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大鼠注射脂多糖诱导的亚急性脑微出血

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DOI：

10.3791/58423

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2018年10月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种通过向Sprague-Dawley大鼠注射脂多糖（LPS）来诱导并检测慢性微出血（CMHs）的实验方案，该方法可用于未来关于CMHs发病机制的研究。

摘要

脑微出血（CMHs）在老年患者中较为常见，且与多种神经精神疾病相关。CMHs的病因复杂，常伴随神经炎症的发生。本文介绍了一种通过脂多糖（LPS）注射诱导的亚急性CMH大鼠模型，以及检测CMHs的方法。全身性LPS注射操作相对简便、经济且成本较低。LPS注射的一个主要优势在于其诱导炎症反应的稳定性。通过LPS注射引起的CMHs可通过肉眼观察、苏木精-伊红（HE）染色、普鲁士蓝染色、伊文思蓝（EB）双标法以及磁共振成像-磁敏感加权成像（MRI-SWI）技术进行检测。最后，本文还讨论了其他建立CMH动物模型的方法及其各自的优点和/或局限性。

引言

经典脑微出血（CMHs）是指脑内红细胞中的血红蛋白降解产物（如含铁血黄素）在血管周围形成的微小沉积1。根据鹿特丹扫描研究，约17.8%的60至69岁人群和38.3%的80岁以上人群中可发现CMHs2。老年人群中CMHs的患病率相对较高，且已有研究证实CMHs的累积与认知功能障碍及神经精神功能障碍之间存在相关性3,4。近年来已报道多种CMHs的动物模型，包括通过IV型胶原酶立体定位注射诱导的啮齿类动物模型5、APP转基因模型6、β-N-甲基氨基-L-丙氨酸暴露模型7以及高血压模型8，其中由系统性炎症诱导的CMHs模型是目前最受认可的选择之一。Fisher et al.9首次使用来自Salmonella typhimurium的脂多糖（LPS）建立急性CMHs小鼠模型。随后，该研究团队采用相同方法进一步建立了亚急性CMHs小鼠模型2。

脂多糖（LPS）被认为是通过腹腔注射诱导炎症反应的标准刺激物。via 腹腔注射。先前的研究已证实，LPS 注射可导致神经炎症，表现为动物模型中大量小胶质细胞和星形胶质细胞的活化2,10。此外，神经炎症活化程度与脑微出血（CMHs）数量之间存在正相关关系已得到证实2,10。基于这些前期研究，我们拟通过腹腔注射 LPS 建立 CMHs 大鼠模型。

检测技术的进步使得关于脑微出血（CMHs）的研究日益增多。目前公认的CMHs检测方法包括苏木精和伊红（HE）染色检测红细胞、普鲁士蓝染色法检测三价铁离子9、免疫荧光成像检测伊文思蓝（EB）沉积，以及7.0特斯拉磁共振成像-磁敏感加权成像（MRI-SWI）10。本研究旨在建立一种CMHs的筛查方法。

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方案

本文所述所有方法均已获得中国人民解放军陆军总医院动物护理与使用委员会（ACUC）的批准。

1. 材料

  1. 脂多糖（LPS）注射液的制备
    1. 将25 mg来源于S. typhimurium的LPS粉末溶于25 mL蒸馏水中，配制成终浓度为1 mg/mL的溶液。将注射液置于无菌管中，4 °C保存。
      注意：LPS具有毒性。
    2. 用0.9%生理盐水配制2%伊文思蓝（EB）溶液，使EB注射液保持工作浓度。

2. 动物

  1. 通过腹腔注射的方式，向10周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（平均体重：280 ± 20 g）给予LPS。
    注意：若大鼠从其他机构购买，则适应期不应少于7天。

3. LPS 注射

  1. 向每只大鼠腹腔注射1 mg/kg的LPS，然后将大鼠放回原笼具中。
    注意：无需麻醉。
  2. 6小时后，向大鼠注射相同剂量的LPS。
  3. 16小时后，向大鼠注射相同剂量的LPS。
    警告：以1 mg/kg剂量向SD大鼠注射LPS可能导致5%的死亡率。在幼龄、老龄或妊娠雌性大鼠中，死亡率可能进一步升高。
  4. 将大鼠注射LPS后放回笼中，并提供 随意摄取 饮食获取
    注意：大鼠将表现出明显的全身性炎症反应，因此在整个实验过程中必须保持笼具清洁。 大鼠在首次注射LPS后应每天监测两次体重、一般外观和精神状态。如果大鼠开始出现弓背姿势、不愿移动、明显体重减轻（>20%），需对卟啉染色阳性小鼠在7天EB实验终点前实施人道安乐死。

4. 样本采集

  1. EB 注射
    1. 首次注射后第 7 天，根据已批准的 IACUC 方案，通过腹腔注射麻醉大鼠。 
    2. 等待 1–2 分钟，直至大鼠角膜反射消失。对每只大鼠进行 5–8 mm 深的心脏穿刺；穿刺点应位于胸骨左缘第 3 与第 4 肋间间隙，距离胸骨左缘约 5 mm。
    3. 待血液回流出现后，将伊文思蓝（EB）以 0.2 mL/100 g 体重的剂量注入左心室。
      警告：心脏穿刺和 EB 注射操作需谨慎。EB 可能误注入胸腔或心包腔而非左心室。
      1. 注射前，先用空管回抽，再更换为含 EB 的注射管，有助于降低操作失败率（例如，误将 EB 注入肋骨）。
    4. 将大鼠保持仰卧位 10 分钟。
      注意：若样本不用于免疫荧光成像中 EB 渗漏的检测，则此步骤可省略。
  2. 肉眼观察
    1. 使用冰冻的 1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）进行心脏灌注，以清除脑血管及脑组织中的血液。
      1. 使用手术刀沿膈肌全长做腹部切口。
      2. 在肋骨中线左侧稍偏处剪开肋骨。
      3. 打开胸腔，使用止血钳暴露心脏并促进血液及其他液体的排出。
      4. 用镊子稳定夹持心脏（此时心脏应仍在跳动），将针头直接插入左心室突出部位，插入深度约 5 mm，并在穿刺入口附近夹紧固定针头。
        警告：切勿过度插入针头，以免刺穿心室内壁，影响灌注液的循环。
      5. 打开阀门，使用灌注泵以约 20 mL/min 的缓慢稳定流速灌注冰冻 PBS 溶液（200–300 mL）。若动物需固定而非仅进行肉眼观察，则改用相同体积的冰冻 0.9% 生理盐水溶液。
      6. 使用锐利剪刀剪开心房，确保灌注液持续流动。若液体流动不畅或从动物鼻孔或口腔流出，应重新调整针头位置。
    2. 通过肉眼观察筛查脑微出血灶（CMHs）。
      注意：若样本不用于通过肉眼观察计数 CMHs 数量，则此步骤可省略。
  3. 固定
    1. 使用冰冻的 0.9% 生理盐水溶液（200–300 mL）进行心脏灌注，以清除脑血管及脑组织中的血液。
    2. 使用冰冻的 4% 多聚甲醛溶液进行心脏灌注，用于组织固定。
    3. 断头取脑，分离脑组织，并将脑浸入 20% 蔗糖溶液中，至少固定 6 小时。
    4. 更换为 30% 蔗糖溶液，继续固定 6 小时。
  4. 使用冷冻切片机制备 10 mm 厚的脑组织切片。

5. 苏木精-伊红染色（HE染色）

注意：本实验使用苏木精-伊红（HE）染色试剂盒进行。

  1. 用蒸馏水清洗载玻片。
  2. 用苏木精溶液染色 8 分钟。用流动的自来水冲洗 5 分钟。
  3. 用 1% 酸性乙醇分化 30 秒。用流动的自来水冲洗 1 分钟。
  4. 用 0.2% 氨水（蓝化）或饱和碳酸锂溶液染色 30 秒至 1 分钟。用流动的自来水冲洗 5 分钟。
  5. 在 95% 乙醇中漂洗（10 次浸洗）。
  6. 用伊红溶液复染 30 秒至 1 分钟。
  7. 依次通过 95% 乙醇、两次更换无水乙醇脱水，每次 5 分钟。
  8. 用二甲苯透明 30 秒。
  9. 采用刘氏法封片9。
  10. 使用明场荧光显微镜观察。
    注意：从血管中释放的红细胞是 CMHs 的组成部分，在 HE 染色下呈红橙色。

6. Perl 普鲁士蓝染色

注意：本实验使用Perls染色试剂盒进行。

  1. 用蒸馏水清洗载玻片。
  2. 将载玻片置于反应液中染色，反应液由等量的亚铁氰化钾与盐酸混合而成，染色时间为10分钟。
  3. 脱水、透明、封片，并按照步骤5.7–5.10所述方法进行分析。

7. EB 双重染色

注意：本步骤接续步骤 4.1.3。

  1. 用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤三次。
  2. 将载玻片在 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液中室温孵育 15 分钟。
  3. 用 PBS 溶液洗涤载玻片三次，每次 5 分钟，然后用 PBS-甘油溶液封片。
  4. 在荧光显微镜下分析图像。EB 沉积表现为红色荧光；细胞核表现为蓝色荧光。

8. MRI-SWI

  1. 在配备有源屏蔽梯度系统（16 cm 内径）的 7-T 磁体上进行 MRI 扫描。
  2. 治疗后 7 天，使用异氟烷麻醉系统通过面罩吸入 1.5–2.0% 异氟烷对大鼠进行麻醉。
  3. 在大鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间眼睛干涩。
  4. 将大鼠保持俯卧位，并进行 MRI-SWI 扫描。
  5. 采用快速自旋回波序列获取 SWI 加权图像，参数如下：回波时间（TE）8 ms，重复时间（TR）40 ms，翻转角=12°，视野（FOV）35 mm × 35 mm，采集矩阵 384 × 384，以获取厚度为 1 mm 的切片。
  6. 根据 Greenberg et al.11 的标准在 MRI-SWI 中识别脑微出血灶（CMHs），包括以下标准：(1) 直径 ≤10 mm；(2) 圆形、孤立且信号强度低的病灶。
  7. 实验结束时，采用过量二氧化碳（流速 6 L/min 或容器体积的 30%）的方法处死大鼠。

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结果

CMH 可通过多种方法进行检测。目前最广泛接受的方法包括：（1）肉眼观察和评估表面 CMH（见图1，上图）；（2）通过苏木精-伊红（HE）染色检测红细胞（见图2A，上图），或通过普鲁士蓝染色检测红细胞裂解释放的三价铁（图2A，下图）；（3）伊文思蓝（EB）双染法检测血脑屏障渗漏所致的 EB 沉积（图3，左图）；（4）磁共振成像 SWI 序列检测 CMH 的低信号表现（图4，左图）。

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讨论

近年来，关于脑微出血（CMHs）的研究逐渐增多。然而，CMHs的发病机制仍不明确，促使科学家建立模拟该特定状况的动物模型。例如，Hoffmann et al. 建立了一种由缺氧诱导的CMHs小鼠模型，表明CMHs由缺氧及脑血管自身调节功能障碍所致12。Reuter et al.5在APP23转基因小鼠中建立了CMHs模型，结果显示脑淀粉样血管病（CAA）在CMHs的病因学中起主要作用。Fisher et al.报道了一种通过注射LPS诱导的CMHs小鼠模型9，揭示了炎症是导致CMHs的原因之一2,13,14。类似地，我们已成功利用LPS注射在SD大鼠中建立了一种亚急性CMHs模型，并发现一氧化氮合酶（NOS），特别是神经元型NOS和内皮型NOS，参与了CMH...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢首都医科大学雷建锋老师及其同事在磁共振成像方面的指导。同时感谢宜昌市第二人民医院神经内科曾静提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LPSSigma-AldrichL-2630用于诱导炎症
EBSigma-aldrichE2129用于检测EB渗漏
DAPI染色液ServicbioG1012免疫荧光计数用介质
Perl’s普鲁士蓝染色试剂SolarbioG1424普鲁士蓝染色试剂盒
苏木精-伊红（HE）染色SolarbioG1120HE染色试剂盒
水合氯醛Sigma-Aldrich47335U用于麻醉
磷酸盐缓冲液（PBS）SolarbioP1022实验中常用的缓冲溶液
0.9%生理盐水溶液Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., 中国灌注用溶液
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127常用于固定的溶液
20%蔗糖溶液SolarbioG2461常用于固定的溶液
30%蔗糖溶液SolarbioG2460常用于固定的溶液
兽用眼膏Solcoseryl眼用凝胶，Bacel，瑞士用于大鼠眼部保护

参考文献

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