利用阴离子交换剂（二乙氨基乙基-纤维素柱）从血液中纯化细胞外锥虫（包括非洲锥虫）

摘要

这种从血液中分离锥虫的方法依赖于锥虫表面电荷的负电性低于哺乳动物血细胞。将感染的血液置于阴离子交换柱上进行处理。该方法是非洲锥虫病最适宜的诊断手段，可提供纯净的寄生虫，用于免疫学、生物学、生物化学、药物学和分子生物学研究。

摘要

该方法可用于从感染血液中分离引起人类和动物非洲锥虫病（HAT）的锥虫寄生虫。这是诊断HAT第一阶段的最佳方法，此外，该寄生虫纯化方法还能够用于血清学和科研检测。

人类非洲锥虫病（HAT）由采采蝇传播的Trypanosoma brucei gambiense和T. b. rhodesiense引起。相关的锥虫种类是动物锥虫病的致病因子。锥虫检测对于HAT的诊断、治疗和随访至关重要。本文所述技术是目前最敏感的寄生虫检测方法，已针对现场条件进行优化，适用于T. b. gambiense引起的HAT诊断，且可在一小时内完成。将血液加至预先调节pH至8的阴离子交换柱（DEAE纤维素）上，随后加入洗脱缓冲液。带有强负电荷的血细胞被吸附在柱上，而负电荷较弱的锥虫则通过柱体流出。收集流出的锥虫，通过离心沉淀后在显微镜下观察。此外，该方法可在不造成细胞损伤的同时保持寄生虫的感染性，从而完成其制备。

免疫学检测需要使用纯化的锥虫；它们被用于锥虫溶解试验，这是人类非洲锥虫病（HAT）血清学检测的金标准。染色后的寄生虫用于现场血清学检测中的卡片凝集试验（CATT）。来自纯化锥虫的抗原，如变异表面糖蛋白、外源性抗原，也用于多种免疫测定方法。本文所述方法专为非洲锥虫设计；因此，层析条件必须针对每种锥虫菌株进行调整，更广泛地说，还需根据每种哺乳动物宿主血液的特性进行优化。

这些引人入胜的病原体易于纯化，可用于生物化学、分子生物学和细胞生物学研究，包括与宿主细胞共培养，以研究膜受体水平、信号转导及基因表达层面的宿主-寄生虫相互关系，以及药物筛选。 体外基因缺失、突变或过表达对代谢过程、细胞骨架生成及寄生虫存活的影响研究。

引言

本文所述方法可用于从血液中分离引起人类和动物非洲锥虫病（HAT）的锥虫寄生虫。该方法是诊断HAT第一阶段的最佳手段，此外，该寄生虫纯化方法还可支持可靠的血清学和科研分析。

HAT 由采采蝇传播引起 布氏冈比亚锥虫 和 T. b. rhodesiense¹. 这些原生动物寄生虫在疾病的第一阶段（血液淋巴阶段）于血液、淋巴液和组织间液中进行细胞外增殖。当寄生虫穿过血脑屏障后，即进入第二阶段（脑膜脑炎阶段），此时出现包括睡眠障碍在内的神经系统症状，该症状也正是此病名称的由来 "昏睡病" 该疾病典型的第二阶段表现²相关的锥虫（T. evansi，T. congolense，T. vivax，T. b. brucei是动物非洲锥虫病（AAT）的致病因子³.

世界卫生组织（WHO）旨在到2020年消除人类非洲锥虫病（HAT）作为公共卫生问题，并在2030年阻断其传播⁴。近年来，快速诊断检测方法的引入已提高了血清学诊断水平^1,4,

方案

研究遵循《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 85±23，1996 年修订版）。实验方案已获本单位伦理委员会批准。

1. 动物

1. 实验前15天，将8至10周龄、体重20–25 g的雌性Swiss (OF-1)小鼠饲养于动物房设施中。将小鼠置于通风笼盒内，笼盒放置在温度（22 °C）和湿度（50%）受控、有防护的房间中，并维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
2. 确保动物可自由获取食物和饮水。尽量减少疼痛、痛苦和应激反应，并提供环境丰富化措施。
3. 饲养时使用透明侧壁的笼具，并配备木棒和纸板隧道作为丰富化设施。可轻柔地引导小鼠进入隧道，以便将其从笼中转移至手掌中。
4. 每日进行监测，评估小鼠是否出现衰弱、社交回避、身体损伤、毛发竖立或缺乏理毛等异常表现。
5. 每周称量每只动物体重一次，并由兽医进行定期检查。
6. 对于自然致死性较弱的寄生虫，在寄生虫血症高峰期采集血液；对于可导致动物死亡的寄生虫，则在预计死亡前一天采集血液。
   注：所有涉及感染性病原体的实验均根据大学批准的指南，在专用实验室内进行。

2. 缓冲液和培养基的配制

1. 称取每种物质，并加入蒸馏水以配制以下缓冲液：
   1. 配制浓缩磷酸盐缓冲盐水（2x）：
      ....

结果

纯化的锥虫已用于药物试验。可将寄生虫转移至含有特定药物系列稀释液的培养孔中，药物可单独使用或混合使用¹⁹。当仅需测试少量药物时，可通过显微镜观察活动力来评估寄生虫活力，而在线药物筛选中进行大规模活动力检测时，AlamarBlue细胞活力检测法是一种优良的方法²⁰。参考药物戊烷脒（用于HAT治疗）的作用效果如图1所示。

巨噬细胞在培养中作为饲养细胞非常有用。它们能够 体外 锥虫培养物的启动与发育²¹我们已报道，在感染锥虫的哺乳动物体内，选择性激活的巨噬细胞数量增加，且此类细胞有利于寄生虫的生长。²²这种替代性巨噬细胞活化可提供寄生虫生长所必需的L-鸟氨酸。 体外 巨噬细胞.......

讨论

纯化的锥虫是研究免疫学、生物化学、细胞与分子生物学的有力工具。大量来自锥虫的数据和研究成果，已帮助人们获取了有关其他真核细胞的信息³⁰。锥虫也是重要且富有吸引力的研究对象，因为它们进化出多种机制，使其能够在两种截然不同的环境中生存和增殖：即采采蝇媒介和哺乳动物宿主^23,31。已有多种分离锥虫的技术被报道，近期还发表了一篇关于基于微流控技术方法的综述³²。因此，建立一种可重复且稳健的寄生虫分离方法至关重要。

DEAE纤维素的制备是本寄生虫制备方案中不可或缺的步骤。必须谨慎进行洗涤条件的控制，以去除细小颗粒并平衡树脂，同时必须精确调节pH值（pH 8.0适用于大多数锥虫物种）。所有步骤均需优化，以提高寄生虫的纯度和得率，同时维持寄生虫的活力和细胞特性。重要的是，通过DEAE-纤维素柱纯化后，寄生虫的活力和感染性得以保持。然而，某些品系比其他品系更为脆弱，纯化后可能感染性降低<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 移液管	Falcon	357,551
2 mL 移液管	Falcon	352,507
50 mL 离心管	Falcon	352,070
离心机	Sigma Aldrich	4K15
二乙氨基乙基纤维素（DEAE cellulose）	Santa Cruz	s/c- 211213	100 G
滤纸	Whatman	1,001,125
窄颈平底烧瓶	Duran	21 711 76	6000 mL
葡萄糖	VWR	101174Y	500 G
肝素	Sigma Aldrich	H3149-50KU	5 000 U
KH2PO4	VWR	120 26936.260	500 G
显微镜	Olympus	CH-20
显微镜盖玻片	Thermofisher Scientific	CB00100RA020MNT0
显微镜载玻片	Thermofisher Scientific	AGAA000001
Na2HPO4	VWR	100 28026;260	500 G
氯化钠（NaCl）	VWR	27800.291	1 KG
NaH2PO4	VWR	110 33616;262	500 G
125 mL Nalgene 塑料培养瓶	Thermofisher Scientific	342024-0125
500 mL Nalgene 塑料培养瓶	Thermofisher Scientific	342024-0500
巴斯德移液管	VWR	BRND125400
青霉素 10,000 IU/链霉素 10,000 µg	EUROBIO	CABPES01 OU	100 mL
酚红	Sigma Aldrich	P0290	100 mL
注射器	Dutscher	SS+10S21381
组织培养罩	Thermoelectro Corporation	MSC-12
Trypanosoma brucei brucei	热带医学研究所（比利时安特卫普）		ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense	热带医学研究所（比利时安特卫普）		ITMAP 1893
Trypanosoma musculi	伦敦卫生与热带医学院（英国）		Partinico II