方法文章

尿液、血清和蚊虫样本中寨卡病毒及看家基因的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测

DOI：

10.3791/58436

⸱

2018年9月14日

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1Department of Urology, Beaumont Health System, 2Foundational Sciences, College of Medicine, Central Michigan University, 3Oakland University William Beaumont School of Medicine

本文内容

摘要

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本方案提供了一种高效且低成本的方法，通过反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）检测人尿液和血清样本或蚊虫中的寨卡病毒或对照目标。该方法无需RNA提取，可在30分钟内完成。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

成人在感染寨卡病毒（ZIKV）后可能无明显症状，但在妊娠期间感染则可能导致流产及严重的神经系统出生缺陷。本实验方案的目标是快速检测人源和蚊源样本中的ZIKV。目前ZIKV检测的金标准是定量逆转录PCR（qRT-PCR）；而逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术则可能实现更高效、低成本的检测，且无需昂贵的仪器设备。本研究在30分钟内直接对多种生物样本进行RT-LAMP检测ZIKV，无需预先从样本中提取RNA。该技术已应用于ZIKV感染患者的尿液、血清以及感染蚊虫样本的检测。在人源样本中以18S核糖体核糖核酸作为对照，在蚊源样本中则以肌动蛋白（actin）作为对照。

引言

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2015年，寨卡病毒（ZIKV）因与妊娠期感染相关的严重后果而受到全球广泛关注，包括流产、死产、严重的神经系统出生缺陷（如小头畸形）以及其他先天性出生缺陷1。在极少数情况下，ZIKV感染还与吉兰-巴雷综合征相关。ZIKV主要通过伊蚊属（Aedes）蚊子传播，但也可通过性接触传播1。由于大多数ZIKV感染者无症状，或仅表现为轻微的流感样症状，且这些症状与其他虫媒病毒感染的症状重叠1，因此亟需改进快速、经济高效的ZIKV检测方法，以对人群和当地蚊虫种群进行筛查。

定量逆转录PCR（qRT-PCR）是检测寨卡病毒（ZIKV）的可靠方法；然而，该技术需要昂贵的专业设备、经过培训的技术人员，以及从待测样本中提取RNA。逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）是一种基于PCR技术的单步核酸扩增方法，由于使用了具有链置换特性的嗜热DNA聚合酶，仅需一个恒定的孵育温度即可完成反应。这避免了对热循环仪的需求，并缩短了检测所需的时间。RT-LAMP的其他优势还包括高特异性和高灵敏度、在不同pH值和温度条件下均具有良好的稳定性，以及对多种PCR抑制物具有较强的耐受性2。该方法成本相对较低，且试剂在室温下稳定。鉴于这些特点，RT-LAMP既可在实验室中应用，也可用于现场检测。因此，目前已开发出多种LAMP反应，用于检测多种病原体及其他类型的感染3,4,5。本文所述RT-LAMP方案的目标是在30分钟内，无需RNA提取步骤，直接在人血清、尿液样本以及单只感染蚊虫中检测ZIKV。该方法可作为qRT-PCR的替代方案，是一种灵敏、快速的诊断工具，适用于实验室以外的多种环境，且检测速度快。

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方案

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本文所述所有方法均经博蒙特健康机构审查委员会（IRB）批准。所有实验均遵循相关指南和法规进行。

注意：所有潜在传染性材料均应按照生物安全二级标准进行操作，包括使用个人防护装备。任何可能产生气溶胶的操作均应在生物安全柜内进行。此外，活体蚊虫的操作应在适当的节肢动物防护等级1-3级设施中进行。鉴于寨卡病毒（ZIKV）感染与先天性异常相关，孕妇、正在备孕的女性或其伴侣应尽量减少在实验室接触ZIKV。在美国，ZIKV样本的运输被归类为B类生物物质，须符合美国交通部危险品法规（49 CFR 第171-180部分）的要求，因此样本运输应遵守相关指南。将ZIKV生物样本进口至美国需获得美国疾病控制与预防中心（CDC）的进口许可证。任何可能作为ZIKV传播媒介的节肢动物（即使未被感染）的进口，均需获得美国农业部（USDA）的许可。本信息截至发布时有效。最新建议可参见 https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html。

注意：RT-LAMP 反应容易出现较高比例的假阳性结果，因此在实验设计时应采取预防措施。所有 RT-LAMP 反应的设置和操作均应使用专用的移液器和滤芯吸头。理想情况下，应建立单向工作流程。若条件允许，分析与成像（第5节）应在独立的封闭房间内进行，以防止污染。应尽量减少打开含有 RT-LAMP 产物的试管。

1. RT-LAMP 引物制备

  1. 用分子级水将每种冻干的RT-LAMP引物重悬，配制成终浓度为100 µM的溶液（表1）。短暂涡旋混匀引物溶液以确保均匀，并在台式离心机中以最大转速短暂离心，收集管壁上的全部引物溶液。
  2. 根据表2中的体积，配制包含FIP、BIP、F3、B3、LF和LB引物的10倍浓度RT-LAMP引物混合液。短暂涡旋混匀引物溶液以确保均匀，并在台式离心机中以最大转速短暂离心，避免任何损失。
    注意：Ae. aegypti 肌动蛋白（AEDAE）的RT-LAMP引物组不包含LB引物（环引物并非在所有RT-LAMP反应中均必需）。在此情况下，用分子级水替代LB引物的体积。
  3. 引物使用期间应储存于-20 °C，避免反复冻融。

2. 样品制备

  1. 对于人尿液样本：可使用新鲜尿液、冷冻尿液或含防腐剂的尿液。对于新鲜或冷冻样本：采集后立即以 700 × g 离心 10 分钟，取上清液用于分析，或于 -80 °C 冷冻保存以备后续使用。使用前将冷冻样本置于冰上解冻。
  2. 对于人血清样本：可使用新鲜或冷冻的血清样本。
  3. 对于寨卡病毒（ZIKV）感染的细胞系：可使用条件培养基或细胞裂解液。
    注：感染后第 8 天的白纹伊蚊（Ae. albopictus）C6/36 细胞的无细胞条件培养基，可用于 ZIKV RT-LAMP 反应的阳性对照。
  4. 对于埃及伊蚊（Ae. aegypti）蚊虫：可使用完整的、新鲜或冷冻的蚊虫尸体。将冷冻蚊虫置于冰上解冻。通过将单只蚊虫放入 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用 P10 移液器枪头碾压 10 次，制备粗制蚊虫裂解液（图 1）。短暂离心裂解液以沉淀残渣。取上清液用于后续 RT-LAMP 分析。
    注：可通过在实验室条件下，以约 103 拷贝基因组当量的病毒在 200 nL 体积中对雌性蚊虫进行胸腔微量注射感染，并于感染后第 5 天采集蚊虫，从而制备阳性对照。

3. 准备 RT-LAMP 反应主混合液

  1. 根据表3中的体积指南，在冰上为每种待用引物组配制RT-LAMP预混液。
    注意：使用热不稳定的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）有助于防止假阳性结果。
  2. 短暂涡旋振荡以确保所有样品充分混匀，然后短暂离心以防止液体损失。

4. RT-LAMP 检测

  1. 每反应向200 µL PCR管中加入23.0 µL RT-LAMP预混液。加入2.0 µL样本（尿液、血清或步骤2中所述的粗制蚊虫裂解物上清液），使每个RT-LAMP反应总体积达到25.0 µL。阴性对照使用分子级水，并设置阳性对照。
    ​注意：可使用PCR标准品或感染细胞系上清液中的病毒储备液作为阳性对照。
    1. 可选：可增设一个相关虫媒病毒（如登革病毒，DENV）的特异性对照反应。根据样本类型，按照步骤2所述方法制备样本，将2.0 µL特异性对照加入23.0 µL RT-LAMP预混液中，置于200 µL PCR管内。
  2. 使用加热块、水浴或热循环仪，在61 °C下加热样本30分钟。
  3. 在80 °C下加热10分钟，使聚合酶失活。

5. RT-LAMP 分析

注意：在独立的封闭空间内进行RT-LAMP分析。

  1. 孵育结束后，通过观察颜色变化来目视判断RT-LAMP反应结果。
    1. 将荧光核酸染料用TAE缓冲液（40 mM Tris，20 mM 乙酸，1 mM EDTA）按1:10比例稀释。
      警告：所有核酸染料均可与核酸结合，因此具有致癌性。操作时需佩戴手套。
    2. 向12 µL RT-LAMP反应产物中加入2 µL稀释后的荧光核酸染料。
      注意：阴性反应呈橙色，阳性反应呈黄绿色。
    3. 可选：使用相机在白色背景下拍摄RT-LAMP反应结果的照片。
  2. 将样品置于302 nm紫外光下，通过荧光信号确认RT-LAMP产物的存在，并用相机拍摄结果。
    注意：阳性RT-LAMP反应会产生荧光信号。
    警告：使用紫外光时需佩戴防紫外线护目镜或面罩。
  3. 可选：通过凝胶电泳进一步确认RT-LAMP产物的存在。
    1. 用含核酸染料的1x TAE缓冲液制备2%琼脂糖凝胶，以便观察。
      警告：所有核酸染料均可与核酸结合，因此具有致癌性。操作时需佩戴手套。
    2. 在第一泳道加入5 µL DNA Marker，用于比较分子量。
    3. 对每个RT-LAMP反应样品，取13 µL反应混合物与2 µL DNA上样染料混合，然后上样15 µL含上样染料的混合液。
    4. 以90 V电压电泳90分钟，或直至条带分离清晰，再用302 nm紫外光成像。
      注意：阳性RT-LAMP反应呈现梯状条带（阶梯型条带），阴性RT-LAMP反应应无任何条带。

6. 废弃处理

  1. 将RT-LAMP反应产物放入双层密封袋中处理。请勿进行高压灭菌，因为这可能导致RT-LAMP产物气溶胶化，从而引起未来检测中的假阳性反应。

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结果

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RT-LAMP 反应可通过三种不同方法进行分析。首先，加入荧光核酸染料后，阳性反应肉眼可见呈黄绿色，而阴性反应则呈橙色。其次，在紫外光激发下，含有荧光核酸染料的 RT-LAMP 反应会产生荧光信号；阴性反应则不会产生可检测到的荧光信号，即使阴性对照中可能存在微量背景荧光。最后，可将 RT-LAMP 反应产物在琼脂糖凝胶上电泳分析。阳性 RT-LAMP 反应会呈现条带模式，而阴性反应则无 DNA 条带。这三种分析方法的示例如图 2和3所示。这些样本在进行 RT-LAMP 前均未提取 RNA。图 1展示了将整只蚊子在 PBS 中研磨，该处理足以用于 RT-LAMP 反应。在图 2中，展示了 ZIKV RT-LAMP 反应的特异性：仅 ZIKV 分子对照呈阳性反应，而 DENV 分子对照和阴性对照均无阳性反应。此外，在已知感染 ZIKV 患者的尿液和血清中均检测到 Z...

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讨论

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本文所述的ZIKV RT-LAMP检测方法适用于人源和蚊源样本6。其检测下限约为1个基因组当量6，这已足够灵敏，因为有症状的ZIKV感染患者的典型病毒载量为103 至 106 PFU/mL7。此外，该方法可在无需预先提取RNA且无需通过细胞培养扩增病毒的情况下检测样本中的ZIKV。与qRT-PCR相比，该方法显著缩短了检测时间，降低了成本和生物安全风险。

按照本方案中指定的体积比例使用的尿液样本，应可在无需进行RNA提取的情况下进行RT-LAMP反应。尽管理论上可以增加RT-LAMP反应中样本的用量，但在使用尿液时应格外谨慎。尿液含有多种可能抑制PCR反应的化学物质；其中尿素已被证实可降解聚合酶8，若尿液与RT-LAMP反应体系的比例过高，将导致RT-LAMP反应无法进行。如果预期病毒含量较低，则建议使用专用于尿液的试...

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披露

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LEL 和 MBC 在寨卡病毒诊断方法方面拥有知识产权。其余作者无竞争利益。

致谢

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本工作由 Maureen 和 Ronald Hirsch 家族的慈善捐助以及密歇根圣玛丽医院的 Field 神经科学研究所资助。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。我们还要感谢 Bernadette Zwaans 博士和 Elijah Ward 对稿件提出的宝贵审稿意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bst 2.0 WarmStart DNA 聚合酶New England BiolabsM0537S
等温扩增缓冲液 New England BiolabsB0537S
WarmStart RTx 逆转录酶New England BiolabsM0380S
Antarctic 热不稳定 UDGNew England BiolabsM0372S
MgSO4New England BiolabsB1003S
100 mM dATP 溶液New England BiolabsN0440S脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dCTP 溶液New England BiolabsN0441S脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dTTP 溶液New England BiolabsN0443S脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dGTP 溶液New England BiolabsN0442S脱氧核苷酸混合物 N0446S
100 mM dUTP 溶液Thermo Fisher ScientificR0133
SYBR Green I 核酸凝胶染料InvitrogenS7563
Nancy-520Sigma Aldrich01494
低分子量 DNA 标准 MarkerInvitrogen10-068-013
寨卡病毒阳性对照德国罗伯特·科赫研究所N/A
琼脂糖Thermo Fisher ScientificBP1600
BlueJuice 凝胶上样缓冲液Invitrogen10816015
引物Integrated DNA Technologies定制寡核苷酸
无核酸酶水AmbionAM9938
尿液保存剂Norgen Biotek18126
ZIKV PCR 标准品罗伯特·科赫研究所N/AVero E6 细胞上清液
DENV2 New Guinea C 对照康涅狄格州农业实验站N/A

参考文献

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  1. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
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