本文报道了一种纳菲昂（Nafion）包覆、聚苯胺功能化、电化学还原氧化石墨烯化学电阻型微 pH 传感器的制备方案。这种基于化学电阻的固态微 pH 传感器可在乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）发酵过程中实时检测 pH 变化。
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摘要
摘要
本文报道了一种基于聚苯胺功能化的电化学还原氧化石墨烯（ERGO-PA）的固态微pH传感器的构建。电化学还原氧化石墨烯作为导电层，聚苯胺作为pH敏感层。聚苯胺的pH依赖性电导率变化源于质子化过程中空穴的掺杂以及去质子化过程中空穴的脱掺杂。我们发现，ERGO-PA固态电极在发酵过程中无法直接有效工作，因为细菌在发酵过程中产生的电化学活性物质会干扰电极响应。我们成功地在ERGO-PA上应用了Nafion作为质子传导层。涂覆Nafion的电极（ERGO-PA-NA）在化学电阻型传感器测量中表现出良好的灵敏度，为1.71 Ω/pH（pH 4–9）。我们在实时乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）发酵过程中测试了ERGO-PA-NA电极。在L. lactis生长期间，培养基的pH值从7.2变化至4.8，ERGO-PA-NA固态电极的电阻值从294.5 Ω变化至288.6 Ω（每2.4个pH单位变化5.9 Ω）。将ERGO-PA-NA电极的pH响应与传统玻璃基pH电极的响应进行比较，结果表明，无需参比电极的固态微传感器阵列可在微生物发酵过程中成功运行。
引言
pH 在许多化学和生物过程中起着至关重要的作用。即使 pH 值的微小变化也会改变过程，并对实验结果产生不利影响。因此，有必要在实验的每个阶段监测和控制 pH 值。基于玻璃的 pH 电极已成功用于监测多种化学和生物过程中的 pH，但玻璃电极的使用在 pH 测量中存在若干局限性。基于玻璃的 pH 电极相对体积较大、易碎，且可能存在电解质向样品中少量泄漏的情况。此外，在 96 孔筛选发酵系统中，电极及配套电子设备的成本相对较高。而且，电化学传感器具有侵入性，并会消耗样品。因此，使用非侵入式、无需参比电极的传感器更具优势。
如今，微型化反应系统在许多化学工程和生物技术应用中备受青睐，因为这些微系统相较于宏观系统具有增强的过程控制能力以及其他诸多优势。在微型化系统中监测和控制参数是一项具有挑战性的任务，因为用于测量pH和O2等参数的传感器尺寸也必须相应缩小。生物系统用微反应器的成功制备需要多种类型的分析工具以实现过程监控。因此，智能微传感器的开发在微反应器中开展生物过程方面发挥着重要作用。
近年来，已有多种尝试利用化学电阻型传感材料（如碳纳米管和导电聚合物）开发智能pH传感器1。这类化学电阻型传感器无需参比电极，且易于与电子电路集成。成功的化学电阻型传感器使得制造出成本低、易于生产、检测所需样品体积小且具有无创特性的智能传感器成为可能。
本文报道了一种制备含有聚苯胺功能化、电化学还原氧化石墨烯的电极的方法。该化学电阻式电极可在乳酸乳球菌（L. lactis）发酵过程中作为pH传感器使用。L. lactis 是一种产乳酸的细菌，常用于食品发酵和食品防腐过程。在发酵过程中，乳酸的生成导致pH降低，当pH降至较低水平时，该细菌的生长即停止2,3,4。
发酵培养基是一种复杂的化学环境，含有倾向于干扰传感器表面的多肽、盐类和氧化还原分子5,6,7,8,9。本研究表明，基于化学电阻材料并具有适当表面保护层的pH传感器可用于在此类复杂的发酵培养基中测量pH值。在本研究中，我们成功地将Nafion用作聚苯胺包覆的电化学还原氧化石墨烯的保护层，以在乳酸乳球菌（L. lactis）发酵过程中实时测量pH值。
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方案
1. 氧化石墨的制备
注意：氧化石墨按照 Hummers 法制备10,11。
- 将3 g石墨加入69 mL浓H2SO4中，搅拌至石墨完全分散。加入1.5 g亚硝酸钠，持续搅拌并静置1小时。随后将容器置于冰浴中。
- 将9 g高锰酸钾加入上述分散液中，然后将容器从冰浴中取出，使溶液升温至室温。
- 首先逐滴加入138 mL蒸馏水，然后继续加入420 mL蒸馏水。使用加热板将温度维持在90 °C，持续15分钟。向分散液中加入7.5 mL 30%过氧化氢溶液。
- 在10,000 × g条件下离心20分钟收集产物，弃去上清液。用温热的重蒸水洗涤沉淀4次，再用10% HCl（v/v）溶液洗涤2次。最后用乙醇洗涤2次，并在50 °C烘箱中干燥。
2. GO 沉积电极的制备
- 将10 mg氧化石墨分散于10 mL水中，然后在超声波水浴中处理6小时。
- 以2,700 × g离心30分钟，去除未剥离的氧化石墨片层。离心后弃去沉淀的固体颗粒，取上清液用于后续实验。
注意：本实验将上述剥离后的氧化石墨分散液作为储备液使用。 - 将氧化石墨储备液稀释两倍。每次实验前均需用储备液新鲜配制工作液。
- 取2 µL氧化石墨工作液滴加于暴露的叉指金电极表面（图1A 和 图2）。滴涂后，在室温下干燥12小时，即得氧化石墨沉积电极。
3. 将氧化石墨烯还原为电化学还原氧化石墨烯
- 将电极插入聚二甲基硅氧烷（PDMS）电极支架（底部部件）中。将电极支架的另一部分（作为溶液储液池）放置在电极上方，如图1A - 1C所示。使用两个回形针将两部分夹紧，组装成完整支架。确保PDMS支架不覆盖沉积有氧化石墨烯（GO）的电极部分。
- 用移液器向储液池中加入300 µL的0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7）。然后将参比电极和对电极放入溶液中，使电极靠近GO薄膜表面，如图1C所示。该装置构成一个电化学池，用于进行氧化石墨烯的电化学还原及聚苯胺的沉积。
- 将电极与连接至计算机的电化学工作站相连，以采集数据。采用循环伏安法进行电化学还原：设定电位范围为0至-1.2 V，扫描速率为50 mV/s。在电极上对电压进行0至-1.2 V的循环扫描，共10次（图3）。
- 实验结束后，从支架中取出电极，并用双蒸水反复冲洗。随后将电极置于101 °C的烘箱中干燥12小时。
- 电极干燥后，从烘箱中取出，使其冷却至室温。然后使用万用表测量电极的导电性。此时该电极称为电化学还原氧化石墨烯（ERGO）电极。
4. ERGO 电极的聚苯胺功能化
- 准备用于聚苯胺功能化的10 mM苯胺单体。将5 µL的10 mM苯胺溶解于5 mL的1 M H2SO4中。
- 进行聚苯胺功能化时，向溶液储液池中加入300 µL苯胺单体。将沉积有ERGO的电极按GO还原步骤中的描述放入电极夹具中。
- 采用循环伏安法将苯胺电化学聚合，以实现ERGO向ERGA-聚苯胺（ERGO-PA）的功能化：选择0至0.9 V为电位范围，扫描速率为50 mV/s。在0至0.9 V之间对电极进行50次循环扫描（图4）。
- 聚苯胺沉积完成后，取出电极并用双蒸水反复清洗。然后将电极置于80 °C烘箱中干燥12小时。
- 从烘箱中取出电极，待其冷却至室温后，使用万用表测量电极的导电性。
- 通过向Britton-Robinson缓冲液中逐滴加入0.2 M NaOH，配制pH为5的缓冲溶液，直至pH达到5（见步骤5.1）。将电极置于pH 5的缓冲液中浸泡24小时。
- 配制Britton-Robinson通用缓冲溶液时，将0.04 mol磷酸、0.04 mol乙酸和0.04 mol硼酸溶于800 mL超纯水中。逐滴加入0.2 M氢氧化钠溶液调节pH至所需值4，再用超纯水定容至1 L。
5. 不同 pH 条件下 ERGO-PA 电极的测试（Nafion 涂层前的预校准）
- 在 pH 5 的缓冲溶液中对电极进行预处理后，测量该电极在不同 pH 溶液（pH 4 至 pH 9；见图 5）中的电阻。
- 进行该测量时，将电极直接浸入缓冲溶液中，并将电极的另一部分连接至计算机控制的电化学工作站以采集数据。通过滴加 0.2 M NaOH 调节 pH 值。
- 从技术列表中选择计时电位法或计时电流法（i-t 曲线），并在电极上施加 100 mV 的电势差。
注意：电化学工作站测量电流随时间的变化。控制电化学工作站的软件可提供电流随时间变化的图形表示。 - 利用欧姆定律（电阻等于电压除以电流），根据测得的电流和施加的电压计算电阻值。
- 测量完成后，在室温下将电极干燥 12 小时。
6. Nafion 涂层 ERGO-PA 电极的制备
- 在 ERGO-PA 电极表面加入 5 µL 的 5 wt% Nafion 溶液，并将电极在室温下干燥 12 小时。
- Nafion 涂层完成后，将电极置于 pH 5 的缓冲溶液中浸泡 24 小时，然后再进行 pH 测量。
- 在 pH 5 条件下活化后，取出 Nafion 涂层的 ERGO-PA 电极（ERGO-PA-NA），并按照第 5.1 节所述方法测量电极在 pH 4 至 pH 9 范围内的电阻（图 6）。
7. 准备 L. lactis 培养基
- 将9.3 g M17粉末加入250 mL超纯水中。缓慢搅拌溶液，直至粉末完全溶解。在121 °C下高压灭菌15分钟。
- 取一个250 mL的无菌锥形瓶，放入磁力搅拌子，向瓶中加入50 mL已灭菌的M17培养基。然后加入8 mL已高压灭菌的1 M葡萄糖溶液。接种10 µL先前在同一培养基中培养的L. lactis菌液。
注意：细菌菌株由格罗宁根大学分子遗传学系Jan Kok提供。 - 将接种后的培养液置于30 °C的培养箱中，在磁力搅拌器上搅拌培养18小时，并监测pH值。
8. 在 L. lactis 发酵实验中测试ERGO-PA-NA的pH响应
- 将 ERGO-PA-NA 电极放入 L. lactis 培养物中，并用棉塞封闭。然后将装置置于 30 °C 恒温环境中培养 L. lactis。
- 对电极施加 100 mV 电压，并测量电流随时间的变化。
- 在不同时间点取 0.5 mL 样品（例如参见 图 7），使用常规玻璃电极离线测定 600 nm 处的光密度和 pH 值。持续进行测量，直至培养物的光密度保持恒定，表明细菌已停止生长。
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结果
在约 -1.0 V 处出现一个明显的还原峰（图3），表明氧化石墨烯（GO）被还原为电化学还原氧化石墨烯（ERGO）12,13,14,22。该峰的强度取决于电极上 GO 层数的多少。一层厚实的黑色薄膜完全覆盖了电极上的金线。此时，由于 GO 连接了两根绝缘的金电极，使得两个电极之间具有导电性。苯胺的电聚合在 ERGO 上沉积形成一层绿色薄膜15,16,17,18,
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讨论
氧化石墨烯（GO）层在沉积后必须完全覆盖金电极导线。如果金电极未被GO覆盖，聚苯胺不仅会沉积在电化学还原氧化石墨烯（ERGO）上，还会直接沉积在暴露的金电极导线上。聚苯胺在金电极导线上的沉积可能会影响电极的性能。在将GO还原为ERGO后，需在100 °C下干燥电极，以增强ERGO层与金电极导线之间的结合力。每个电极的电阻取决于沉积在金电极上的GO层数量。因此，确保每个电极使用相同浓度的GO至关重要，而要制造出电阻处于与测量电路兼容的预设范围内的电极则较为困难。这限制了电极的大规模生产。
通过电化学方法制备还原氧化石墨烯/聚苯胺相较于其他已报道的制备方法具有一些优势。此处介绍的电化学方法无需使用强还原剂和强氧化剂。例如，肼和过硫酸铵）23,26此外，材料可直接沉积在电极上，无需进一步处理，使制备过程更加快速简便。由于氧化石墨烯（GO）在电化学过程中被还原 原位金与石墨烯之间实现了良好的连接，使pH电极更加稳定。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢格罗宁根大学提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 石墨薄片 | Sigma Aldrich | ||
| 硫酸 (H2SO4) | Merck | ||
| 亚硝酸钠 (NaNO2) | Sigma Aldrich | ||
| 高锰酸钾 (KMnO4) | Sigma Aldrich | ||
| 30 % H2O2 | Sigma Aldrich | ||
| HCl | Merck | ||
| 苯胺 | Sigma Aldrich | ||
| 5wt % Nafion | Sigma Aldrich | ||
| M17 粉末 | BD Difco | ||
| 磷酸 (H3PO4) | Sigma Aldrich | ||
| 硼酸 (HBO3) | Merck | ||
| 乙酸 | Merck | ||
| 氢氧化钠 | Sigma Aldrich | ||
| 磷酸二氢钾 | Sigma Aldrich | ||
| 磷酸氢二钾 | Sigma Aldrich | ||
| Au 叉指电极 | BVT technology - CC1 W1 | ||
| 电化学工作站 | CH Instruments Inc (CH-600, CH-700) |
参考文献
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