本文介绍了一种共免疫沉淀及磁珠上酶活性检测的实验方案，可同时研究质膜受体特定蛋白结构域在酶募集和酶活性中的作用。
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本文内容
摘要
摘要
受体相关酶是介导细胞活化的主要因子。这些酶至少在一定程度上受到其与受体胞内段之间物理相互作用的调控。此类相互作用通常通过特定的蛋白质结构域发生，并导致酶的活化。目前有多种方法可用于研究蛋白质之间的相互作用。尽管免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）常用于分析介导蛋白质相互作用所必需的结构域，但尚无方法能够同时检测特定结构域对被招募酶活性的贡献。因此，本文所述方法结合了免疫共沉淀与磁珠上酶活性检测，可同时评估蛋白质间的相互作用及其相关的酶活化状态。本实验方案的目标是鉴定出对蛋白质与酶之间物理结合至关重要的结构域，以及对酶完全活化必不可少的结构域。该检测方法的重要性在于，某些受体蛋白结构域能促进酶与受体胞内段的结合，而另一些结构域则对同一酶的功能调控具有必要性。
引言
催化性受体和受体酪氨酸激酶是一类跨膜蛋白，其胞外配体的结合可导致胞内侧产生酶活性1。某些受体同时具有受体和酶的功能，而另一些受体则在其胞质尾部招募特定的酶，如激酶和磷酸酶。酶在受体尾部的招募及其后续的催化作用是两个独立的过程，且并不总是由相同的蛋白结构域所调控2。遗憾的是，目前尚无特异性工具可同时评估这两种过程——即酶与受体的相互作用及其酶活性。本文所述的功能性共免疫沉淀实验是一种有效的方法，可用于区分酶在受体尾部的招募与其激活过程。该方法利用抗体包被的磁珠对带标签的受体进行免疫沉淀，随后在磁珠上同时进行酶活性检测和蛋白质印迹（Western blot）分析。该方法的总体目标是明确哪些蛋白结构域对于受体与酶之间的相互作用是必需的（通过Western blot分析评估），以及哪些结构域对于酶的完全激活是必不可少的（通过磁珠上的酶活性检测测定）。由于受体相关酶参与人类疾病的发病机制，开发能够研究其不同功能的工具具有重要意义。此外，进一步理解这些蛋白的作用机制，可能有助于设计新的治疗干预策略。
程序性死亡受体-1（PD-1）是T细胞表面的一种抑制性受体，对于限制过度的T细胞反应至关重要。近年来，抗PD-1抗体已被应用于多种恶性肿瘤的治疗1,2。PD-1与其配体结合后会抑制....
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方案
1. 细胞转染
- 转染前一天，将 HEK 293T 细胞接种至 12 个 10 cm 培养皿中（每皿 5 × 106 个细胞）（图 1）。使用血细胞计数板进行细胞计数。每皿加入 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
- 当细胞融合度达到 80–90% 时，使用脂质体转染试剂对 5 个 HEK 293T 培养皿进行转染，所用质粒包括：SHP2 表达载体、PD-1-GFP 表达载体 [PD-1 的野生型（WT）版本]、ITIM 突变型（Y223F）PD-1-GFP 表达载体，以及 ITSM 突变型（Y248F）PD-1-GFP 表达载体（图 1）。
注意：两个培养皿转染野生型 PD-1-GFP 表达载体。另设一个未转染细胞的对照培养皿（图 1）。 - 按照脂质体转染试剂说明书提供的贴壁细胞转染方案，在 10 cm 培养皿中进行转染。
注意：在 PD-1 的突变体中，各基序中的酪氨酸（Y）被无法磷酸化的苯丙氨酸（F）取代。 - 另转染一组完全相同的五个培养皿，并额外设置一个未转染的对照培养皿，用于在免疫沉淀前检测表达蛋白....
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结果
尽管PD-1的ITSM在结合SHP2中的作用已明确，但PD-1的ITIM所起的作用尚不清晰。由于SHP2具有两个SH2结构域，可结合PD-1上两个连续的磷酸化酪氨酸残基（其中一个位于ITSM，另一个位于ITIM），我们推测PD-1的ITSM负责将SHP2锚定于PD-1，而PD-1的ITIM则通过稳定SHP2的开放构象状态来促进其活性11,14。为验证这一假设，我们建立了一种结合免疫共沉淀与酶活性检测的方法，用于平行评估受体与酶之间的相互作用及其激活状态。在HEK 293T细胞中表达野生型GFP-PD-1、GFP-PD-1 Y223F（ITIM突变体）或GFP-PD-1 Y248F（ITSM突变体），随后用过钒酸盐处理（图1），以诱导PD-1胞内段的磷酸化。利用抗GFP包被的磁珠富集PD-1蛋白，并将这些磁珠用于从过表达SHP2的细胞裂解液中进行SHP2的免疫共沉淀。检测与各PD-1变异体结合的SH.......
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讨论
受体与酶之间的相互作用对细胞内信号传导至关重要。许多酶通过其SH2结构域结合到同一受体胞内尾部的磷酸化酪氨酸上，从而被招募至受体。然而，这些酶通常折叠为闭合的非活性构象，其激活需要发生构象变化11，而这种变化可由同一受体的其他结构域介导。本文所述的实验方法可用于检测受体与酶之间的相互作用，以及这些相互作用所诱导的酶活性。
我们采用了一种比色法检测，该方法以对硝基苯基磷酸盐（pNPP）作为SHP2的底物。pNPP是一种非特异性底物和磷酸基团供体，可被多种酶释放。15磷酸化重组肽可作为替代底物（例如，类似于孔雀石绿法中所使用的肽段）。这些肽段对磷酸酶活性具有更高的特异性，但成本较高，且由于其高灵敏度，只能在无磷酸盐的溶液中进行。另一种克服对对硝基苯磷酸盐（pNPP）缺乏特异性的方法是引入一种对照细胞系，其中目标磷酸酶被敲除。在这些细胞中，SHP2的过表达将是该酶的唯一来源，因此任何磷酸酶活性的增加均可特异性归因于过表达的磷酸酶。第三种方法是使用纯化的带有表位标签的SHP2蛋.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为1R01AI125640-01，以及风湿病研究基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS | Lonza | 17-516F | 磷酸盐缓冲液 |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5424-R | 1.5 mL |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）酚红 | Gibco | 25200114 | |
| 热灭活胎牛血清 | Denville | FB5001-H | 胎牛血清 |
| 青霉素/链霉素 | Fisher | BP295950 | |
| 高糖DMEM，不含L-谷氨酰胺 | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect 转染试剂 | Qiagen | 301305 | |
| 抗SHP2抗体 | Santa Cruz | SC-280 | |
| 抗–GFP-琼脂糖 | MBL | D153-8 | |
| 抗GFP抗体 | Roche | 118144600 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| 正钒酸盐 | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 | 无EDTA |
| Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液（2x） | Invitrogen | LC2676 | 改良Laemmli缓冲液 |
| 4-20% Tris-甘氨酸迷你胶 | Invitrogen | XP04205BOX | 15孔 |
| 硝酸纤维素膜 | 通用电气 | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | 氯化钠 |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸 |
| DTT | Invitrogen | D1532 | 二硫苏糖醇 |
| pNPP | Sigma | 20-106 | 对硝基苯基磷酸盐 |
| NaOH | Sigma | S8045 | 氢氧化钠 |
| BCA | Fisher | 23225 | 双辛可宁酸法检测试剂 |
参考文献
- Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
- Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S.
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