尿液、血清和蚊虫样本中寨卡病毒及看家基因的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测

摘要

本方案提供了一种高效且低成本的方法，通过反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）检测人尿液和血清样本或蚊虫中的寨卡病毒或对照目标。该方法无需RNA提取，可在30分钟内完成。

摘要

成人在感染寨卡病毒（ZIKV）后可能无明显症状，但在妊娠期间感染则可能导致流产及严重的神经系统出生缺陷。本实验方案的目标是快速检测人源和蚊源样本中的ZIKV。目前ZIKV检测的金标准是定量逆转录PCR（qRT-PCR）；而逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术则可能实现更高效、低成本的检测，且无需昂贵的仪器设备。本研究在30分钟内直接对多种生物样本进行RT-LAMP检测ZIKV，无需预先从样本中提取RNA。该技术已应用于ZIKV感染患者的尿液、血清以及感染蚊虫样本的检测。在人源样本中以18S核糖体核糖核酸作为对照，在蚊源样本中则以肌动蛋白（actin）作为对照。

引言

2015年，寨卡病毒（ZIKV）因与妊娠期感染相关的严重后果而受到全球广泛关注，包括流产、死产、严重的神经系统出生缺陷（如小头畸形）以及其他先天性出生缺陷¹。在极少数情况下，ZIKV感染还与吉兰-巴雷综合征相关。ZIKV主要通过伊蚊属（Aedes）蚊子传播，但也可通过性接触传播¹。由于大多数ZIKV感染者无症状，或仅表现为轻微的流感样症状，且这些症状与其他虫媒病毒感染的症状重叠¹，因此亟需改进快速、经济高效的ZIKV检测方法，以对人群和当地蚊虫种群进行筛查。

定量逆转录PCR（qRT-PCR）是检测寨卡病毒（ZIKV）的可靠方法；然而，该技术需要昂贵的专业设备、经过培训的技术人员，以及从待测样本中提取RNA。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）是一种基于PCR技术的单步核酸扩增方法，由于使用了具有链置换特性的嗜热DNA聚合酶，仅需一个恒定的孵育温度即可完成反应。这避免了对热循环仪的需求，并缩短了检测所需的时间。RT-LAMP的其他优势还包括高特异性和高灵敏度、在不同pH值和温度条件下均具有良好的稳定性，以及对多种PCR抑制物具有较强的耐受性²。该方法成本相对较低，且试剂在室温下稳定。鉴于这些特点，RT-LAMP既可在实验室中应用，也可用于现场检测。因此，目前已开发出多....

方案

本文所述所有方法均经博蒙特健康机构审查委员会（IRB）批准。所有实验均遵循相关指南和法规进行。

注意：所有潜在传染性材料均应按照生物安全二级标准进行操作，包括使用个人防护装备。任何可能产生气溶胶的操作均应在生物安全柜内进行。此外，活体蚊虫的操作应在适当的节肢动物防护等级1-3级设施中进行。鉴于寨卡病毒（ZIKV）感染与先天性异常相关，孕妇、正在备孕的女性或其伴侣应尽量减少在实验室接触ZIKV。在美国，ZIKV样本的运输被归类为B类生物物质，须符合美国交通部危险品法规（49 CFR 第171-180部分）的要求，因此样本运输应遵守相关指南。将ZIKV生物样本进口至美国需获得美国疾病控制与预防中心（CDC）的进口许可证。任何可能作为ZIKV传播媒介的节肢动物（即使未被感染）的进口，均需获得美国农业部（USDA）的许可。本信息截至发布时有效。最新建议可参见 https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html。

注意：RT-LAMP 反应容易出现较高比例的假阳性结果，因此在实验设计时应采取预防措施。所有 RT-LAMP 反应的设置和操作均应使用专用的移液器和滤芯吸头。理想情况下，应建立单向工作流程。若条件允许，分析与成像（第5节）应在独立的封闭房间内进行，以防止污染。应尽量减少打开含有 RT-LAMP 产物的试管。

1. ....

结果

RT-LAMP 反应可通过三种不同方法进行分析。首先，加入荧光核酸染料后，阳性反应肉眼可见呈黄绿色，而阴性反应呈橙色。其次，在紫外光激发下，含有荧光核酸染料的 RT-LAMP 反应会产生荧光信号；阴性反应则不会产生可检测的荧光信号，即使阴性对照中可能存在微量背景荧光。最后，可将 RT-LAMP 反应产物在琼脂糖凝胶上电泳分析。阳性 RT-LAMP 反应呈现条带模式，而阴性反应无 DNA 条带。这三种分析方法的示例如图 2和3所示。这些样本在进行 RT-LAMP 前均未提取 RNA。图 1展示了将整只蚊子在 PBS 中研磨，该处理足以用于 RT-LAMP 反应。在图 2中，展示了 ZIKV RT-LAMP 反应的特异性：仅 ZIKV 分子对照呈阳性反应，而 DENV 分子对照和阴性对照均无阳性反应。此外，在已知感染 ZIKV 患者的尿液和血清中均检测到 ZIKV，.......

讨论

本文所述的ZIKV RT-LAMP检测方法适用于人源和蚊源样本⁶。其检测下限约为1个基因组当量⁶，这已足够灵敏，因为有症状的ZIKV感染患者的典型病毒载量为10³ 至 10⁶ PFU/mL⁷。此外，该方法可在无需预先提取RNA且无需通过细胞培养扩增病毒的情况下检测样本中的ZIKV。与qRT-PCR相比，该方法显著缩短了检测时间，降低了成本和生物安全风险。

按照本方案中指定的体积比例使用的尿液样本，应可在无需进行RNA提取的情况下进行RT-LAMP反应。尽管理论上可以增加RT-LAMP反应中样本的用量，但在使用尿液时应格外谨慎。尿液含有多种可能抑制PCR反应的化学物质；其中尿素已被证实可降解聚合酶⁸，若尿液与RT-LAMP反应体系的比例过高，将导致RT-LAMP反应无法进行。如果预期病毒含量较低，则建议使用专用于尿液的试.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0537S
等温扩增缓冲液	New England Biolabs	B0537S
WarmStart RTx 逆转录酶	New England Biolabs	M0380S
Antarctic 热不稳定 UDG	New England Biolabs	M0372S
MgSO4	New England Biolabs	B1003S
100 mM dATP 溶液	New England Biolabs	N0440S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dCTP 溶液	New England Biolabs	N0441S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dTTP 溶液	New England Biolabs	N0443S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dGTP 溶液	New England Biolabs	N0442S	脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dUTP 溶液	Thermo Fisher Scientific	R0133
SYBR Green I 核酸凝胶染料	Invitrogen	S7563
Nancy-520	Sigma Aldrich	01494
低分子量 DNA 标准 Marker	Invitrogen	10-068-013
寨卡病毒阳性对照	德国罗伯特·科赫研究所	N/A
琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	BP1600
BlueJuice 凝胶上样缓冲液	Invitrogen	10816015
引物	Integrated DNA Technologies	定制寡核苷酸
无核酸酶水	Ambion	AM9938
尿液保存剂	Norgen Biotek	18126
ZIKV PCR 标准品	罗伯特·科赫研究所	N/A	Vero E6 细胞上清液
DENV2 New Guinea C 对照	康涅狄格州农业实验站	N/A