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方法文章

利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入

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DOI：

10.3791/58441

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2018年12月10日

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用聚乙二醇（PEG）介导的转化方法在原生质体中表达蛋白质的实验方案。该方法可简便地表达目标蛋白，并高效地在活体条件下（in vivo）研究蛋白质的定位及其在不同实验条件下的导入过程。

摘要

叶绿体是植物中负责多种细胞过程（如光合作用以及多种次生代谢物和脂质的合成）的重要细胞器。叶绿体执行这些生理功能需要大量蛋白质。超过95%的叶绿体蛋白由细胞核编码，在细胞质核糖体上翻译后从细胞质导入叶绿体。因此，细胞核编码的叶绿体蛋白正确地靶向并导入叶绿体，对于叶绿体乃至整个植物细胞的正常功能至关重要。细胞核编码的叶绿体蛋白含有可特异性靶向叶绿体的信号序列。定位于叶绿体或细胞质中的分子机制可识别这些信号，并介导蛋白质的导入过程。为研究蛋白质向叶绿体导入或靶向的机制 体内我们开发了一种快速、高效的基于原生质体的方法，用于分析蛋白质向拟南芥叶绿体的导入。该方法利用从拟南芥叶片组织中分离的原生质体 拟南芥在此，我们提供了一种利用原生质体研究蛋白质导入叶绿体机制的详细实验方案。

引言

叶绿体是植物中最重要的细胞器之一。叶绿体的主要功能之一是进行光合作用1。叶绿体还参与多种其他生化反应，用于合成脂肪酸、氨基酸、核苷酸以及大量次生代谢产物1,2。所有这些反应都需要大量不同类型的蛋白质。然而，叶绿体基因组仅包含约100个基因3,4。因此，叶绿体必须从细胞质中导入其所需的大部分蛋白质。事实上，已有研究表明，大多数叶绿体蛋白在翻译完成后从细胞质中被导入叶绿体4,5,6。植物细胞需要特定的机制将蛋白质从细胞质导入叶绿体。尽管过去几十年中对这些蛋白质导入机制已有研究，但我们仍未能在分子水平上完全理解这些过程。本文提供了一种制备原生质体及在外源体系中于原生质体中表达基因的详细方法。该方法可能有助于深入阐明叶绿体蛋白质导入的分子机制。

蛋白质导入可通过多种不同方法进行研究。其中一种方法涉及使用一种 体外 蛋白质输入系统7,8采用这种方法， 体外翻译后的蛋白质前体与纯化的叶绿体共同孵育 体外，通过SDS-PAGE分离后进行蛋白质印迹分析以检测蛋白质导入情况。该方法的优势在于可对蛋白质进入叶绿体的每一步骤进行详细研究。因此，该方法已被广泛用于鉴定叶绿体蛋白质导入分子机制的组成成分，并解析转运肽的序列信息。近年来，另一种利用叶片组织原生质体的方法被建立，并已广泛应用于叶绿体蛋白质导入的研究。9,10这种方法的优势在于，原生质体所提供的细胞环境比完整细胞更接近于天然状态 体外 因此，原生质体系统使我们能够研究该过程的许多其他方面，例如相关的胞质事件以及靶向信号特异性的决定机制。本文中，我们提供了一种利用原生质体研究蛋白质导入叶绿体的详细实验方案。

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方案

1. 拟南芥植株的培养

  1. 配制1 L Gamborg B5（B5）培养基：将3.2 g含维生素的B5培养基粉末、20 g蔗糖和0.5 g 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）加入约800 mL去离子水中，用氢氧化钾（KOH）调节pH至5.7。再加入去离子水定容至1 L。加入8 g植物琼脂，于121 °C高压灭菌15 min。
  2. 待培养基冷却至55 °C后，在超净工作台中将20–25 mL B5培养基倒入培养皿（直径9 cm，高1.5 cm）。将平板干燥2–3天，用保鲜膜封好，置于冰箱中保存备用。
  3. 在离心管（e-tube）中加入1 mL 70%（v/v）乙醇，持续振荡2–3 min，对Arabidopsis thaliana种子进行表面灭菌。去除上清液，加入1 mL 1%（v/v）次氯酸钠溶液，继续振荡2–3 min。每培养皿准备100–150粒种子。
    1. 弃去上清液，用1 mL蒸馏水清洗种子，重复此步骤4次。将灭菌后的种子置于4 °C环境中放置3天，以同步种子萌发。
  4. 使用微量移液器将100–150粒种子播种于B5培养基平板上，并用医用胶带密封培养皿。
  5. 将植株置于生长室中培养2周，培养条件为：16 h光照/8 h黑暗光周期，光照强度100 µmol·m-2·s-1，相对湿度70%，温度20 °C。

2. 质粒的制备

注意：转化应使用高纯度质粒；建议使用商品化的质粒提取试剂盒。

  1. 使用DNA提取试剂盒纯化质粒（RbcS-nt:GFP）。为浓缩DNA，在1.5 mL离心管中进行乙醇沉淀，并将DNA沉淀溶解于100 µL蒸馏水中。使用分光光度计在260 nm处测定质粒浓度。将质粒稀释至终浓度约为2 µg/µL。将质粒保存于-20 °C，待用。

3. 原生质体的分离

  1. 准备以下溶液。
    1. 制备酶溶液，其中包含 0.25% (w/v) 果胶酶（macerozyme）、1.0% (w/v) 纤维素酶（cellulase）、400 mM D-甘露醇、8 mM 氯化钙（CaCl2）、0.1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）和 5 mM MES。用 KOH 调节 pH 至 5.6。
      1. 使用孔径为 0.45 μm 的醋酸纤维素滤器过滤酶溶液。将 25 mL 酶溶液分装至 50 mL 锥形管中，于 -20 °C 保存。使用前在室温（RT）下解冻酶溶液，并充分混匀。
    2. 通过将 21 g 蔗糖溶解于 100 mL 去离子水中制备 21% (w/v) 蔗糖溶液，并对溶液进行高压灭菌。
    3. 制备 W5 溶液，其中包含 154 mM 氯化钠（NaCl）、125 mM CaCl2、5 mM 氯化钾（KCl）、5 mM 葡萄糖和 1.5 mM MES。用 KOH 调节 pH 至 5.6，并对溶液进行高压灭菌。
    4. 制备 MaMg 溶液，其中包含 400 mM D-甘露醇、15 mM 氯化镁（MgCl2）和 5 mM MES。用 KOH 调节 pH 至 5.6，并对溶液进行高压灭菌。
    5. 制备 1 M D-甘露醇和 1 M 硝酸钙储备液以配制 PEG 溶液。对这些溶液进行高压灭菌。
  2. 使用手术刀从约 1–2 个 B5 培养板中收获生长约 2 周的完整叶片组织，并将收获的叶片放入含有 25 mL 酶溶液的 50 mL 锥形管中。将装有酶溶液和叶片组织的锥形管水平放置于旋转摇床上，在黑暗条件下轻轻振荡。完全消化叶片组织需要 8–12 小时。
  3. 孵育 8–12 小时后，将酶溶液（含从叶片组织释放的原生质体）通过孔径为 140 µm 的滤网倒入新的培养皿中。小心地将含有原生质体的酶溶液叠加在 15 mL 21% (w/v) 蔗糖溶液上，然后在摆动桶转子中以 98 × g 离心 10 分钟，加速度和减速度设为最低。
  4. 使用巴斯德吸管小心地将最上层（酶溶液层）以及酶溶液与蔗糖溶液界面处的原生质体转移至含有 30 mL W5 溶液的 50 mL 锥形管中。以 51 × g 离心 6 分钟。此时，原生质体将沉淀于锥形管底部。
  5. 用移液器小心弃去上清液，避免扰动原生质体沉淀。加入 25 mL W5 溶液，轻轻重悬原生质体。将原生质体悬液置于 4 °C 冰箱中孵育至少 1 小时以使其稳定。

4. 使用聚乙二醇进行原生质体转化

  1. 在50 mL锥形管中加入4 g PEG 8000、4 mL 1 M甘露醇溶液、1 mL 1 M Ca(NO3)2和1.8 mL蒸馏水，配制40% PEG溶液，并充分混匀。将溶液放入微波炉加热20–30秒以溶解PEG。将40% PEG溶液置于室温下冷却。
    注意：40% PEG溶液应每次新鲜配制。若在冰箱中4 °C孵育期间原生质体未完全沉淀，可将样品在46 × g离心2分钟。
  2. 小心但彻底地移除上清液，并向原生质体沉淀中加入MaMg溶液，使原生质体浓度达到5 × 106/mL。
    注意：原生质体数量可通过显微镜下血细胞计数板测定。
  3. 将10 µg质粒DNA加入一个空的13 mL圆底试管中，再用移液器加入300 µL原生质体溶液。
    注意：移液器吸头末端应剪去。每次取原生质体样品前，均应先将含原生质体的溶液充分重悬，以确保每管加入相同数量的原生质体。
  4. 轻轻旋转试管使质粒DNA与原生质体混合，立即用移液器加入300 µL 40% PEG溶液。继续轻轻但彻底地旋转试管混匀，室温孵育30分钟；将试管倾斜至接近水平位置并旋转数次。
  5. 加入1 mL W5溶液，以类似方式手动轻轻但彻底地旋转混匀。室温孵育10分钟。
  6. 分别使用1.5 mL和2 mL W5溶液，重复此步骤两次。最后一次加入W5溶液后，继续孵育30分钟。
  7. 在46 × g离心4分钟。弃去上清液，加入2 mL W5溶液，轻轻但彻底混匀。在22 °C暗室中孵育。

5. 叶绿体蛋白质导入的分析

注意：原生质体经 PEG 介导转化后，孵育时间范围为 8 至 24 小时。

  1. 荧光显微镜技术
    1. 使用剪裁过尖端的移液枪吸取10 µL原生质体溶液，滴加至载玻片上，小心加盖盖玻片，避免损伤原生质体。
    2. 将载玻片置于配备有绿色荧光蛋白（GFP）和叶绿素自发荧光激发/发射滤光片组的荧光显微镜载物台上。
    3. 使用冷却电荷耦合器件（CCD）相机采集图像，并利用图像编辑软件对图像进行处理，生成伪彩色图像。
  2. 总蛋白提取与免疫印迹
    1. 配制含有2.5%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和2%（v/v）2-巯基乙醇的变性缓冲液。
      注意：可通过测量转运肽加工程度来定量蛋白质向叶绿体的导入 通过 使用抗GFP抗体进行免疫印迹分析。
    2. 将原生质体转移至离心管中，在46 × g条件下离心4分钟。
    3. 移去上清液，加入80 µL变性缓冲液，剧烈涡旋振荡5秒，然后加入5倍体积的SDS上样缓冲液（250 mM Tris-Cl（pH 6.8）、0.5 M DTT、10%（w/v）SDS、0.05%（w/v）溴酚蓝和50%（v/v）甘油）。充分混匀后，煮沸10分钟。
    4. 将该蛋白质样品进行标准的SDS-PAGE电泳，随后使用抗GFP抗体进行免疫印迹检测。

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结果

可通过两种方法检测蛋白质向叶绿体的导入：荧光显微镜观察以及SDS-PAGE分离后的免疫印迹分析。本实验中，我们使用了RbcS-nt:GFP融合蛋白，该融合蛋白包含RbcS的前79个N端氨基酸残基（含转运肽）与GFP的融合序列。当目标蛋白RbcS-nt:GFP被成功导入叶绿体后，在荧光显微镜下观察，其绿色荧光信号应与叶绿素自发产生的红色荧光信号重叠（图1）。两种信号的高度共定位表明蛋白质已成功导入叶绿体。通常情况下，GFP信号在整个叶绿体内弥散分布，或集中于叶绿体中心区域，同时在整个叶绿体中呈现微弱的弥散信号，具体分布模式取决于特定蛋白的性质。此外，可通过抗GFP抗体进行免疫印迹分析以进一步验证蛋白质的导入情况。从原生质体中提取总蛋白，经SDS-PAGE分离后进行蛋白质印迹分析（图2）。大多数情况下，若蛋白质成功导入叶绿体，免疫印迹中应出现两条蛋白条带：上部条带代表全长前体蛋白，下部条带代表导入叶绿体后加工处理后的成熟形式。加工后蛋白的量应随时间推移而增加...

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讨论

我们提供了一种利用拟南芥（Arabidopsis）原生质体研究蛋白质导入叶绿体的详细实验方案。该方法在研究蛋白质导入过程方面具有强大优势。这一简单且多功能的技术可用于检测目的货物蛋白向叶绿体的靶向运输。使用该方法时，原生质体可从拟南芥（Arabidopsis）的叶片组织中制备11,12，而植物材料可取自从早期到完全成熟的不同生长阶段的叶片。然而，在培养用于原生质体制备的植物时必须格外注意。应使用非常健康的植株，因为来自健康植株的原生质体更能耐受聚乙二醇（PEG）介导转化过程中的多个步骤。另一个重要的注意事项是使用新鲜配制的溶液。由于原生质体较为脆弱且对渗透压高度敏感，溶液浓度的微小变化都可能对其造成严重损伤。

我们一直利用原生质体研究蛋白质向叶绿体的导入9,13,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了韩国农村振兴厅农业科学技术发展协同研究计划（项目编号：PJ010953012018）以及韩国国家研究基金会由科学技术信息通信部资助的项目（编号：2016R1E1A1A02922014）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含维生素的GAMBORG B5培养基Duchefa BiochemieG0210.0050
蔗糖Duchefa BiochemieS0809.5000
MES一水合物Duchefa BiochemieM1503.0250
琼脂，粉末JUNSEI24440S1201
微孔外科胶带3M1530-0
不锈钢外科刀片 No.10FEATHERUnavailable
50 ml 锥形管SPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Unavailable
纤维素酶 ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Unavailable
牛血清白蛋白（BSA）VWR0332-100G
D-甘露醇SIGMAM1902-1KG
氯化钙二水合物MP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
CD-1 筛选杯SIGMAS1145
CD-1 筛网SIGMAS3895
培养皿SPL LIFE SCIENCES10090
巴斯德吸管HILGENBERG3150102
台式离心机VISION SCIENTIFICVS-5500N
氯化钠JUNSEI19015S0350
氯化钾SIGMAP3911-1KG
无水D-葡萄糖BIO BASICGB0219
氢氧化钾DUKSAN40
四水合硝酸钙SIGMAC2786-500G
聚乙二醇SIGMAP2139-2KG
六水合氯化镁SIGMAM2393-500G
13 ml 管，100×16 mm，聚丙烯材质SARSTEDT55.515
显微镜载玻片MARIENFELD1000412
显微镜盖玻片MARIENFELD101030
计数板MARIENFELD650030
Axioplan 2 成像显微镜Carl ZeissUnavailable
1.5 ml 微量离心管SARSTEDT72.690.001
2-巯基乙醇SIGMAM3148-250ML
十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质组学级VWRM107-500G
TRIS，超纯级VWR0497-5KG
DTT（DL-二硫苏糖醇），生物技术级VWR0281-25G
溴酚蓝钠盐 ACS级VWR0312-50G
甘油JUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. 单克隆抗体（JL-8）TAKARA632381

参考文献

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