如果可能，接种足量的细胞分装样品（即， 6 孔细胞培养板中每孔 500,000 个细胞）以检测细胞活力、黏附性及转导效率 等等。
注意：在自体移植前通常无法评估这些参数，尤其是对于当天进行的手术。例如，本文所述的实验流程采用了未标记的 Fah 在移植前，由α-1抗胰蛋白酶肝特异性启动子调控的cDNA在肝细胞中难以检测。然而，这些贴壁细胞在自体移植后可进行检测，作为转导是否成功的指标即， 通过蛋白质印迹法检测）或作为该实验操作总体成功与否的预测指标。
5. 肝细胞移植
- 使用 2 至 5 MHz 的超声探头，通过超声成像识别门静脉。将一根 18 G、5 英寸的针头指向门静脉主干，位置在其分叉近端。
- 使用注射器开始缓慢手动输注，最多 1 × 109 个肝细胞（约 10 g）。在移植过程中，利用输注导管监测门静脉压力。
- 若门静脉压力较基线升高超过 8 mmHg，应暂停输注，待压力恢复至基线水平后再继续。
- 若暂停输注 5 分钟后门静脉压力仍未恢复至基线水平，则终止输注。
- 移植完成并拔除导管后，使用超声评估门静脉内是否存在血栓事件以及血流的前向流动情况。
6. 术后恢复与维护
- 将动物转移至合适的恢复区域，并持续观察直至其完全恢复自主活动能力，每15–30分钟监测一次心率、血氧饱和度和体温。根据需要使用保温毯或空气加温装置维持体温。
- 每日口服给予1 mg/kg奥美拉唑（持续至研究结束），以降低因食欲减退发作而导致胃溃疡的风险。
- 术后由实验室人员和兽医人员密切监测动物状况，通常无需额外使用镇痛药物，除非术前已给予布托啡诺剂量。 若经专业兽医护理人员观察到痛苦/疼痛迹象（如切口保护行为、食欲减退、嗜睡），可给予抗炎药物（例如卡洛芬）。
7. 配方
- 参见表1以获取本方案中使用的试剂配方。
| 试剂 | HWM | 试剂 | Per I (10x) | Per II (10x) |
| Williams’-E 粉末 (g/L) | 10.8 | NaCl (g/L) | 83 | 39 |
| NaHCO3 (g/L) | 2.2 | KCl (g/L) | 5 | 5 |
| HEPES (g/L) | 2.6 | HEPES (g/L) | 24 | 240 |
| 青霉素-链霉素溶液（100x，mL/L） | 10 | EGTA (g/L) | 9.5 | - |
| 胎牛血清 (mL/L) | 100 | N-乙酰-L-半胱氨酸 | 8 | 8 |
| pH | 7.3 | (N-A-C, g/L) | ||
| 硝酸甘油 (mL/L) | 5 | 5 | ||
| CaCl2·2H2O (g/L) | - | 7 | ||
| 胶原酶 D (mg/mL) | - | 0.2 | ||
| pH | 7.4 | 7.6 |
表1：用于从肝组织切片中分离肝细胞的溶液配方。
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结果
肝切除与自体移植的示意图如下所示 图1在一组接受肝切除术的5只猪的代表性队列中，大多数样本获得了较高的产量 >1 × 109 活力约为80%的肝细胞（表 2)，可为包括基因治疗在内的各种所需操作提供充足的细胞。将这5头猪所制备肝细胞中未移植的部分进行后续培养，结果显示转导并初次接种46小时后，细胞仍保持良好的活力和贴壁能力，并呈现典型的肝细胞形态。图2）。这些结果代表了一次成功的制备，而制备效果较差则表现为细胞数量少、活力低或细胞在单层中贴附能力弱。
治疗前的肝活检 Fah-/- 猪通过免疫组织化学检测未显示FAH表达图3）。初始植入效果会因移植过程中重新引入的细胞数量而异。...
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讨论
本报告描述了一种用于治愈HT-1猪模型的ex vivo自体基因治疗策略。该方法包括部分肝切除，随后进行ex vivo肝细胞分离，并用携带校正性转基因的慢病毒转导分离的肝细胞。然后通过门静脉将校正后的自体肝细胞移植回FAH缺陷动物体内8。尽管所述方法在稍作修改后可适用于所有大型动物模型，但FAH缺陷猪具有独特的选择性环境优势，有利于校正细胞的富集13,15。该方法可有效治愈HT-1，接受治疗的动物表现出无需NTBC维持的正常生长，生化检测的代谢物和肝脏炎症生物标志物恢复正常，肝硬化和肝细胞癌（HCC）得以预防，并且在NTBC循环治疗中出现的早期纤维化完全逆转。此外，最近一项包含广泛组织学分析的研究表明，在治疗后3年未检测到任何未校正的细胞、纤维化、肝硬化或致瘤性（手稿正在审稿中）。然而，FAH基因敲除背景的应用价值还可作为研究工具，用于评估肝细胞生理学及HT-1以外多种疾病表型的广泛研究。
该...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Duane Meixner 在进行门静脉注射方面的专业支持， Steve Krage, 感谢Joanne Pederson和Lori Hillin在手术过程中的支持。本研究由明尼苏达儿童医院基金会和明尼苏达再生医学项目资助。R.D.H. 获美国国立卫生研究院K01 DK106056项目资助，并获得梅奥诊所再生医学中心职业发展奖支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮（NTBC） | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm 套管针 | Covidien | B12STS | |
| 5 mm 套管针 | Covidien | B5SHF | |
| 内窥镜外科吻合器 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| 内窥镜外科吻合器 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| 内窥镜外科吻合器 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| 内窥镜取物袋 | Covidien | 173050G | |
| 0 号 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | 无菌敷料 |
| Williams’-E 粉末 | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 胎牛血清 | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2·2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| 胶原酶 D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning | 15-013-CV | |
| 地塞米松 | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| 表皮生长因子 | Gibco | PHG0314 |
参考文献
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in children. Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).
- Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic. BMC Medicine. 15 (1), 43(2017).
- Brunetti-Pierri, N. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications. Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2(2008).
- Carlson, D. F., et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).
- Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).
- Hickey, R. D., et al. Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene. Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).
- Hickey, R. D., et al. Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1. Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. Viral vectors: from virology to transgene expression. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Chowdhury, J. R., et al. Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits. Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).
- Elgilani, F., et al. Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1. The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).
- Patyshakuliyeva, A., et al. Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus. BMC Genomics. 14, 663(2013).
- Hickey, R. D., et al. Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease. Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).
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