研究受体与酶之间功能相互作用的共免疫沉淀实验

摘要

本文介绍了一种共免疫沉淀及磁珠上酶活性检测的实验方案，可同时研究质膜受体特定蛋白结构域在酶募集和酶活性中的作用。

摘要

受体相关酶是介导细胞活化的主要因子。这些酶至少在一定程度上受到其与受体胞内段之间物理相互作用的调控。此类相互作用通常通过特定的蛋白质结构域发生，并导致酶的活化。目前有多种方法可用于研究蛋白质之间的相互作用。尽管免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）常用于分析介导蛋白质相互作用所必需的结构域，但尚无方法能够同时检测特定结构域对被招募酶活性的贡献。因此，本文所述方法结合了免疫共沉淀与磁珠上酶活性检测，可同时评估蛋白质间的相互作用及其相关的酶活化状态。本实验方案的目标是鉴定出对蛋白质与酶之间物理结合至关重要的结构域，以及对酶完全活化必不可少的结构域。该检测方法的重要性在于，某些受体蛋白结构域能促进酶与受体胞内段的结合，而另一些结构域则对同一酶的功能调控具有必要性。

引言

催化性受体和受体酪氨酸激酶是一类跨膜蛋白，其胞外配体的结合可导致胞内侧产生酶活性¹。某些受体同时具有受体和酶的功能，而另一些受体则在其胞质尾部招募特定的酶，如激酶和磷酸酶。酶在受体尾部的招募及其后续的催化作用是两个独立的过程，且并不总是由相同的蛋白结构域所调控²。遗憾的是，目前尚无特异性工具可同时评估这两种过程——即酶与受体的相互作用及其酶活性。本文所述的功能性共免疫沉淀实验是一种有效的方法，可用于区分酶在受体尾部的招募与其激活过程。该方法利用抗体包被的磁珠对带标签的受体进行免疫沉淀，随后在磁珠上同时进行酶活性检测和蛋白质印迹（Western blot）分析。该方法的总体目标是明确哪些蛋白结构域对于受体与酶之间的相互作用是必需的（通过Western blot分析评估），以及哪些结构域对于酶的完全激活是必不可少的（通过磁珠上的酶活性检测测定）。由于受体相关酶参与人类疾病的发病机制，开发能够研究其不同功能的工具具有重要意义。此外，进一步理解这些蛋白的作用机制，可能有助于设计新的治疗干预策略。

程序性死亡受体-1（PD-1）是T细胞表面的一种抑制性受体，对于限制过度的T细胞反应至关重要。近年来，抗PD-1抗体已被应用于多种恶性肿瘤的治疗^1,2。PD-1与其配体结合后会抑制多种T细胞功能，包括增殖、黏附以及多种细胞因子的分泌^3,4,5。PD-1定位于免疫突触，即T细胞与抗原呈递细胞之间的接触界面⁶，并在该处与T细胞受体（TCR）共定位⁷。随后，酪氨酸磷酸酶SHP2 [含Src同源2（SH2）结构域的酪氨酸磷酸酶2] 被招募至PD-1的胞质尾部，导致TCR复合物及其相关近端信号分子中关键酪氨酸残基的去磷酸化^3,4,5,8,9。PD-1的胞质尾部包含两个酪氨酸基序：一个基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序（ITIM）和一个基于免疫受体酪氨酸的转换基序（ITSM）¹⁰。这两个基序在PD-1与其配体结合后均会被磷酸化^9,10。突变研究显示，ITSM在招募SHP2过程中起主要作用，而ITIM在PD-1信号传导和功能中的作用尚不明确⁴。

SHP2 采用两种构象之一：封闭（折叠）的抑制构象或开放（伸展）的活性构象¹¹。目前尚未阐明 PD-1 各尾部结构域在 SHP2 结合或激活中的具体作用。为回答这一问题，我们建立了一种可同时检测 SHP2 与 PD-1 胞内尾部结合及其活性的实验方法¹²。我们采用共免疫沉淀和磁珠上磷酸酶活性检测法，平行评估两者的相互作用及酶活性。利用该方法，我们证明 PD-1 的 ITSM 结构域足以介导 SHP2 与 PD-1 胞内尾部的结合，而 PD-1 的 ITIM 结构域则对于酶的完全伸展和激活是必需的。

许多受体在其胞质尾部具有多个相邻的结构域。功能性共免疫沉淀实验可以揭示特定结构域在蛋白质招募或酶激活过程中的必要作用。

方案

1. 细胞转染

1. 转染前一天，将 HEK 293T 细胞接种至 12 个 10 cm 培养皿中（每皿 5 × 10⁶ 个细胞）（图 1）。使用血细胞计数板进行细胞计数。每皿加入 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。
2. 当细胞融合度达到 80–90% 时，使用脂质体转染试剂对 5 个 HEK 293T 培养皿进行转染，所用质粒包括：SHP2 表达载体、PD-1-GFP 表达载体 [PD-1 的野生型（WT）版本]、ITIM 突变型（Y223F）PD-1-GFP 表达载体，以及 ITSM 突变型（Y248F）PD-1-GFP 表达载体（图 1）。
   注意：两个培养皿转染野生型 PD-1-GFP 表达载体。另设一个未转染细胞的对照培养皿（图 1）。
3. 按照脂质体转染试剂说明书提供的贴壁细胞转染方案，在 10 cm 培养皿中进行转染。
   注意：在 PD-1 的突变体中，各基序中的酪氨酸（Y）被无法磷酸化的苯丙氨酸（F）取代。
4. 另转染一组完全相同的五个培养皿，并额外设置一个未转染的对照培养皿，用于在免疫沉淀前检测表达蛋白的量 [输入量；也称为全细胞裂解液（WCL）]（图 1）。
5. 将转染后的细胞在组织培养箱中于 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养 48 小时。
   注意：为确认转染成功，可使用荧光显微镜观察细胞中 GFP 的表达情况。

2. 促进转染细胞中的磷酸化

1. 孵育后，通过将50 µL的正钒酸钠（来自100 mM储备液）与50 µL的30% H₂O₂混合，制备新鲜的过钒酸盐。
   注意：混合液应变为淡黄色。过钒酸盐是一种细胞通透性的磷酸酶抑制剂，可促进酪氨酸残基的磷酸化¹³。在本实验中，它用于强烈诱导PD-1胞内段的磷酸化。
2. 为磷酸化标记的PD-1蛋白，移除PD-1-GFP转染细胞的培养基，并向每个10 cm培养皿中加入10 mL不含血清和抗生素的普通DMEM培养基以及10 µL过钒酸盐（步骤2.1）（共八个培养皿，表达不同形式的PD-1）（图1）。将培养皿置于室温避光条件下孵育15分钟。
   注意：SHP2转染的细胞（两个培养皿；图1）以及两个未转染的对照培养皿不进行过钒酸盐处理，因为这些培养皿将作为活性SHP2酶的来源。
3. 用5 mL预冷的1× PBS洗涤细胞，重复此步骤两次。

3. 免疫沉淀

注意：以下步骤应在冰上或 4 °C 条件下进行。

1. 在裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.2，250 mM NaCl，0.1% NP-40，2 mM EDTA，10% 甘油）中加入蛋白酶抑制剂（将1片溶解于10 mL裂解缓冲液中）和1 mM 正钒酸钠。向细胞中加入500 µL预冷的裂解缓冲液，并立即使用细胞刮刀从培养板上刮下并收集细胞。
   注意：正钒酸钠仅需添加至用于PD-1-GFP转染板的裂解缓冲液中，因为SHP2转染板和未转染对照板必须保留磷酸酶活性。
2. 将裂解物转移至1.5 mL预冷离心管中，在4 °C、0.005 × g条件下旋转孵育30分钟。
3. 为从裂解物中收集核后上清液（PNS），在4 °C、10,000 × g条件下离心10分钟，将上清液转移至新管中，弃去沉淀。将第二组六块板的上清液（图1）置于冰上保存，用于后续全细胞裂解液（WCL）分析。
4. 为第一组（四块板）PD-1-GFP转染裂解物中的PD-1-GFP进行免疫沉淀，准备抗GFP磁珠（图1）。
   1. 为防止磁珠沉降，打开前轻轻摇动磁珠瓶。每种条件取40 µL抗GFP磁珠悬液。
   2. 在4 °C、500 × g条件下离心3分钟，弃去上清液以洗涤磁珠。
      注意：应尽量减少移液器塑料吸头与琼脂糖磁珠的接触，以防磁珠损失。建议在将磁珠转移至另一管前，剪去200 µL吸头的尖端。
   3. 将磁珠重悬于80 µL裂解缓冲液中（每样本）。
5. 将洗涤后的磁珠直接加入第一组（四块板）PD-1-GFP表达细胞的细胞裂解物（PNS）中（步骤3.3）。在4 °C、0.005 × g条件下旋转孵育30分钟，以免疫沉淀GFP标签蛋白。
6. 用1 mL预冷的裂解缓冲液（不含正钒酸钠）洗涤磁珠3次，每次在2,500 × g条件下离心10秒。
   注意：向磁珠中加入裂解缓冲液时，应直接将液体加在磁珠上方，避免吸头接触磁珠。洗涤过程中无需吹打混匀。
7. 将第一组中表达活性SHP2的裂解物（一块板；步骤3.3）等量分为三份，分别加入含有洗涤后PD-1-GFP磁珠的三个离心管中（分别为野生型PD-1-GFP及两种磷酸化缺陷突变体Y223F和Y248F）。将未转染细胞裂解物的三分之一体积加入第二管野生型PD-1-GFP磁珠中，弃去剩余三分之二。
8. 在4 °C、轻柔旋转（0.005 × g）条件下孵育磁珠4小时。
9. 按照步骤3.6所述方法，用1 mL预冷裂解缓冲液（不含过钒酸盐或正钒酸钠）洗涤磁珠两次。
10. 每样本加入80 µL裂解缓冲液（不含过钒酸盐或正钒酸钠），确保每管总体积为100 µL（20 µL磁珠和80 µL裂解缓冲液）。轻轻混匀后，将每管中的50 µL混合液转移至两个新的1.5 mL离心管中。
    注意：此步骤后将得到两管含有磁珠和裂解缓冲液的混合物：其中一管用于通过Western blot检测共免疫沉淀的SHP2，另一管用于磷酸酶活性测定。

4. 磷酸酶活性测定

1. 用磷酸酶洗涤缓冲液（30 mM Hepes，pH 7.4，120 mM NaCl）洗涤磁珠一次，彻底去除上清液。
2. 向磁珠中加入100 µL检测缓冲液（30 mM Hepes，pH 7.4，120 mM NaCl，5 mM DTT，10 mM 对硝基苯磷酸），在30 °C下轻轻振荡孵育30分钟。注意：孵育时间可能有所变化，需等待缓冲液因去磷酸化反应变为黄色后再进行下一步。
3. 当缓冲液变为黄色时，加入50 µL 1 M NaOH以终止反应。
4. 在2,500 × g 条件下离心10秒，将50 µL上清液转移至96孔板的半面积板中的两个孔（每孔50 µL，设两个复孔），在405 nm处测定吸光度。
5. 结果以相对于PD-1-GFP野生型对照的相对光密度（OD）表示。

5. SHP2 蛋白质印迹分析

1. 离心珠子并弃去上清液。
2. 向珠子中加入 20 µL 的 2x Laemmli 缓冲液（见材料表），在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
3. 使用 BCA 试剂盒（见材料表）测定输入对照样品（第二组）的蛋白浓度。取稀释度最高的样品 30 µL 转移至新离心管中。将其余输入对照样品用裂解缓冲液稀释至与最高稀释度样品相同的浓度，并从每份样品中取 30 µL 转移至新的离心管。
   注意：完成此步骤后，将得到 4 个管，每管含 30 µL 溶液，蛋白浓度相近，代表输入对照裂解物。
4. 向裂解物中加入等体积的 2x Laemmli 缓冲液，在 95 °C 下煮沸 5 分钟。离心珠子后，将上清液上样至 4–20% Tris 基 SDS-PAGE 凝胶（见材料表）进行 Western 印迹分析。此外，从第二组的每份样品中各取 50 µL 上样。
5. 按照先前描述的方案继续进行 Western 印迹分析¹²。

结果

尽管PD-1的ITSM在结合SHP2中的作用已明确，但PD-1的ITIM所起的作用尚不清晰。由于SHP2具有两个SH2结构域，可结合PD-1上两个连续的磷酸化酪氨酸残基（其中一个位于ITSM，另一个位于ITIM），我们推测PD-1的ITSM负责将SHP2锚定于PD-1，而PD-1的ITIM则通过稳定SHP2的开放构象状态来促进其活性^11,14。为验证这一假设，我们建立了一种结合免疫共沉淀与酶活性检测的方法，用于并行评估受体与酶之间的相互作用及其激活状态。在HEK 293T细胞中表达野生型GFP-PD-1、GFP-PD-1 Y223F（ITIM突变体）或GFP-PD-1 Y248F（ITSM突变体），随后用过钒酸盐处理（图1），以诱导PD-1胞内段的酪氨酸磷酸化。利用抗GFP包被的磁珠富集PD-1蛋白，并将这些磁珠用于从过表达SHP2的细胞裂解液中进行SHP2的免疫共沉淀。检测与各PD-1变异体结合...

讨论

受体与酶之间的相互作用对细胞内信号传导至关重要。许多酶通过其SH2结构域结合到同一受体胞内尾部的磷酸化酪氨酸上，从而被招募至受体。然而，这些酶通常折叠为闭合的非活性构象，其激活需要发生构象变化¹¹，而这种变化可由同一受体的其他结构域介导。本文所述的实验方法可用于检测受体与酶之间的相互作用，以及这些相互作用所诱导的酶活性。

我们采用了一种比色法检测，该方法以对硝基苯基磷酸盐（pNPP）作为SHP2的底物。pNPP是一种非特异性底物和磷酸基团供体，可被多种酶释放。¹⁵磷酸化重组肽可作为替代底物（例如，类似于孔雀石绿法中所使用的肽段）。这些肽段对磷酸酶活性具有更高的特异性，但成本较高，且由于其高灵敏度，只能在无磷酸盐的溶液中进行。另一种克服对对硝基苯磷酸盐（pNPP）缺乏特异性的方法是引入一种对照细胞系，其中目标磷酸酶被敲除。在这些细胞中，SHP2的过表达将是该酶的唯一来源，因此任何磷酸酶活性的增加均可特异性归因于过表达的磷酸酶。第三种方法是使用纯化的带有表位标签的SHP2蛋...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Lonza	17-516F	磷酸盐缓冲液
微量离心机	Eppendorf	5424-R	1.5 mL
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）酚红	Gibco	25200114
热灭活胎牛血清	Denville	FB5001-H	胎牛血清
青霉素/链霉素	Fisher	BP295950
高糖DMEM，不含L-谷氨酰胺	Lonza	BE12-614F
SuperFect 转染试剂	Qiagen	301305
抗SHP2抗体	Santa Cruz	SC-280
抗–GFP-琼脂糖	MBL	D153-8
抗GFP抗体	Roche	118144600
抗肌动蛋白抗体	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293细胞	ATCC	CRL-1573
正钒酸盐	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836170001	无EDTA
Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液（2x）	Invitrogen	LC2676	改良Laemmli缓冲液
4-20% Tris-甘氨酸迷你胶	Invitrogen	XP04205BOX	15孔
硝酸纤维素膜	通用电气	10600004
NaCl	Sigma	S7653	氯化钠
HEPES	Gibco	15630080	N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸
DTT	Invitrogen	D1532	二硫苏糖醇
pNPP	Sigma	20-106	对硝基苯基磷酸盐
NaOH	Sigma	S8045	氢氧化钠
BCA	Fisher	23225	双辛可宁酸法检测试剂