方法文章

原生质体在叶绿体中导入蛋白质的研究

DOI：

10.3791/58441

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2018年12月10日

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1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

本文内容

摘要

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在这里, 我们描述了一种协议, 以表达蛋白质原生质体使用 peg 介导的转化方法。该方法为感兴趣的蛋白质的表达提供了方便的方法, 有效地研究了蛋白质定位和各种实验条件在体内的导入过程。

摘要

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叶绿体是一个重要的细胞器, 负责植物的各种细胞过程, 如光合作用和许多次生代谢物和脂类的产生。叶绿体需要大量的蛋白质来处理这些不同的生理过程。95% 以上的叶绿体蛋白是核编码的, 在细胞核糖体上翻译后从细胞溶胶中导入叶绿体。因此, 将这些核编码的叶绿体蛋白适当导入或靶向叶绿体对于叶绿体和植物细胞的正常运作至关重要。核编码叶绿体蛋白包含特定于叶绿体的信号序列。分子机械定位到叶绿体或细胞溶胶识别这些信号并进行导入过程。为了研究蛋白质在体内导入或靶向叶绿体的机制, 我们开发了一种快速、高效的原生质体基方法来分析蛋白质导入拟南芥叶绿体的情况。在这种方法中, 我们使用从拟南芥叶片组织中分离出的原生质体。在这里, 我们提供了一个详细的协议, 用于使用原生质体来研究蛋白质导入叶绿体的机制。

引言

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叶绿体是植物中最重要的细胞器之一。叶绿体的主要功能之一是进行光合作用1。叶绿体还为脂肪酸、氨基酸、核苷酸和许多次生代谢物1, 2 的产生进行许多其他生化反应。对于所有这些反应, 叶绿体需要大量不同类型的蛋白质。然而, 叶绿体基因组只包含大约100个基因3,4。因此, 叶绿体必须从细胞溶胶中导入大部分蛋白质。事实上, 大多数叶绿体蛋白被证明是在翻译4,5,6后从细胞溶胶中导入的。植物细胞需要特定的机制来从细胞溶胶导入蛋白质到叶绿体。然而, 尽管这些蛋白质进口机制在过去几十年里一直在研究, 但我们仍然没有在分子层面上完全理解它们。在这里, 我们提供了一个详细的方法来制备原生质体和外生表达基因在原生质体。该方法可用于阐明蛋白质导入叶绿体的分子机制。

蛋白质的导入可以用许多不同的方法来研究。其中一种方法涉及使用体外蛋白质导入系统7,<....

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方案

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1. 拟南芥植物的生长

  1. 制备1升 gamborg b5 (b5) 培养基, 加入3.2 克 b5 培养基, 包括维生素, 20 克蔗糖, 0.5 克 2-(n-吗啡) 乙烷磺酸 (mes) 约800毫升去离子水, 并调整 ph 值到5.7 与氢氧化钾 (koh)。加入更多的去离子水, 使总体积在121°c 下达到1升, 加入8克植物琼脂和高压灭菌器15分钟。
  2. 允许介质冷却至 55°c, 并将 b5 介质的 20–25 ml 倒入培养皿中 (直径9厘米, 高度1.5 厘米) 在干净的长凳上。干板 2-3天, 用干净的包装包装, 并将其保存在冰箱中, 直到使用。
  3. 在离心管 (电子管) 中, 用1毫升 70% (vv) 乙醇消毒拟南芥种子, 连续晃动 2-3分钟, 去除上清液, 加入 1% (v/v) 亚氯酸钠溶液, 并连续晃动2-3分钟准备–每个培养皿150个种子。
    1. 取出上清液, 用1毫升蒸馏水清洗种子。重复此步骤 4 x。将灭菌种子在4°c 下放置 3天, 使种子发芽同步。
  4. 使用微移液器将100–150种子播种到 b5 板上, 并用手术胶带密封板。
  5. 生长在生长室, 在100μmol·m-2 ·s-1 光强、70% 相对湿度和 20°c温度下, 以 16h h 光/暗色循环生长 2周.

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结果

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蛋白质导入叶绿体可以通过两种方法进行检测: 荧光显微镜和 sds-page 介导的分离后的免疫印迹分析。在这里, 我们使用 rbcs-nt:gfp, 一种融合结构编码 79 n-端氨基酸残基 rbcs 含有与 gfp 融合的过境肽。当蛋白质导入叶绿体时, 目标蛋白 rbcs-nt:gfp 应与叶绿素自动荧光的红色荧光信号合并, 如荧光显微镜检查 (图 1)。这两个信号的紧密重叠表明蛋白质导入叶绿体。通常, gfp 信号分布在整个叶绿体中, 或集中在叶绿体的中心, 在叶绿体中的微弱扩散信号, 具体取决于单个蛋白质。蛋白质的导入可以通过使用 gfp 抗体的免疫印迹分析来证实。总蛋白由原生质体制备, 并由 sds-page 分离, 然后进行西方印迹分析 (图 2)。在大多数情况下, 如果一种蛋白质被适当地导入叶绿体, 则应在免疫细胞中观察到两个蛋白质带: 上部带对应于全长前体, 而下带对应于导入叶绿体后的加工形式。蛋白质的加工形式的数量应该以与时间相关的方式增.......

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讨论

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我们提供了一个详细的方案, 用于使用拟南芥原生质体研究蛋白质进口到叶绿体。该方法对研究蛋白质导入过程具有很强的功能。这种简单、通用的技术可用于检查预定货物蛋白的靶向叶绿体。利用该方法, 从拟南芥11、12的叶片组织中提取原生质体, 可在从非常早期到完全成熟的叶片的许多不同生长阶段提取原生质体。然而, 在种植用于原生质体制备的植物时, 必须小心。人们应该使用非常健康的植物, 因为从健康植物中制备的原生质体可以承受 peg 介导的转化所涉及的许多步骤。另一个重要的预防措施是使用新的解决方案。溶液浓度的轻微变化会极大地损害原生质体, 因为它们很脆弱, 对渗透压力非常敏感。

我们一直在使用原生质体来研究蛋白质导入叶绿体 9,13,14。在这些研究的基础上.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作是在农业科技发展合作研究方案 (项目号) 的支持下进行的。pj010953012018), 政府农村发展管理局和国家研究基金会 (韩国) 赠款, 由科学和信息和通信技术部资助 (no. 2016r1e1a1a02922014), 大韩民国。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
GAMBORG B5 培养基，包括维生素Duchefa BiochemieG0210.0050
蔗糖Duchefa BiochemieS0809.5000
MES 一水合物Duchefa BiochemieM1503.0250
琼脂、粉末JUNSEI24440S1201
微孔手术胶带3M1530-0
手术刀片不锈钢 No.10FEATHER不可用
锥形管，50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.
的纤维素酶 ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.
牛白蛋白 （BSA）VWR0332-100G
D-甘露醇SIGMAM1902-1KG
二水合氯化钙MP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
CD-1 筛杯SIGMAS1145
CD-1 筛杯SIGMAS3895
培养皿SPL LIFE SCIENCES10090
巴斯德吸管HILGENBERG3150102
实验室离心机 / 台式VISION SCIENTIFICVS-5500N
氯化钠JUNSEI19015S0350
氯化钾SIGMAP3911-1KG
D-葡萄糖，无水生物碱性GB0219
氢氧化钾DUKSAN40
硝酸钙四水合SIGMAC2786-500G
聚乙二醇SIGMAP2139-2KG
氯化镁六水合SIGMAM2393-500G
管 13ml，100x16mm，PPSARSTEDT55.515
显微镜载玻片MARIENFELD1000412
显微镜盖板MARIENFELD101030
计数室MARIENFELD650030
Axioplan 2 成像显微镜卡尔蔡司不可用
微量管 1.5mlSARSTEDT72.690.001
2-巯基乙醇SIGMAM3148-250ML
十二烷基硫酸钠 （SDS），蛋白质组学级VWRM107-500G
TRIS，超纯级VWR0497-5KG
DTT （DL-二硫苏糖醇），生物技术级VWR0281-25G
溴酚蓝钠盐 ACSVWR0312-50G
甘油JUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. 单克隆抗体 （JL-8）TAKARA632381
不可用不可用物 物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

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