这种从血液中分离锥虫的方法依赖于锥虫表面电荷的负电性低于哺乳动物血细胞。将感染的血液置于阴离子交换柱上进行处理。该方法是非洲锥虫病最适宜的诊断手段，可提供纯净的寄生虫，用于免疫学、生物学、生物化学、药物学和分子生物学研究。
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摘要
摘要
该方法可用于从感染血液中分离引起人类和动物非洲锥虫病（HAT）的锥虫寄生虫。这是诊断HAT第一阶段的最佳方法，此外，该寄生虫纯化方法还能够用于血清学和科研检测。
人类非洲锥虫病（HAT）由采采蝇传播的Trypanosoma brucei gambiense和T. b. rhodesiense引起。相关的锥虫种类是动物锥虫病的致病因子。锥虫检测对于HAT的诊断、治疗和随访至关重要。本文所述技术是目前最敏感的寄生虫检测方法，已针对现场条件进行优化，适用于T. b. gambiense引起的HAT诊断，且可在一小时内完成。将血液加至预先调节pH至8的阴离子交换柱（DEAE纤维素）上，随后加入洗脱缓冲液。带有强负电荷的血细胞被吸附在柱上，而负电荷较弱的锥虫则通过柱体流出。收集流出的锥虫，通过离心沉淀后在显微镜下观察。此外，该方法可在不造成细胞损伤的同时保持寄生虫的感染性，从而完成其制备。
免疫学检测需要使用纯化的锥虫；它们被用于锥虫溶解试验，这是人类非洲锥虫病（HAT）血清学检测的金标准。染色后的寄生虫用于现场血清学检测中的卡片凝集试验（CATT）。来自纯化锥虫的抗原，如变异表面糖蛋白、外源性抗原，也用于多种免疫测定方法。本文所述方法专为非洲锥虫设计；因此，层析条件必须针对每种锥虫菌株进行调整，更广泛地说，还需根据每种哺乳动物宿主血液的特性进行优化。
这些引人入胜的病原体易于纯化，可用于生物化学、分子生物学和细胞生物学研究，包括与宿主细胞共培养，以研究膜受体水平、信号转导及基因表达层面的宿主-寄生虫相互关系，以及药物筛选。 体外基因缺失、突变或过表达对代谢过程、细胞骨架生成及寄生虫存活的影响研究。
引言
本文所述方法可用于从血液中分离引起人类和动物非洲锥虫病（HAT）的锥虫寄生虫。该方法是诊断HAT第一阶段的最佳手段，此外，该寄生虫纯化方法还可支持可靠的血清学和科研分析。
HAT 由采采蝇传播引起 布氏冈比亚锥虫 和 T. b. rhodesiense1. 这些原生动物寄生虫在疾病的第一阶段（血液淋巴阶段）于血液、淋巴液和组织间液中进行细胞外增殖。当寄生虫穿过血脑屏障后，即进入第二阶段（脑膜脑炎阶段），此时出现包括睡眠障碍在内的神经系统症状，该症状也正是此病名称的由来 "昏睡病" 该疾病典型的第二阶段表现2相关的锥虫（T. evansi，T. congolense，T. vivax，T. b. brucei是动物非洲锥虫病（AAT）的致病因子3.
世界卫生组织（WHO）旨在到2020年消除人类非洲锥虫病（HAT）作为公共卫生问题，并在2030年阻断其传播4。近年来，快速诊断检测方法的引入已提高了血清学诊断水平1,4,5。尽管已开发出多种分子诊断检测方法，但其在实地诊断中的作用尚未确立5。目前这些方法主要用于鉴定布鲁氏锥虫（brucei group）亚种，以及由引起动物锥虫病的寄生虫所致的非典型锥虫病6。
检测寄生虫对于诊断、治疗和随访至关重要，因为血清学检测可能产生假阳性，且不幸的是也可能出现假阴性结果1。在由T. b. gambiense（占病例数95%以上）引起的非洲人类锥虫病（HAT）中，直接显微镜观察这些血鞭毛原虫较为困难，因为通常寄生虫血症水平较低；而在由T. b. rhodesiense引起的HAT中，血液中常存在大量寄生虫。已采用多种浓缩技术，如厚滴法和毛细管离心法（CTC），但利用阴离子交换剂（DEAE纤维素）柱将寄生虫从血液中分离，再经离心并观察沉淀物的显微镜检查方法最为敏感（可检测到每毫升血液中约50个寄生虫）1,7。因此，通过阴离子交换剂（DEAE纤维素）法纯化锥虫是目前可视化和从血液中分离寄生虫以进行HAT诊断的最佳方法，也是参考标准方法。在野外条件下，已成功使用DEAE纤维素微型柱，且多项改进措施进一步便利了显微镜观察7,8。
下文所述的锥虫从血液中分离的方法依赖于寄生虫的表面电荷，其负电性低于哺乳动物血细胞9。有趣的是，该方法由希拉·兰纳姆博士（Dr. Sheila Lanham）于1968年（50年前）开发，至今仍是检测和制备血液中锥虫的金标准。该方法对来自多种哺乳动物的唾液型锥虫快速且可重复，可用于动物和人类锥虫病的诊断10。
为了获得活体且纯化的寄生虫，需将感染的血液加至阴离子交换柱上。层析条件（主要是缓冲液/培养基的pH值和离子强度）必须根据每种锥虫物种，更广泛地说，根据每种哺乳动物血细胞与锥虫的混合物进行调整10。对于大多数非洲锥虫，洗脱缓冲液的pH值需精确调节至810。该方法有利于浓缩患者血液中的寄生虫，因为寄生虫血症水平可能过低，仅靠显微镜观察难以检测，同时该方法也便于开展实验室研究。相较于长期在实验室无菌条件下培养的寄生虫，使用该技术处理新鲜分离的锥虫及感染动物的血液，对于多种研究而言更具相关性。
宿主与寄生虫关系的最佳研究方式是利用寄生虫感染其天然宿主，因此，T. musculi 作为一种典型的胞外利什曼原虫，是小鼠的天然寄生虫，具有诸多优势：小鼠感染实验使用小型实验动物，且无需生物安全等级（BSL）条件。与包括人类病原体在内的许多其他Trypanosoma物种不同，T. musculi不会导致免疫功能健全的小鼠死亡。T. musculi在T细胞缺乏的小鼠体内不会被清除，且可通过调节食物和营养摄入来提高感染小鼠的寄生虫血症水平 11。该寄生虫在与其他病原体共感染时可调节宿主的免疫应答12。从小鼠体内分离的T. musculi与体外培养的T. musculi存在差异，例如，与从小鼠体内纯化的寄生虫相比，无菌培养的T. musculi会丧失膜表面Fc受体的表达13,14。排泄-分泌因子（ESF）在无菌培养的锥虫中其定性和定量表达也较低，并且在不同地方性流行区分离的菌株之间存在差异15。ESF是最早呈递给宿主免疫系统的抗原，因此在宿主初始免疫应答中发挥重要作用16。
在用于实验室研究的实验性感染动物中，该方案有助于对更多寄生虫进行实验，尤其在使用免疫抑制动物时，可减少所需小鼠的数量。在大规模筛查中用于锥虫病卡片凝集试验（CATT）的变异表面糖蛋白（VSGs），目前仍从在大鼠体内增殖的锥虫中纯化获得。目前可用于现场检测的两种快速诊断试剂（ individually wrapped cassettes），仍然使用来自感染模型的天然VSGs，而非重组或合成抗原 体外 培养的锥虫1,4,5由于这些经DEAE纤维素纯化的锥虫可从自然或实验感染的宿主（尤其是啮齿类动物）中大量获取，因此促进了锥虫免疫学与生物学研究的进展。
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方案
研究遵循《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 85±23，1996 年修订版）。实验方案已获本单位伦理委员会批准。
1. 动物
- 实验前15天，将8至10周龄、体重20–25 g的雌性Swiss (OF-1)小鼠饲养于动物房设施中。将小鼠置于通风笼盒内，笼盒放置在温度（22 °C）和湿度（50%）受控、有防护的房间中，并维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
- 确保动物可自由获取食物和饮水。尽量减少疼痛、痛苦和应激反应，并提供环境丰富化措施。
- 饲养时使用透明侧壁的笼具，并配备木棒和纸板隧道作为丰富化设施。可轻柔地引导小鼠进入隧道，以便将其从笼中转移至手掌中。
- 每日进行监测，评估小鼠是否出现衰弱、社交回避、身体损伤、毛发竖立或缺乏理毛等异常表现。
- 每周称量每只动物体重一次，并由兽医进行定期检查。
- 对于自然致死性较弱的寄生虫，在寄生虫血症高峰期采集血液；对于可导致动物死亡的寄生虫，则在预计死亡前一天采集血液。
注：所有涉及感染性病原体的实验均根据大学批准的指南，在专用实验室内进行。
2. 缓冲液和培养基的配制
- 称取每种物质，并加入蒸馏水以配制以下缓冲液：
- 配制浓缩磷酸盐缓冲盐水（2x）：
Na2HPO4（无水）（分子量 141.96 g）10.14 g
NaH2PO4∙2H2O（分子量 156.01 g）0.62 g
NaCl（分子量 58.44 g）2.55 g
加蒸馏 H2O 至 1 L - 配制磷酸盐缓冲盐水-葡萄糖：
Na2HPO4（无水）（分子量 141.96 g）5.39 g
NaH2PO4∙2H2O（分子量 156.01 g）0.31 g
NaCl（分子量 58.44 g）1.70 g
葡萄糖（分子量 180 g）10 g
加蒸馏 H2O 至 1 L - 配制 1 M KH2PO4。
- 配制洗脱缓冲液：在磷酸盐缓冲盐水-葡萄糖中添加
青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）和酚红（5 µg/mL）。
- 配制浓缩磷酸盐缓冲盐水（2x）：
3. DEAE-纤维素的制备
- DEAE-纤维素的制备需计划约5小时。
- 在窄口烧瓶中用蒸馏水洗涤100 g DEAE-纤维素，静置沉降后弃去细小颗粒。重复洗涤直至上清液澄清。
- 加入3 L浓缩的2倍磷酸盐缓冲盐水（2x PBS），搅拌。
- 用1 M KH2PO4调节pH至8.0，并弃去上清液。
- 用蒸馏水洗涤两次，每次静置沉降。
- 用3升磷酸盐缓冲盐水-葡萄糖溶液洗涤两次，每次静置沉降后弃去上清液。
- 测量纤维素体积，加入等体积的磷酸盐缓冲盐水-葡萄糖溶液，分装至塑料瓶中，于-20 °C保存。
4. 寄生虫
- 在人类和动物锥虫病流行地区采集锥虫菌株。将寄生虫保存在液氮中冷冻。
注意：Trypanosoma musculi 对人类无致病性，是一种细胞外锥虫，可在多种实验室实验中安全替代致病性锥虫。 - 若实验室研究涉及人类病原体，须在专用的适当生物安全水平（BSL）条件下谨慎操作并采取相应预防措施； 其中 T. b. gambiense 需在 BSL2 条件下操作，T. b. rhodesiense 需在 BSL3 条件下操作。在野外条件下，应遵循标准微生物操作规范：安全采样、使用机械移液器、频繁对表面进行去污染处理，以及对废弃物进行灭菌处理。
5. 小鼠感染
- 在37 °C水浴中快速解冻寄生虫。
- 用显微镜观察一滴解冻后的感染血液。通过测量活动形态所占百分比来评估寄生虫的活力17。
- 将寄生虫通过腹腔注射注入小鼠体内（每只小鼠0.5 mL）。感染后每天用针头穿刺采集20 µL尾部血液，并在显微镜下观察。根据Herbert和Lumsden18的方法，在多个显微镜视野中计数寄生虫，或使用 血细胞计数板评估寄生虫血症水平。
- 当寄生虫血症达到为每种菌株定义的阈值时，将血液（每只小鼠1 mL）收集至含有肝素（10 U/mL）的洗脱缓冲液中（每只小鼠5 mL）。
注：Lanham和Godfrey的原始与创新性工作报道了磷酸盐缓冲盐水葡萄糖溶液对多种宿主/寄生虫物种的最佳离子强度，该溶液由pH 8.0的储备液配制而成。
6. 寄生虫分离
注意：从此时起，所有实验均须在组织培养罩内佩戴手套进行。实验所用实验室的室温和湿度分别为 22 °C 和 45%。在野外条件下，已在 34 °C 下成功完成寄生虫分离。
- 将一个10 mL注射器垂直固定在支架上，并加入预先剪好的圆形滤纸片、玻璃棉或纤维素海绵。
- 将DEAE纤维素倒入注射器中，直至达到8 mL刻度，然后用25 mL洗脱缓冲液洗涤。
- 小心地将2 mL稀释血液加至层析柱顶部，随后加入洗脱液。根据锥虫的迁移情况，定期补充洗脱缓冲液。
- 用离心管收集层析柱流出的液滴，并定期在显微镜下检查寄生虫的存在情况。
- 当在柱流出液中不再检测到寄生虫时，将收集管离心（1,800 × g，10分钟，实验室条件下为4 °C，现场条件下为室温）。
- 弃去上清液，并将寄生虫重悬于下一步实验所需的相关培养基中，体积为1 mL。
- 使用血细胞计数板对寄生虫进行计数，必要时用适当的培养基进行稀释。
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结果
纯化的锥虫已用于药物试验。可将寄生虫转移至含有特定药物系列稀释液的培养孔中，药物可单独使用或混合使用19。当仅需测试少量药物时，可通过显微镜观察活动力来评估寄生虫活力，而在线药物筛选中进行大规模活动力检测时，AlamarBlue细胞活力检测法是一种优良的方法20。参考药物戊烷脒（用于HAT治疗）的作用效果如图1所示。
巨噬细胞在培养中作为饲养细胞非常有用。它们能够 体外 锥虫培养物的启动与发育21我们已报道，在感染锥虫的哺乳动物体内，选择性激活的巨噬细胞数量增加，且此类细胞有利于寄生虫的生长。22这种替代性巨噬细胞活化可提供寄生虫生长所必需的L-鸟氨酸。 体外 巨噬细胞...
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讨论
纯化的锥虫是研究免疫学、生物化学、细胞与分子生物学的有力工具。大量来自锥虫的数据和研究成果，已帮助人们获取了有关其他真核细胞的信息30。锥虫也是重要且富有吸引力的研究对象，因为它们进化出多种机制，使其能够在两种截然不同的环境中生存和增殖：即采采蝇媒介和哺乳动物宿主23,31。已有多种分离锥虫的技术被报道，近期还发表了一篇关于基于微流控技术方法的综述32。因此，建立一种可重复且稳健的寄生虫分离方法至关重要。
DEAE纤维素的制备是本寄生虫制备方案中不可或缺的步骤。必须谨慎进行洗涤条件的控制，以去除细小颗粒并平衡树脂，同时必须精确调节pH值（pH 8.0适用于大多数锥虫物种）。所有步骤均需优化，以提高寄生虫的纯度和得率，同时维持寄生虫的活力和细胞特性。重要的是，通过DEAE-纤维素柱纯化后，寄生虫的活力和感染性得以保持。然而，某些品系比其他品系更为脆弱，纯化后可能感染性降低<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢波尔多大学IRD CIRAD UMR 177 INTERTRYP实验室的所有成员。本研究获得了波尔多大学的内部资助，以及法国国家研究局（ANR）、LABEX ParaFrap项目（ANR-11-LABX-0024）、寄生虫学与热带医学研究促进协会和法国驻班吉大使馆文化与合作处（中非共和国）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 移液管 | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL 移液管 | Falcon | 352,507 | |
| 50 mL 离心管 | Falcon | 352,070 | |
| 离心机 | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| 二乙氨基乙基纤维素（DEAE cellulose） | Santa Cruz | s/c- 211213 | 100 G |
| 滤纸 | Whatman | 1,001,125 | |
| 窄颈平底烧瓶 | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| 葡萄糖 | VWR | 101174Y | 500 G |
| 肝素 | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| 显微镜 | Olympus | CH-20 | |
| 显微镜盖玻片 | Thermofisher Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| 显微镜载玻片 | Thermofisher Scientific | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026;260 | 500 G |
| 氯化钠（NaCl） | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616;262 | 500 G |
| 125 mL Nalgene 塑料培养瓶 | Thermofisher Scientific | 342024-0125 | |
| 500 mL Nalgene 塑料培养瓶 | Thermofisher Scientific | 342024-0500 | |
| 巴斯德移液管 | VWR | BRND125400 | |
| 青霉素 10,000 IU/链霉素 10,000 µg | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| 酚红 | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| 注射器 | Dutscher | SS+10S21381 | |
| 组织培养罩 | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | 热带医学研究所（比利时安特卫普） | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | 热带医学研究所（比利时安特卫普） | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | 伦敦卫生与热带医学院（英国） | Partinico II |
参考文献
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