本文介绍了3种成年斑马鱼损伤模型及其与免疫抑制药物治疗的联合应用。我们提供了再生组织成像以及其中骨矿化检测的技术指导。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼能够再生多种器官，包括在截肢后再生附肢（鳍）。这一过程涉及骨骼的再生，骨骼在损伤后大约两周内重新生长。此外，斑马鱼在颅骨开窗术后能够快速愈合骨骼，并修复可轻易引入斑马鱼骨性鳍条中的骨折。这些损伤模型为测试给药药物对快速形成骨组织的影响提供了可行的实验范式。本文描述了这三种损伤模型的应用，及其与全身性糖皮质激素处理的联合使用方法；糖皮质激素具有抑制骨形成和免疫抑制作用。我们提供了一套针对成年斑马鱼进行免疫抑制处理的实验准备流程，详细说明了如何实施鳍截除、颅骨开窗术以及鳍条骨折操作，并阐述了糖皮质激素如何影响成骨细胞（负责骨形成）以及单核细胞/巨噬细胞谱系细胞——后者作为先天免疫系统的一部分参与骨组织的反应。
引言
斑马鱼是研究脊椎动物发育和疾病的强大动物模型。这主要因为它们体型小，繁殖能力极强，且其基因组已完全测序，易于进行遗传操作。1其他优势包括可在不同阶段进行持续的活体成像。 体内 成年斑马鱼成像2以及在斑马鱼幼鱼中进行高通量药物筛选的能力3此外，斑马鱼在包括骨骼在内的多种器官和组织中具有很强的再生能力，因此可作为研究骨骼疾病与修复的有用模型系统4,5.
糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIO）是一种由于长期使用糖皮质激素治疗所导致的疾病，例如在哮喘或类风湿性关节炎等自身免疫性疾病治疗过程中。约30%接受糖皮质激素治疗的患者会发展为GIO，这构成了一个重要的健康问题6；因此，深入研究免疫抑制对骨组织的影响至关重要。近年来，已开发出多种用于研究GIO发病机制的斑马鱼模型。例如，已在斑马鱼幼体中成功诱导由糖皮质激素介导的骨量丢失，并通过药物筛选鉴定了可增加骨量的拮抗化合物7。此外，糖皮质激素诱导的骨抑制效应也已在斑马鱼鳞片中模拟实现，包括体外（in vitro）和体内（in vivo）....
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方案
本文所述所有方法均经德累斯顿地区管理局批准（许可证编号：AZ 24D-9168.11-1/2008-1，AZ 24-9168.11-1/2011-52，AZ 24-9168.11-1/2013-5，AZ 24-9168.11-1/2013-14，AZ DD24.1- 5131/354/87）。
1. 材料与溶液的准备
注意：泼尼松龙与其他糖皮质激素一样，会引起免疫抑制。因此，实验期间必须采取预防措施，防止处理动物发生感染。为此，需对玻璃器皿和“鱼用水”进行高压灭菌处理（即， 实验开始前，用于饲养成年斑马鱼的水。
- 计算实验中所需的斑马鱼数量，确保包含作为对照的个体。
- 使用高压灭菌胶带将覆盖铝箔的600 mL玻璃烧杯进行高压灭菌。斑马鱼将被单独处理，因此每条斑马鱼需要1个玻璃烧杯。
- 计算实验所需鱼用水的体积。每个个体每天需要300 mL。需考虑实验持续时间（例如，1周/7天）。
- 用鱼用水装满玻璃瓶，盖紧瓶盖，并用高压灭菌胶带对瓶子进行高压灭菌。建议使用2 L的瓶子，但也可使用1 L或5 L等其他规格的瓶子。
注意：如果实验时间较长（例如，4周/28天）且玻璃瓶数量有限，请确保每次至少准备数天所需的瓶子，并在实验过程中重复步骤（1.3至1.4）。 - 制备泼尼松....
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结果
本文所述方案已多次用于诱导斑马鱼鳍和头骨再生过程中的快速骨形成10,11,16结合所介绍的泼尼松龙给药方法，可进一步开展关于泼尼松龙在骨再生过程中作用的研究。例如，可对再生组织中的骨形成与矿化过程进行研究。泼尼松龙与其他糖皮质激素一样19,20，导致鳍的再生受到整体抑制，包括骨形成，这通过固定尾鳍组织的茜素红染色检测得出（图3A）。类似地，泼尼松龙会延缓（颅顶）颅骨损伤的愈合，这一现象可通过茜素红染色加以显示（图3B）或 体内 钙黄绿素染色。此外，泼尼松龙通过诱导单核细胞/巨噬细胞系的凋亡，在鳍和头骨组织中均发挥显著的抗炎作用。通过冷冻.......
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讨论
斑马鱼在骨骼研究的许多方面已被证明具有重要价值。某些筛选出的突变体可模拟人类疾病特征，例如成骨不全症或骨关节炎23,24,25,26,27，而斑马鱼幼体及鳞片正被用于小分子筛选中鉴定促骨生成化合物7,28,29。此外，使用临床上应用的药物处理斑马鱼，非常适合研究这些药物可能产生的不良效应，例如对骨组织的影响。在此背景下，斑马鱼具有快速再生骨组织的特性，有利于探究药物诱导骨缺陷的潜在机制。本文介绍了一种将糖皮质激素泼尼松龙（一种在临床上广泛应用但对骨组织具有不良效应的抗炎药物）处理与成年斑马鱼骨再生方案相结合的实验流程。该方案已成功.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了德累斯顿再生疗法中心（"利用斑马鱼模型揭示糖皮质激素诱导骨丢失的机制"）的资助，以及德国研究基金会（Transregio 67，项目编号 387653785）对 FK 的额外资助。我们非常感谢 Jan Kaslin 和 Avinash Chekuru 在颅骨开窗术以及鳍条骨断裂实验操作方面提供的指导和帮助。实验由 KG 和 FK 设计、实施并进行分析，FK 撰写了手稿。我们还要感谢 Katrin Lambert、 Nicole Cudak 以及 Knopf 和 Brand 实验室的其他成员在技术协助和讨论方面提供的支持。同时感谢 Marika Fischer 和 Jitka Michling 在斑马鱼饲养方面的出色工作，以及 Henriette Knopf 和 Josh Currie 对手稿的校对。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 泼尼松龙 | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 三卡因甲磺酸盐（MS-222） | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 钝头镊 | Aesculap | BD027R | |
| 精细镊 | Dumont | 91150-20 | |
| 手术刀 | Braun | 5518059 | |
| 琼脂糖 | Biozym | 840004 | |
| 注射针头（0.3 mm × 13 mm） | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| 微型钻机 | Cell Point Scientific | 67-1000 | 由哈佛仪器公司等分发 e.g. |
| 钢制钻头（直径 0.5 µm） | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| 巴斯德吸管（塑料，Pastette） | Alpha Labs | LW4111 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 茜素红 S 粉末 | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| 阿利新蓝 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| 钙黄绿素 | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| 体视显微镜 | Leica | MZ16 FA | 配备 QIMAGING RETIGA-SRV 相机 |
| 体视显微镜 | Olympus | MVX10 | 配备 Olympus DP71 或 DP80 相机 |
参考文献
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).
- Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish. Nature Protocols.
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重印与许可
