利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入

摘要

本文介绍了一种利用聚乙二醇（PEG）介导的转化方法在原生质体中表达蛋白质的实验方案。该方法可简便地表达目标蛋白，并高效地在活体条件下（in vivo）研究蛋白质的定位及其在不同实验条件下的导入过程。

摘要

叶绿体是植物中负责多种细胞过程（如光合作用以及多种次生代谢物和脂质的合成）的重要细胞器。叶绿体执行这些生理功能需要大量蛋白质。超过95%的叶绿体蛋白由细胞核编码，在细胞质核糖体上翻译后从细胞质导入叶绿体。因此，细胞核编码的叶绿体蛋白正确地靶向并导入叶绿体，对于叶绿体乃至整个植物细胞的正常功能至关重要。细胞核编码的叶绿体蛋白含有可特异性靶向叶绿体的信号序列。定位于叶绿体或细胞质中的分子机制可识别这些信号，并介导蛋白质的导入过程。为研究蛋白质向叶绿体导入或靶向的机制 体内我们开发了一种快速、高效的基于原生质体的方法，用于分析蛋白质向拟南芥叶绿体的导入。该方法利用从拟南芥叶片组织中分离的原生质体 拟南芥在此，我们提供了一种利用原生质体研究蛋白质导入叶绿体机制的详细实验方案。

引言

叶绿体是植物中最重要的细胞器之一。叶绿体的主要功能之一是进行光合作用¹。叶绿体还参与多种其他生化反应，用于合成脂肪酸、氨基酸、核苷酸以及大量次生代谢产物^1,2。所有这些反应都需要大量不同类型的蛋白质。然而，叶绿体基因组仅包含约100个基因^3,4。因此，叶绿体必须从细胞质中导入其所需的大部分蛋白质。事实上，已有研究表明，大多数叶绿体蛋白在翻译完成后从细胞质中被导入叶绿体^4,5,6。植物细胞需要特定的机制将蛋白质从细胞质导入叶绿体。尽管过去几十年中对这些蛋白质导入机制已有研究，但我们仍未能在分子水平上完全理解这些过程。本文提供了一种制备原生质体及在外源体系中于原生质体中表达基因的详细方法。该方法可能有助于深入阐明叶绿体蛋白质导入的分子机制。

蛋白质导入可通过多种不同方法进行研究。其中一种方法涉及使用一种 体外 蛋白质输入系统^7,<....

方案

1. 拟南芥植株的培养

1. 配制1 L Gamborg B5（B5）培养基：将3.2 g含维生素的B5培养基粉末、20 g蔗糖和0.5 g 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）加入约800 mL去离子水中，用氢氧化钾（KOH）调节pH至5.7。再加入去离子水定容至1 L。加入8 g植物琼脂，于121 °C高压灭菌15 min。
2. 待培养基冷却至55 °C后，在超净工作台中将20–25 mL B5培养基倒入培养皿（直径9 cm，高1.5 cm）。将平板干燥2–3天，用保鲜膜封好，置于冰箱中保存备用。
3. 在离心管（e-tube）中加入1 mL 70%（v/v）乙醇，持续振荡2–3 min，对Arabidopsis thaliana种子进行表面灭菌。去除上清液，加入1 mL 1%（v/v）次氯酸钠溶液，继续振荡2–3 min。每培养皿准备100–150粒种子。
   1. 弃去上清液，用1 mL蒸馏水清洗种子，重复此步骤4次。将灭菌后的种子置于4 °C环境中放置3天，以同步种子萌发。
4. 使用微量移液器将100–150粒种子播种于B5培养基平板上，并用医用胶带密封培养皿。
5. 将植株置于生长室中培养2周，培养条件为：16 h光照/8 h黑暗光周期，光照强度100 µmol·m^-2·s^-1，相对湿度70%，温度20 °C。

结果

可通过两种方法检测蛋白质向叶绿体的导入：荧光显微镜观察以及SDS-PAGE分离后的免疫印迹分析。本实验中，我们使用了RbcS-nt:GFP融合蛋白，该融合蛋白包含RbcS的前79个N端氨基酸残基（含转运肽）与GFP的融合序列。当目标蛋白RbcS-nt:GFP被成功导入叶绿体后，在荧光显微镜下观察，其绿色荧光信号应与叶绿素自发产生的红色荧光信号重叠（图1）。两种信号的高度共定位表明蛋白质已成功导入叶绿体。通常情况下，GFP信号在整个叶绿体内弥散分布，或集中于叶绿体中心区域，同时在整个叶绿体中呈现微弱的弥散信号，具体分布模式取决于特定蛋白的性质。此外，可通过抗GFP抗体进行免疫印迹分析以进一步验证蛋白质的导入情况。从原生质体中提取总蛋白，经SDS-PAGE分离后进行蛋白质印迹分析（图2）。大多数情况下，若蛋白质成功导入叶绿体，免疫印迹中应出现两条蛋白条带：上部条带代表全长前体蛋白，下部条带代表导入叶绿体后加工处理后的成熟形式。加工后蛋白的量应随时间推移而增加.......

讨论

我们提供了一种利用拟南芥（Arabidopsis）原生质体研究蛋白质导入叶绿体的详细实验方案。该方法在研究蛋白质导入过程方面具有强大优势。这一简单且多功能的技术可用于检测目的货物蛋白向叶绿体的靶向运输。使用该方法时，原生质体可从拟南芥（Arabidopsis）的叶片组织中制备^11,12，而植物材料可取自从早期到完全成熟的不同生长阶段的叶片。然而，在培养用于原生质体制备的植物时必须格外注意。应使用非常健康的植株，因为来自健康植株的原生质体更能耐受聚乙二醇（PEG）介导转化过程中的多个步骤。另一个重要的注意事项是使用新鲜配制的溶液。由于原生质体较为脆弱且对渗透压高度敏感，溶液浓度的微小变化都可能对其造成严重损伤。

我们一直利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入^9,13,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含维生素的GAMBORG B5培养基	Duchefa Biochemie	G0210.0050
蔗糖	Duchefa Biochemie	S0809.5000
MES一水合物	Duchefa Biochemie	M1503.0250
琼脂，粉末	JUNSEI	24440S1201
微孔外科胶带	3M	1530-0
不锈钢外科刀片 No.10	FEATHER	Unavailable
50 ml 锥形管	SPL LIFE SCIENCES	50050
Macerozyme R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Unavailable
纤维素酶 ONOZUKA R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Unavailable
牛血清白蛋白（BSA）	VWR	0332-100G
D-甘露醇	SIGMA	M1902-1KG
氯化钙二水合物	MP BIOMEDICALS	0219463505-5KG
Twister	VISION SCIENTIFIC	VS-96TW
CD-1 筛选杯	SIGMA	S1145
CD-1 筛网	SIGMA	S3895
培养皿	SPL LIFE SCIENCES	10090
巴斯德吸管	HILGENBERG	3150102
台式离心机	VISION SCIENTIFIC	VS-5500N
氯化钠	JUNSEI	19015S0350
氯化钾	SIGMA	P3911-1KG
无水D-葡萄糖	BIO BASIC	GB0219
氢氧化钾	DUKSAN	40
四水合硝酸钙	SIGMA	C2786-500G
聚乙二醇	SIGMA	P2139-2KG
六水合氯化镁	SIGMA	M2393-500G
13 ml 管，100×16 mm，聚丙烯材质	SARSTEDT	55.515
显微镜载玻片	MARIENFELD	1000412
显微镜盖玻片	MARIENFELD	101030
计数板	MARIENFELD	650030
Axioplan 2 成像显微镜	Carl Zeiss	Unavailable
1.5 ml 微量离心管	SARSTEDT	72.690.001
2-巯基乙醇	SIGMA	M3148-250ML
十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质组学级	VWR	M107-500G
TRIS，超纯级	VWR	0497-5KG
DTT（DL-二硫苏糖醇），生物技术级	VWR	0281-25G
溴酚蓝钠盐 ACS级	VWR	0312-50G
甘油	JUNSEI	27210S0350
Living Colors A.v. 单克隆抗体（JL-8）	TAKARA	632381