尿液、血清及蚊虫样本中寨卡病毒和看家基因的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测

摘要

本方案提供了一种高效且低成本的方法，通过反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）检测人尿液和血清样本或蚊虫中的寨卡病毒或对照靶标。该方法无需RNA提取，可在30分钟内完成。

摘要

成人在感染寨卡病毒（ZIKV）后可能无症状，但在妊娠期间感染可导致流产和严重的神经系统出生缺陷。本实验方案的目标是快速检测人源和蚊源样本中的ZIKV。目前ZIKV检测的金标准是定量逆转录PCR（qRT-PCR）；而逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术则可能实现更高效、低成本的检测，且无需昂贵的仪器设备。本研究在30分钟内直接对多种生物样本进行RT-LAMP检测ZIKV，无需预先从样本中提取RNA。该技术已应用于ZIKV感染患者的尿液、血清以及感染蚊虫样本的检测。在人源样本中以18S核糖体核糖核酸作为对照，在蚊源样本中则以肌动蛋白（actin）作为对照。

引言

2015年，寨卡病毒（ZIKV）因与妊娠期感染相关的严重后果而受到全球广泛关注，包括流产、死产、严重的神经系统出生缺陷（如小头症）以及其他先天性出生缺陷¹。在极少数情况下，ZIKV感染还与吉兰-巴雷综合征相关。ZIKV主要通过伊蚊（Aedes）传播，但也可通过性接触传播¹。由于大多数ZIKV感染者无症状，或仅表现为轻微的流感样症状，且这些症状与其他虫媒病毒感染的症状重叠¹，因此迫切需要改进快速、经济高效的ZIKV检测方法，以对人群和当地蚊虫种群进行筛查。

定量逆转录PCR（qRT-PCR）是检测寨卡病毒（ZIKV）的可靠方法；然而，该技术需要昂贵的专业设备、经过培训的技术人员，以及从待测样本中提取RNA。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）是一种基于PCR技术的单步核酸扩增方法，由于使用了具有链置换特性的嗜热DNA聚合酶，仅需一个恒定的孵育温度即可完成反应。这避免了对热循环仪的需求，并缩短了检测所需的时间。RT-LAMP的其他优势还包括高特异性和灵敏度、在不同pH值和温度条件下均具有良好的稳定性，以及对多种PCR抑制剂具有较强的耐受性²。其成本相对较低，且试剂在室温下稳定。鉴于这些特点，RT-LAMP既可在实验室中应用，也可用于现场检测。因此，目前已开发出多种LAMP反应，用于检测多种病原体及其他类型的感染^3,4,5。本文所述RT-LAMP方案的目标是在30分钟内，无需RNA提取步骤，直接在人血清、尿液样本以及单只感染蚊虫中检测ZIKV。该方法可作为qRT-PCR的替代方案，是一种灵敏、快速的诊断工具，适用于实验室以外的多种环境，且检测速度快。

方案

本文所述所有方法均已获得博蒙特健康机构审查委员会（IRB）的批准。所有实验均按照相关指南和法规进行。

警告：所有潜在传染性材料均应按照生物安全二级标准进行操作，包括使用个人防护装备。任何可能产生气溶胶的操作均应在生物安全柜内进行。此外，活体蚊虫的操作应在相应的节肢动物 containment 等级1-3设施中进行。鉴于寨卡病毒（ZIKV）感染与先天性异常相关，孕妇、正在备孕的女性或其伴侣应尽量减少在实验室接触ZIKV。在美国，ZIKV样本的运输被归类为B类生物物质，需符合美国交通部危险品法规（49 CFR 第171-180部分）的要求，因此样本运输应遵守相关指南。将ZIKV生物样本进口至美国需获得美国疾病控制与预防中心（CDC）的进口许可证。进口任何可能作为ZIKV传播媒介的节肢动物（即使未被感染）均需获得美国农业部（USDA）的许可。本信息截至出版时有效。最新建议可访问 https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html 查询。

注意：RT-LAMP 反应容易出现较高比例的假阳性结果，因此在实验设计时应采取预防措施。所有 RT-LAMP 反应的配制和操作均应使用专用的移液器和带滤芯的吸头。理想情况下，应建立单向的工作流程。若条件允许，分析和成像（第 5 节）应在独立的封闭房间内进行，以防止污染。应尽量减少打开含有 RT-LAMP 产物的试管的操作。

1. RT-LAMP 引物制备

1. 用分子级水将每种冻干的RT-LAMP引物重悬，配制成终浓度为100 µM的溶液（表1）。短暂涡旋混匀引物溶液以确保均匀，并在台式离心机中以最大转速短暂离心，收集管壁上的全部引物溶液。
2. 根据表2中的体积，配制包含FIP、BIP、F3、B3、LF和LB引物的10倍浓度RT-LAMP引物混合液。短暂涡旋混匀引物溶液以确保均匀，并在台式离心机中以最大转速短暂离心，避免任何损失。
   注意：针对埃及伊蚊（Ae. aegypti）肌动蛋白（AEDAE）的RT-LAMP引物组不包含LB引物（环引物并非在所有RT-LAMP反应中均必需）。在此情况下，用分子级水替代LB引物的体积。
3. 引物使用期间应储存于-20 °C，避免反复冻融。

2. 样品制备

1. 对于人尿液样本：可使用新鲜尿液、冷冻尿液或含防腐剂的尿液。对于新鲜或冷冻样本：采集后立即以 700 × g 离心 10 分钟，取上清液用于分析，或于 -80 °C 冷冻保存以备后续使用。使用前将冷冻样本置于冰上解冻。
2. 对于人血清样本：可使用新鲜或冷冻的血清样本。
3. 对于寨卡病毒（ZIKV）感染的细胞系：可使用条件培养基或细胞裂解液。
   注：感染后第 8 天的白纹伊蚊（Ae. albopictus）C6/36 细胞的无细胞条件培养基，可作为 ZIKV RT-LAMP 反应的阳性对照。
4. 对于埃及伊蚊（Ae. aegypti）蚊虫：可使用完整的、新鲜或冷冻的蚊虫尸体。将冷冻蚊虫置于冰上解冻。通过将单只蚊虫置于 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用 P10 移液器枪头碾压 10 次，制备粗制蚊虫裂解液（图 1）。短暂离心裂解液以沉淀残渣。取上清液用于后续 RT-LAMP 分析。
   注：可通过在实验室条件下，以约 10³ 拷贝基因组当量的病毒在 200 nL 体积中对雌性蚊虫进行胸腔微量注射感染，并于感染后第 5 天采集蚊虫，从而制备阳性对照。

3. 准备RT-LAMP预混液

1. 根据表3中的体积指南，在冰上为每种待用引物组配制RT-LAMP预混液。
   注意：使用热不稳定尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）有助于防止假阳性结果。
2. 短暂涡旋振荡以确保所有样品充分混匀，然后短暂离心以防止液体损失。

4. RT-LAMP 检测

1. 每反应取 23.0 µL RT-LAMP 预混液，加入 200 µL PCR 管中。加入 2.0 µL 样本（尿液、血清或步骤 2 中所述的粗制蚊虫裂解物上清液），使每个 RT-LAMP 反应总体积达到 25.0 µL。阴性对照使用分子生物学级水，并设置阳性对照。
   ​注：可使用 PCR 标准品或感染细胞系上清液中的病毒储备液作为阳性对照。
   1. 可选：可增设一个相关虫媒病毒（如登革病毒 DENV）的特异性对照反应。根据样本类型，按步骤 2 所述方法制备样本，将 2.0 µL 特异性对照加入含 23.0 µL RT-LAMP 预混液的 200 µL PCR 管中。
2. 使用加热块、水浴或热循环仪，在 61 °C 下加热样本 30 分钟。
3. 在 80 °C 下加热 10 分钟，使聚合酶失活。

5. RT-LAMP 分析

注意：应在独立的封闭空间内进行RT-LAMP分析。

1. 孵育结束后，通过观察颜色变化来目视判断 RT-LAMP 反应结果。
   1. 将荧光核酸染料用 TAE 缓冲液（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA）按 1:10 比例稀释。
      警告：所有核酸染料均可与核酸结合，因此具有致癌性。操作时需佩戴手套。
   2. 向 12 µL RT-LAMP 反应产物中加入 2 µL 荧光核酸染料稀释液。
      注意：阴性反应呈橙色，阳性反应呈黄绿色。
   3. 可选：使用相机在白色背景下拍摄 RT-LAMP 反应结果的照片。
2. 将样品置于 302 nm 紫外光下，通过荧光信号确认 RT-LAMP 产物的存在，并用相机拍摄结果。
   注意：阳性 RT-LAMP 反应会产生荧光信号。
   警告：使用紫外光时需佩戴防紫外线护目镜或面罩。
3. 可选：通过凝胶电泳进一步确认样品中是否存在 RT-LAMP 产物。
   1. 用含核酸染料的 1× TAE 缓冲液制备 2% 琼脂糖凝胶，以便观察。
      警告：所有核酸染料均可与核酸结合，因此具有致癌性。操作时需佩戴手套。
   2. 在第一泳道加入 5 µL DNA Marker，用于比较分子量。
   3. 对每个 RT-LAMP 反应样品，取 13 µL 反应混合物与 2 µL DNA 上样染料混合，将 15 µL 含上样染料的混合液上样。
   4. 以 90 V 电压电泳 90 分钟，或直至条带分离清晰，然后用 302 nm 紫外光成像。
      注意：阳性 RT-LAMP 反应呈现梯状条带模式；阴性 RT-LAMP 反应应无任何条带。

6. 废弃物处理

1. 将RT-LAMP反应产物放入双层密封袋中处理。切勿进行高压灭菌，因为这可能导致RT-LAMP产物气溶胶化，从而引起未来检测中的假阳性反应。

结果

RT-LAMP 反应可通过三种不同方法进行分析。首先，加入荧光核酸染料后，阳性反应肉眼可见呈黄色/绿色，而阴性反应呈橙色。其次，将荧光核酸染料加入 RT-LAMP 反应体系后，在紫外光激发下可产生荧光信号；阴性反应不会产生可检测的荧光信号，即使阴性对照中可能存在少量背景荧光。最后，可将 RT-LAMP 反应产物在琼脂糖凝胶上进行电泳分析。阳性 RT-LAMP 反应会出现条带模式，而阴性反应则无 DNA 条带。这三种分析方法的示例见图 2和3。这些样本在进行 RT-LAMP 前均未提取 RNA。图 1展示了将整只蚊子在 PBS 中研磨，该处理足以直接用于 RT-LAMP 反应。在图 2中，展示了 ZIKV RT-LAMP 反应的特异性：仅 ZIKV 分子对照呈阳性，而 DENV 分子对照和阴性对照均无阳性反应。此外，在已知感染 ZIKV 的患者的尿液和血清样本中均...

讨论

本文所述的ZIKV RT-LAMP检测方法适用于人源和蚊源样本⁶。其检测下限约为1个基因组当量⁶，这已足够灵敏，因为典型有症状ZIKV感染患者的病毒载量通常为10³ 至 10⁶ PFU/mL⁷。此外，该方法可在无需预先提取RNA或通过细胞培养扩增病毒的情况下直接检测样本中的ZIKV。与qRT-PCR相比，该方法显著缩短了检测时间，降低了成本和生物安全风险。

按照本方案中指定的体积比例使用的尿液样本，应可在无需进行RNA提取的情况下进行RT-LAMP反应。尽管理论上可以增加RT-LAMP反应中样本的用量，但在使用尿液时需格外谨慎。尿液含有多种可能抑制PCR反应的化学物质；其中尿素已被证实可降解聚合酶⁸，若尿液与RT-LAMP反应体系的比例过高，将导致RT-LAMP反应无法进行。如果预期病毒含量较低，则建议使用专用于尿液的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶	新英格兰生物实验室	M0537S
等温扩增缓冲液	新英格兰生物实验室	B0537S
WarmStart RTx 逆转录酶	新英格兰生物实验室	M0380S
Antarctic 热不稳定 UDG	新英格兰生物实验室	M0372S
MgSO4	新英格兰生物实验室	B1003S
100 mM dATP 溶液	新英格兰生物实验室	N0440S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dCTP 溶液	新英格兰生物实验室	N0441S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dTTP 溶液	新英格兰生物实验室	N0443S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dGTP 溶液	新英格兰生物实验室	N0442S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dUTP 溶液	赛默飞世尔科技	R0133
SYBR Green I 核酸凝胶染料	英潍捷基	S7563
Nancy-520	西格玛奥德里奇	01494
低分子量 DNA 标准 Marker	英潍捷基	10-068-013
寨卡病毒阳性对照	德国罗伯特·科赫研究所	N/A
琼脂糖	赛默飞世尔科技	BP1600
BlueJuice 凝胶上样缓冲液	英潍捷基	10816015
引物	Integrated DNA Technologies	定制寡核苷酸
无核酸酶水	Ambion	AM9938
尿液保存剂	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR 标准品	罗伯特·科赫研究所	N/A	Vero E6 细胞上清液
DENV2 New Guinea C 对照	康涅狄格州农业实验站	N/A