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方法文章

成年斑马鱼损伤模型用于研究泼尼松龙在骨组织再生中的作用

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DOI：

10.3791/58429

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2018年10月18日

 , 
1CRTD – Center for Regenerative Therapies Dresden, TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, TU Dresden

本文内容

摘要

本文介绍了3种成年斑马鱼损伤模型及其与免疫抑制药物治疗的联合应用。我们提供了再生组织成像以及其中骨矿化检测的技术指导。

摘要

斑马鱼能够再生多种器官，包括在截肢后再生附肢（鳍）。这一过程涉及骨骼的再生，骨骼在损伤后大约两周内重新生长。此外，斑马鱼在颅骨开窗术后能够快速愈合骨骼，并修复可轻易引入斑马鱼骨性鳍条中的骨折。这些损伤模型为测试给药药物对快速形成骨组织的影响提供了可行的实验范式。本文描述了这三种损伤模型的应用，及其与全身性糖皮质激素处理的联合使用方法；糖皮质激素具有抑制骨形成和免疫抑制作用。我们提供了一套针对成年斑马鱼进行免疫抑制处理的实验准备流程，详细说明了如何实施鳍截除、颅骨开窗术以及鳍条骨折操作，并阐述了糖皮质激素如何影响成骨细胞（负责骨形成）以及单核细胞/巨噬细胞谱系细胞——后者作为先天免疫系统的一部分参与骨组织的反应。

引言

斑马鱼是研究脊椎动物发育和疾病的强大动物模型。这主要因为它们体型小，繁殖能力极强，且其基因组已完全测序，易于进行遗传操作。1其他优势包括可在不同阶段进行持续的活体成像。 体内 成年斑马鱼成像2以及在斑马鱼幼鱼中进行高通量药物筛选的能力3此外，斑马鱼在包括骨骼在内的多种器官和组织中具有很强的再生能力，因此可作为研究骨骼疾病与修复的有用模型系统4,5.

糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIO）是一种由于长期使用糖皮质激素治疗所导致的疾病，例如在哮喘或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病治疗过程中。约30%接受糖皮质激素治疗的患者会发展为GIO，这构成了一个重要的健康问题6；因此，深入研究免疫抑制对骨组织的影响至关重要。近年来，已开发出多种用于研究GIO发病机制的斑马鱼模型。例如，已在斑马鱼幼体中成功诱导由糖皮质激素介导的骨量丢失，并通过药物筛选鉴定了可增加骨量的拮抗化合物7。此外，糖皮质激素诱导的骨抑制效应也已在斑马鱼鳞片中模拟实现，包括体外（in vitro）和体内（in vivo）模型8,9。这些检测方法是非常有说服力的研究手段，尤其适用于发现新的免疫抑制剂和促骨形成药物。然而，这些模型仅部分涉及内骨骼，且未在再生背景下进行。因此，它们无法用于研究糖皮质激素介导的效应在成体快速再生性骨形成过程中的作用。

在此，我们介绍一种实验方案，使研究人员能够研究糖皮质激素对成年斑马鱼在骨骼再生过程中所产生影响。损伤模型包括斑马鱼尾鳍部分截除、颅骨开窗术，以及鳍条骨折的建立。图1A-1C，并与糖皮质激素暴露联合使用 通过 孵育图1E）。我们近期使用了该方案的一部分，来描述暴露于泼尼松龙（一种常用处方性皮质类固醇药物）对成年斑马鱼鳍和颅骨再生的影响。10在斑马鱼中，泼尼松龙给药会导致成骨细胞增殖减少、成骨细胞分化不完全，以及单核细胞/巨噬细胞谱系的凋亡迅速被诱导10在本方案中，我们还描述了如何在单个骨质鳍条节段中引入骨折。11，因为该方法在研究糖皮质激素介导的骨折修复过程中对骨组织的影响时可能具有应用价值。本文所述方法将有助于进一步阐明糖皮质激素在快速再生骨组织中作用的潜在机制，也可应用于斑马鱼组织再生背景下其他系统性药物给药的研究场景。

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方案

本文所述所有方法均经德累斯顿地区管理局批准（许可证编号：AZ 24D-9168.11-1/2008-1，AZ 24-9168.11-1/2011-52，AZ 24-9168.11-1/2013-5，AZ 24-9168.11-1/2013-14，AZ DD24.1- 5131/354/87）。

1. 材料与溶液的准备

注意：泼尼松龙与其他糖皮质激素一样，会引起免疫抑制。因此，实验期间必须采取预防措施，防止处理动物发生感染。为此，需对玻璃器皿和“鱼用水”进行高压灭菌处理（即， 实验开始前，用于饲养成年斑马鱼的水。

  1. 计算实验中所需的斑马鱼数量，确保包含作为对照的个体。
  2. 使用高压灭菌胶带将覆盖铝箔的600 mL玻璃烧杯进行高压灭菌。斑马鱼将被单独处理，因此每条斑马鱼需要1个玻璃烧杯。
  3. 计算实验所需鱼用水的体积。每个个体每天需要300 mL。需考虑实验持续时间（例如，1周/7天）。
  4. 用鱼用水装满玻璃瓶，盖紧瓶盖，并用高压灭菌胶带对瓶子进行高压灭菌。建议使用2 L的瓶子，但也可使用1 L或5 L等其他规格的瓶子。
    注意：如果实验时间较长（例如，4周/28天）且玻璃瓶数量有限，请确保每次至少准备数天所需的瓶子，并在实验过程中重复步骤（1.3至1.4）。
  5. 制备泼尼松龙储备液：将100 mM泼尼松龙溶于二甲基亚砜（DMSO）中，经无菌过滤后保存。将储备液分装至1 mL或2 mL微量离心管中并冷冻保存。
    注意：操作泼尼松龙时务必穿戴防护服（防护手套、护目镜、实验服）。
  6. 实验第一天，分别配制含泼尼松龙和DMSO的孵育溶液。为此，将所需体积的100 mM泼尼松龙储备液解冻，并将其加入高压灭菌的鱼用水中，终浓度为50 µM。
    1. 对于对照处理，向高压灭菌的鱼用水中加入相应体积的DMSO。例如，为配制2 L含泼尼松龙的鱼用水，向2 L鱼用水中加入1 mL的100 mM泼尼松龙储备液；在另一瓶2 L鱼用水中，相应加入1 mL DMSO。
    2. 应在指定用于药物处理的合适场所操作，理想条件为27 °C的房间内。

2. 斑马鱼鳍损伤的制备

注意：为了损伤斑马鱼鳍中的骨骼，可进行鳍部切除（截肢，通常在尾鳍）或单个骨性鳍条骨折（骨折模型）。为此，首先将成年斑马鱼麻醉。

  1. 截肢
    1. 为麻醉成年斑马鱼，准备一个直径为100 mm的培养皿，内含鱼水中配制的0.02% MS-222（乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐）（此水无需高压灭菌）。
      1. 使用鱼网将斑马鱼逐条转移至含有MS-222的培养皿中，并孵育至其侧卧不动且对触碰无反应。可通过用钝头镊子轻触肛鳍来测试后者。
      2. 等待达到麻醉的第4级水平，此为进行鳍切除的合适阶段12。在此阶段，鳃盖运动频率降低，肌肉张力丧失，且触碰时鱼体无反应12。
    2. 用钝头镊子小心地将麻醉后的斑马鱼转移至100 mm培养皿的倒置盖上，使鱼体侧卧。确保斑马鱼始终以相同方向放置，例如始终置于其身体右侧。使用解剖刀或剃须刀片切除50%的鳍（图1A，2A）。
      注意：斑马鱼鳍的再生速度取决于被切除鳍组织的量，即切除的鳍组织越多，鳍再生越快13。因此，为尽量减少鳍再生过程中的变异，务必在所有斑马鱼中以相同水平切除鳍组织。
    3. 将受伤的斑马鱼转移至含有300 mL含泼尼松龙或DMSO的高压灭菌鱼水的高压灭菌玻璃烧杯中。用铝箔覆盖烧杯，以防斑马鱼跳出。
    4. 重复步骤2.1.2至2.1.3，直至达到实验所需的斑马鱼数量。
  2. 鳍骨折
    1. 通过将2%琼脂糖溶液在鱼水或E3培养基（胚胎培养基3，含50 mM氯化钠、0.17 mM氯化钾、0.33 mM氯化钙、0.33 mM硫酸镁）中加热，制备一个涂有琼脂糖的100 mm培养皿。小心地将约10–15 mL该溶液倒入培养皿中，确保完全覆盖皿底。让琼脂糖凝固。
    2. 按照第2.1节所述方法麻醉斑马鱼。
    3. 用钝头镊子小心地将麻醉后的斑马鱼转移至涂有琼脂糖的100 mm培养皿中，使鱼体侧卧。在解剖显微镜下，完全展开尾鳍，以便识别清晰的骨性鳍条及鳍条节段。确保斑马鱼始终以相同方向放置，例如始终置于其身体右侧。
    4. 使用注射针头（0.3 mm × 13 mm）在骨性鳍条节段中央制造骨折（图1B）。操作时将针头轻微压向节段，直至出现裂纹（图2B中的箭头所示）。轻柔的压力仅会导致两条相对的半鳍条中的一条发生骨折，而较强的压力则会导致两条半鳍条节段均发生骨折。
      1. 不要在鳍中制造过多骨折，因为这会显著削弱鳍的稳定性。建议仅在3至5根鳍条中制造骨折。
      2. 务必在不同鳍条及不同斑马鱼之间对应节段制造骨折，例如在背鳍第3、7（或8）根以及腹鳍第3根鳍条上。骨折的近-远端位置应位于鳍条分叉点近端3个节段处为宜11。
    5. 将受伤的斑马鱼转移至含有300 mL含泼尼松龙或DMSO的高压灭菌鱼水的高压灭菌玻璃烧杯中。用铝箔覆盖烧杯，以防斑马鱼跳出。
    6. 重复步骤2.2.2至2.2.5，直至达到实验所需的斑马鱼数量。

3. 颅骨缺损模型的制备（颅骨钻孔）

注意：斑马鱼的头骨与哺乳动物的颅骨具有同源性。因此，这些外骨骼骨14在研究糖皮质激素诱导性骨质疏松（GIO）发病机制时具有特殊的研究价值。为造成颅骨损伤，可借助微型钻头在额骨（Os frontale）和/或顶骨（Os parietale）上钻孔，进行颅骨环钻术（图1C、2C）11。

  1. 根据第 2.1 节对斑马鱼进行麻醉。
  2. 用镊子将麻醉后的斑马鱼垂直固定，使其颅骨从上方在解剖显微镜下清晰可见（图 1C）。
  3. 将旋转微型钻头定位在额骨（Os frontale）中央并接触骨面。所形成的孔径与微型钻头的尺寸一致（500 µm，图 2C，图 3B）。
    注意：造伤过程中务必避免微型钻头横向移动。当感受到骨阻力突然下降时，应立即停止操作。切勿继续钻孔，否则会损伤脑组织15。
  4. 将受伤的斑马鱼转移至装有鱼水的网箱中，直至其完全从麻醉状态恢复，并密切观察其状态。
  5. 将受伤的斑马鱼转移至含有鱼水并添加泼尼松龙或 DMSO 的玻璃烧杯中。

4. 孵化期间斑马鱼的处理

注意：在使用泼尼松龙/DMSO 时，需每天更换含药鱼水，并定期喂养斑马鱼。

  1. 换水
    1. 每天治疗期间，将100 mM泼尼松龙储备液解冻，并用灭菌鱼水新鲜配制所需量的50 µM泼尼松龙溶液。同时，用含DMSO的灭菌鱼水为对照组斑马鱼配制相应溶液。
    2. 取一个玻璃烧杯，其中盛有孵育液和一条单独饲养的斑马鱼，将孵育液连同斑马鱼一起转移至合适的容器中，例如临时饲养笼。
      注意：请始终分别使用单独的临时容器盛放泼尼松龙处理的斑马鱼和DMSO处理的斑马鱼，以确保DMSO对照组斑马鱼不会接触泼尼松龙，反之亦然。
    3. 用新鲜的含药鱼水（300 mL）重新注满玻璃烧杯。
    4. 使用鱼网将斑马鱼从临时容器转移到含有新鲜孵育液的玻璃烧杯中。重新盖上锡箔纸，防止斑马鱼逃逸。
    5. 若实验时间超过2周，需更换玻璃烧杯。
  2. 喂养
    1. 短时间处理（不超过2天）期间无需喂食斑马鱼；长时间实验期间则需进行喂食。注意避免污染孵育溶液，因此喂食时应特别小心。 卤虫属物种 而不是使用片状饲料，且每隔一天投喂一次。
      注意：卤虫（Artemia）通常用于喂养幼年斑马鱼，应在斑马鱼养殖单元中备有。
      1. 在换鱼水前约2小时，给斑马鱼喂食 卤虫属物种 在他们的玻璃烧杯中。为此，使用塑料移液管，加入0.5至1 mL孵化出的 卤虫 每玻璃烧杯溶液
      2. 等待2小时，然后根据第4.1节将孵育溶液更换为含药物的新鲜鱼水。

5. 样品分析

注意：分别将受伤的斑马鱼在含有泼尼松龙和DMSO的养鱼水中孵育后，可进行骨矿化/钙化分析（5.1 至 5.3）或在解剖显微镜下对斑马鱼进行活体成像（5.4）10,11,16。利用活体成像确定鳍再生长度，并检测转基因斑马鱼中报告基因表达的差异。

  1. 目标组织的固定
    1. 为固定鳍和/或头骨，配制含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，并于-20 °C冷冻保存。使用前可使用新配制的4% PFA PBS溶液，或解冻所需用量。也可使用含2% PFA的PBS溶液。
      警告：PFA具有毒性，应在通风橱内小心操作。穿戴防护服。
    2. 为固定鳍组织，准备一个小型培养皿（例如，30 mm），加入含冷4% PFA的PBS，并确保皿底完全覆盖。为固定头骨，准备一个带盖的小玻璃瓶或试管，内含冷4% PFA PBS溶液。
      警告：含PFA的溶液仅可在通风橱内操作，因其具有毒性。穿戴防护服。
    3. 采集目标组织。
      1. 为采集再生鳍组织或骨折鳍组织，根据第2.1节对斑马鱼进行麻醉，或根据第5.1.5节实施安乐死。
      2. 将麻醉后的斑马鱼转移至培养皿盖上。使用解剖刀或剃刀刀片采集鳍再生组织。确保在采集再生鳍组织时包含残端组织，以便于后续操作。
    4. 在含PFA的培养皿中于4 °C下平铺固定鳍组织过夜。平铺固定可避免鳍组织在固定过程中卷曲。
      1. 为实现平铺固定，使用一把精细镊子夹住残端的背侧或腹侧边缘，将鳍组织浸入固定液中。再用第二把精细镊子夹住残端对侧边缘，轻轻将组织压向皿底。
      2. 保持10至20秒后松开。鳍组织应不再卷曲。若仍卷曲，需重复操作。
    5. 为采集损伤头骨组织，对斑马鱼实施安乐死。准备一个直径100 mm的培养皿，内含含0.1% MS-222的鱼用水。使用渔网逐条将斑马鱼转移至含MS-222的培养皿中。当达到麻醉第6级（延髓抑制）时，至少等待10分钟以确认个体死亡12。
    6. 使用解剖刀从身体其余部分切下头部并保留少量躯干组织。将采集的组织浸入已准备好的玻璃瓶或塑料管中的4% PFA溶液中。于4 °C下轻柔振荡固定24小时。
    7. 若需长期保存固定后的样本，用PBS清洗（室温下3次，每次20分钟），并用递增浓度的甲醇系列处理（PBS中依次为30%、50%、70%，各1次20分钟；100%甲醇2次，每次20分钟）。
      1. 将样本保存于-20 °C的100%甲醇中。否则，在用PBS清洗后可直接进行骨染色或其他分析。
  2. 骨染色技术I（茜素红染色）
    注意：本染色方法依据van Eeden et al. 199617 和 Walker & Kimmel 200718 的方法并加以修改。
    1. 对成年斑马鱼的鳍或头骨进行茜素红染色时，按第5.1节所述采集并固定组织。
    2. 若样本此前在-20 °C甲醇中保存，需通过逆向甲醇梯度复水（70%、50%、30% PBS溶液，各1次20分钟），并用PBS清洗两次，每次20分钟。再用去离子水清洗至少5分钟。
    3. 对头骨进行茜素红染色时，样本需在室温下用含50 mg/mL胰蛋白酶的30%饱和Na2B4O7溶液处理过夜，期间持续振荡。随后用30%饱和Na2B4O7溶液冲洗样本，并用去离子水清洗两次，每次5分钟。此步骤不适用于鳍组织。
    4. 加入茜素红溶液（B部分：0.5%茜素红S粉末，10%甘油溶于去离子水），于室温孵育期间持续振荡样本。分别在1、2、4小时或过夜后检查染色情况。
    5. 为透明化样本，使用递减的1%氢氧化钾：甘油梯度（3:1过夜，1:1过夜，1:3过夜）处理。
    6. 将样本保存于0.1%氢氧化钾：80%甘油的1:1溶液中，并用80%甘油封片进行成像。
      注意：若需进行阿利新蓝/茜素红双重染色，在复水后（第5.2.2节），先用阿利新蓝染色液（A部分：终浓度0.02%阿利新蓝，50 mM MgCl2，70%乙醇）于室温染色2小时。鳍组织随后在含50 mM MgCl2的递减乙醇梯度中处理（70%、50%、30%，各1次15分钟），再用去离子水清洗至少1小时（3次，每次20分钟）。之后继续进行茜素红染色（第5.2节）。
  3. 骨染色技术II（钙黄绿素染色）
    注意：为检测鳍骨折和头骨损伤中的钙沉积，需将活体鱼置于含钙黄绿素的溶液中孵育。
    1. 配制所需量的0.2%钙黄绿素去离子水溶液（pH 7.5）。确保pH为中性，使用1 M NaOH调节pH。
    2. 将最多3条斑马鱼同时置于100 mL钙黄绿素溶液中，在铝箔包裹的玻璃烧杯中孵育20分钟。
    3. 将斑马鱼转移至盛有鱼用水的烧杯中。短暂游动后，再转移至另一盛有鱼用水的新烧杯中，继续游动20分钟以清洗。拍摄图像（见第 5.4节）。
  4. 斑马鱼活体成像
    1. 使用该方法可在不牺牲斑马鱼的前提下，于实验过程中持续获取鳍或头骨等骨组织再生过程的图像。根据第2.1节对斑马鱼进行麻醉。
    2. 为获取鳍再生组织图像，将麻醉后的斑马鱼转移至琼脂糖包被的培养皿上（见第2.2.1节及图1B）。
    3. 为获取头骨再生骨组织图像，将斑马鱼直立置于海绵中（图1D），或置于已塑形以固定斑马鱼躯干的琼脂糖包被培养皿中。
    4. 使用体视显微镜系统在所需放大倍数和分辨率下获取图像。
    5. 将斑马鱼放回盛有新鲜鱼用水或含药物鱼用水的容器中。

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结果

本文所述方案已多次用于诱导斑马鱼鳍和头骨再生过程中的快速骨形成10,11,16结合所介绍的泼尼松龙给药方法，可进一步开展关于泼尼松龙在骨再生过程中作用的研究。例如，可对再生组织中的骨形成与矿化过程进行研究。泼尼松龙与其他糖皮质激素一样19,20，导致鳍的再生受到整体抑制，包括骨形成，这通过固定尾鳍组织的茜素红染色检测得出（图3A）。类似地，泼尼松龙会延缓（颅顶）颅骨损伤的愈合，这一现象可通过茜素红染色加以显示（图3B）或 体内 钙黄绿素染色。此外，泼尼松龙通过诱导单核细胞/巨噬细胞系的凋亡，在鳍和头骨组织中均发挥显著的抗炎作用。通过冷冻...

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讨论

斑马鱼在骨骼研究的许多方面已被证明具有重要价值。某些筛选出的突变体可模拟人类疾病特征，例如成骨不全症或骨关节炎23,24,25,26,27，而斑马鱼幼体及鳞片正被用于小分子筛选中鉴定促骨生成化合物7,28,29。此外，使用临床上应用的药物处理斑马鱼，非常适合研究这些药物可能产生的不良效应，例如对骨组织的影响。在此背景下，斑马鱼具有快速再生骨组织的特性，有利于探究药物诱导骨缺陷的潜在机制。本文介绍了一种将糖皮质激素泼尼松龙（一种在临床上广泛应用但对骨组织具有不良效应的抗炎药物）处理与成年斑马鱼骨再生方案相结合的实验流程。该方案已成功...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了德累斯顿再生疗法中心（"利用斑马鱼模型揭示糖皮质激素诱导骨丢失的机制"）的资助，以及德国研究基金会（Transregio 67，项目编号 387653785）对 FK 的额外资助。我们非常感谢 Jan Kaslin 和 Avinash Chekuru 在颅骨开窗术以及鳍条骨断裂实验操作方面提供的指导和帮助。实验由 KG 和 FK 设计、实施并进行分析，FK 撰写了手稿。我们还要感谢 Katrin Lambert、 Nicole Cudak 以及 Knopf 和 Brand 实验室的其他成员在技术协助和讨论方面提供的支持。同时感谢 Marika Fischer 和 Jitka Michling 在斑马鱼饲养方面的出色工作，以及 Henriette Knopf 和 Josh Currie 对手稿的校对。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
泼尼松龙Sigma-AldrichP6004
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8418
三卡因甲磺酸盐（MS-222）Sigma-AldrichA5040
钝头镊AesculapBD027R
精细镊Dumont91150-20
手术刀Braun5518059
琼脂糖Biozym840004
注射针头（0.3 mm × 13 mm）BD Beckton Dickinson30400
微型钻机Cell Point Scientific67-1000由哈佛仪器公司等分发 e.g.
钢制钻头（直径 0.5 µm）Fine Science Tools19007-05
Artemia ssp.Sanders425GR
巴斯德吸管（塑料，Pastette）Alpha LabsLW4111
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
茜素红 S 粉末Sigma-AldrichA5533
阿利新蓝 8 GXSigma-AldrichA5268
钙黄绿素Sigma-AldrichC0875
胰蛋白酶Sigma-AldrichT7409
体视显微镜LeicaMZ16 FA配备 QIMAGING RETIGA-SRV 相机
体视显微镜OlympusMVX10配备 Olympus DP71 或 DP80 相机

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