本方案旨在描述猪肝细胞的分离方法 离体 通过自体细胞移植实现基因递送以治愈代谢性疾病模型。尽管该特定模型具有利于治疗成功的独特优势，但其应用仍为应对其他疾病和适应症提供了重要基础。
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摘要
摘要
基因治疗是治愈多种肝脏先天性代谢缺陷的理想选择。Ex-vivo（离体）方法中，慢病毒载体已成功用于治疗人类多种造血系统疾病，因其能够整合到宿主基因组中，从而实现外源基因的稳定表达。本方法展示了将ex vivo（离体）基因治疗技术应用于遗传性酪氨酸血症I型大型动物模型的肝细胞治疗。该过程包括：1）从自体供体/受体动物中分离原代肝细胞；2）通过慢病毒载体对肝细胞进行ex vivo（离体）基因递送；3）经门静脉注射将基因修复后的肝细胞进行自体移植。该方法的成功通常依赖于高效且无菌地切除肝脏组织，小心处理切除样本以分离出足够数量且具有活性、可用于再植入的肝细胞，实现高比例的细胞转导，以及全程采用无菌外科操作以防止感染。上述任一步骤的技术失败均可能导致可用于自体移植的活性转导肝细胞产量过低，或导致供体/受体动物发生感染。本研究所选用的人类1型遗传性酪氨酸血症（HT-1）猪模型特别适用于该方法，因为即使仅有少量修复细胞成功植入，也可凭借其相对于天然病变肝细胞的强大选择性优势，实现健康肝细胞对肝脏的重新占据。尽管这种生长选择优势并非在所有适应证中均存在，但该方法为拓展至其他适应证奠定了基础，并允许对该环境进行调控，以研究更多肝脏内外的疾病，同时可控制病毒载体的暴露水平以及脱靶毒性与致瘤风险。
引言
肝脏代谢先天性缺陷是一组遗传性疾病，总体发病率可高达每800名活产婴儿中就有1例1。其中许多疾病由单基因突变引起2，通过将一个正常的基因拷贝导入足够数量的肝细胞中，即可实现功能上的治愈3。所需纠正的肝细胞比例因疾病而异4，主要取决于该基因所编码蛋白的性质，例如是分泌性蛋白还是胞质蛋白。在大多数情况下，可通过检测血液循环中常可获得的生物标志物来便捷地评估任何针对代谢性疾病的治疗效果。
HT-1 是一种由延胡索乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）缺陷引起的肝脏先天性代谢疾病5，该酶是酪氨酸代谢途径中的最后一个酶促步骤6。FAH 缺乏会导致肝脏内毒性代谢产物蓄积，可能引发急性肝衰竭并导致死亡；在慢性病程中则可能导致肝硬化和肝细胞癌。该病的临床治疗采用 2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰)-1,3-环己二酮（NTBC）进行管理，这是一种作用于酪氨酸代谢通路中 FAH 上游酶的小分子抑制剂。该疾病为基因治疗技术的测试提供了理想模型，因为在小型和大型动物模型中，即使仅有少量肝细胞得到成功纠正，最终也能实现整个肝脏被纠正细胞重新填充
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方案
所有动物实验操作均遵循机构指南，并在研究开始前经机构动物护理与使用委员会（IACUC）审查和批准。本文所述操作均在健康且适合手术的雄性和雌性大型白猪（50%兰德瑞斯/50%大白猪遗传背景）上进行，年龄不超过3个月。 动物通常群养，除非机构兽医护理人员判断其存在不相容情况。 动物每日饲喂标准饲料两次，并由护理人员每日至少观察一次临床体征。
1. 手术准备
- 肌肉注射泰拉唑（telazol）5 mg/kg 和赛拉嗪（xylazine）2 mg/kg 以诱导镇静。皮下注射长效布托啡诺（buprenorphine SR）0.18 mg/kg 用于术后镇痛（预计该剂量镇痛效果可持续长达 72 小时）。手动检查动物对刺激的反应以确认镇静效果。
- 动物镇静后，于外周耳缘静脉插入静脉导管，以便给药。
- 术前静脉注射头孢唑林（cefazolin）25 mg/kg，肌肉注射头孢噻呋（ceftiofur）5 mg/kg。
- 术中持续静脉输注生理盐水，以维持血压和心率在正常生理范围内。
- 插入经口胃管以减压胃腔。使用合适尺寸的气管插管进行气管插管，通过手动按压胸壁观察呼气以确认插管位置正确，随后使用 1–3% 异氟烷进行机械通气。
- 连接心电图（ECG）导联、血压袖带、体温探头和脉搏血氧仪以监测并记录生命体征。将动物置于仰卧位，使用聚....
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结果
肝切除与自体移植的示意图如下所示 图1在一组接受肝切除术的5只猪的代表性队列中，大多数样本获得了较高的产量 >1 × 109 活力约为80%的肝细胞（表 2)，可为包括基因治疗在内的各种所需操作提供充足的细胞。将这5头猪所制备肝细胞中未移植的部分进行后续培养，结果显示转导并初次接种46小时后，细胞仍保持良好的活力和贴壁能力，并呈现典型的肝细胞形态。图2）。这些结果代表了一次成功的制备，而制备效果较差则表现为细胞数量少、活力低或细胞在单层中贴附能力弱。
治疗前的肝活检 Fah-/- 猪通过免疫组织化学检测未显示FAH表达图3）。初始植入效果会因移植过程中重新引入的细胞数量而异。.......
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讨论
本报告描述了一种用于治愈HT-1猪模型的ex vivo自体基因治疗策略。该方法包括部分肝切除，随后进行ex vivo肝细胞分离，并用携带校正性转基因的慢病毒转导分离的肝细胞。然后通过门静脉将校正后的自体肝细胞移植回FAH缺陷动物体内8。尽管所述方法在稍作修改后可适用于所有大型动物模型，但FAH缺陷猪具有独特的选择性环境优势，有利于校正细胞的富集13,15。该方法可有效治愈HT-1，接受治疗的动物表现出无需NTBC维持的正常生长，生化检测的代谢物和肝脏炎症生物标志物恢复正常，肝硬化和肝细胞癌（HCC）得以预防，并且在NTBC循环治疗中出现的早期纤维化完全逆转。此外，最近一项包含广泛组织学分析的研究表明，在治疗后3年未检测到任何未校正的细胞、纤维化、肝硬化或致瘤性（手稿正在审稿中）。然而，FAH基因敲除背景的应用价值还可作为研究工具，用于评估肝细胞生理学及HT-1以外多种疾病表型的广泛研究。
该.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Duane Meixner 在进行门静脉注射方面的专业支持， Steve Krage, 感谢Joanne Pederson和Lori Hillin在手术过程中的支持。本研究由明尼苏达儿童医院基金会和明尼苏达再生医学项目资助。R.D.H. 获美国国立卫生研究院K01 DK106056项目资助，并获得梅奥诊所再生医学中心职业发展奖支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基)-1,3-环己二酮（NTBC） | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm 套管针 | Covidien | B12STS | |
| 5 mm 套管针 | Covidien | B5SHF | |
| 内窥镜外科吻合器 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| 内窥镜外科吻合器 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| 内窥镜外科吻合器 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| 内窥镜取物袋 | Covidien | 173050G | |
| 0 号 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | 无菌敷料 |
| Williams’-E 粉末 | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 胎牛血清 | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Oakwood Chemical | 3631 | |
| (N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2·2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| 胶原酶 D (mg/mL) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Corning | 15-013-CV | |
| 地塞米松 | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| 表皮生长因子 | Gibco | PHG0314 |
参考文献
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in childr....
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重印与许可
