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利用开放获取的 NASA GeneLab 平台研究太空飞行对小鼠生理学的影响

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DOI：

10.3791/58447

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2019年1月13日

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1WYLE Labs, Space Biosciences Division, NASA Ames Research Center, 2Space Biosciences Division, NASA Ames Research Center, 3USRA, NASA Ames Research Center

本文内容

摘要

NASA GeneLab 平台为来自生物航天实验的宝贵组学数据提供了无限制的访问。我们描述了典型的小鼠空间实验是如何在太空中进行的，以及如何获取和分析此类实验的数据。

摘要

在太空中进行生物学实验需要特殊的条件和程序，以确保这些研究能够高效且有效地开展。此外，鉴于此类实验机会稀少，必须最大限度地发挥其科学价值。组学技术的快速发展为显著提升珍贵太空飞行样本所产生的数据量提供了契机。为充分利用这一机遇，美国国家航空航天局（NASA）开发了GeneLab平台，以提供对太空飞行组学数据的无限制访问，并鼓励对其开展广泛分析。啮齿类动物（包括大鼠和小鼠）是科学家研究太空相关生物学效应常用的模式生物。在太空飞行期间用于饲养啮齿类动物的装置称为啮齿类动物栖息舱（Rodent Habitats，曾用名：动物封闭模块），其在尺寸、气流以及水和食物获取方式等方面均与标准实验动物饲养笼存在显著差异。此外，由于国际空间站（ISS）上的环境和大气条件，动物暴露于较高浓度的CO2环境中。我们近期报道指出，无论动物处于地面还是太空环境，栖息舱内的小鼠其转录组均发生显著变化。进一步分析表明，这些变化与缺氧应答一致，可能由较高CO2浓度所引发。本文将介绍典型的啮齿类动物太空实验如何开展，如何通过GeneLab平台获取这些实验的组学数据，以及如何识别数据中的关键影响因素。通过这一流程，任何研究人员都有可能做出重要发现，从而改变未来太空任务与活动的设计方案。

引言

本文的总体目标是提供一种清晰的方法，介绍如何使用美国国家航空航天局（NASA）的GeneLab平台1，以及如何将太空中的啮齿类动物实验转化为组学数据以供分析。执行太空任务的人类会面临多种健康风险，包括重力场改变、太空辐射、与地球隔离以及其他恶劣的环境因素2,3,4,5,6。在太空和地面开展的生物学实验已帮助界定并量化了这些风险7,8,9,10,11,12,13,14。在太空中，这些实验已在国际空间站（ISS）、航天飞机以及其他轨道平台上进行。由于太空实验存在机组人员时间有限和微重力环境等特殊问题，因此需要专门的设备和方法。目前已有多种平台可用于在太空中利用植物、动物和微生物模型开展复杂的实验15。

啮齿类动物模型对于增进我们理解包括人类在内的哺乳动物如何响应太空飞行具有特别重要的意义。这些研究涵盖了太空飞行对肌肉结构16,17,18和免疫功能19,20,21的影响。然而，地球上用于饲养啮齿类动物的标准屏障环境笼具并不适用于太空飞行实验22,23。因此，多年来小鼠和大鼠曾被搭载于多种不同笼具中进行飞行与饲养，包括日本宇宙航空研究开发机构（JAXA）的栖息笼具24、俄罗斯无人卫星BION-M1上使用的动物运载太空舱25,26,27、意大利航天局设计的小鼠抽屉系统（Mice Drawer System, MDS）28,29,30、美国国家航空航天局（NASA）的动物封闭模块（Animal Enclosure Module, AEM），以及目前使用的NASA啮齿类动物运输器与栖息笼具23。最早的啮齿类动物实验是在航天飞机上使用被称为动物封闭模块（AEM）的笼具开展的。该设备曾用于航天飞机上的27次啮齿类动物实验23。AEM最初是为航天飞机上相对较短时间的实验（< 20天）而开发的。随着国际空间站（ISS）的发展，AEM已被改进以支持更长时间的实验，现被称为啮齿类动物栖息笼具（Rodent Habitats）22,23。新的啮齿类动物栖息笼具采用“加速空间站实验处理”（EXpedite the PRocessing of Experiments for Space Station, EXPRESS）机架接口，专为支持国际空间站上的长期任务而设计。啮齿类动物栖息笼具在尺寸、气流、过滤与排气系统以及食物和水的获取方式方面，与标准的屏障环境笼具有显著差异（图1）。尽管如此，该设备已被证实是一种有效的科研平台，为揭示太空飞行引起哺乳动物生理变化的关键机制提供了重要见解19,31,32,33,34,35,36。

如今，可从包括啮齿类动物在内的生物航天实验中生成大量组学数据。最近，这些组学实验的数据已通过美国国家航空航天局（NASA）GeneLab平台公开提供1，该平台是一个综合性的数据存储库和分析平台，允许任何人利用航天飞行实验数据提出科学假设。GeneLab提供了用于数据发现、访问、共享和分析的工具。我们利用GeneLab数据集发现，标准动物饲养笼与在太空中使用的小鼠专用栖息装置之间存在显著差异，导致小鼠转录组发生巨大变化36。我们分析了四个不同的公开数据集，比较了饲养在啮齿类动物栖息装置或标准饲养笼中的啮齿类动物不同组织的转录组。通过无偏倚的系统生物学分析，我们确定发生改变的主要驱动因子和通路与缺氧反应一致，这是由于国际空间站（ISS）内较高的CO2浓度导致栖息装置中CO2水平升高所致；由于这些栖息装置为被动式系统，直接吸入周围环境空气，因此内部CO2浓度随之升高。该结果展示了科学家如何利用开源工具和公开数据生成新发现，揭示ISS环境对宇航员健康的影响。

本文介绍了啮齿类动物空间实验的实施方法，以及如何通过一个与空间生物学相关的开源组学平台获取这些实验的数据。我们讨论了用于空间任务的啮齿类动物栖息装置的配置，以及空间飞行样本组织的处理流程。同时，本文还阐述了如何在GeneLab平台上发现和获取空间飞行组学数据，并识别驱动生物体对空间飞行产生整体响应的关键因素。36本文将通过一个具体实例来展示该方案的实施方法，即比较Beheshti发表的饲养在啮齿类动物栖息装置中的实验动物与普通动物实验房对照组之间发生的生物学差异。 等36需要注意的是，地面对照对于航天飞行啮齿类动物实验至关重要。如本方案所述，这些对照实验需在完全相同的条件下进行（即 CO2 条件、湿度、温度、笼具尺寸等）在国际空间站（ISS）的啮齿类动物栖息地与具有标准环境条件（即, CO2 条件、湿度和温度）条件。在地面控制的啮齿类动物栖息地（Rodent Habitat）中饲养的啮齿类动物可用于与太空中的啮齿类动物进行直接比较。而在动物实验房（vivarium）笼具中饲养的啮齿类动物则可用于不同饲养环境（例如，动物实验房笼具与啮齿类动物栖息地硬件）之间的生物学比较。啮齿类动物栖息地与动物实验房笼具有所不同，其具有持续的气流（0.1–0.3 m/s）、较长的使用周期，以及一个次级排气过滤器，该过滤器通过微重力条件下持续的气流引导动物排泄物至过滤器并加以捕获和吸收。此外，啮齿类动物栖息地采用被动系统并吸入环境空气，因此其二氧化碳（CO₂）水平也较高。2 由于国际空间站舱内浓度升高（约5,000 ppm）。

方案

动物饲养和组织处理的实验方案遵循实验室动物护理的标准指南，并已获得美国国家航空航天局（NASA）飞行和地面机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 啮齿类动物栖息环境的配置

注意： 美国国家航空航天局（NASA）啮齿类动物栖息装置（此前称为AEMs）具有与普通动物房笼具不同的特性，以适应太空环境中的操作（图1）。

  1. 每个啮齿类动物栖息舱中饲养10只小鼠（每只小鼠体重不超过30 g）。当栖息舱分为两个隔间时，每个隔间饲养5只小鼠；若为单个隔间，则可饲养10只小鼠。
    注意：美国国家航空航天局（NASA）啮齿类动物栖息舱为每只啮齿类动物提供的可活动表面积大于标准动物饲养笼。
  2. 对于地面对照组动物，将小鼠饲养在国际空间站环境模拟器（ISSES）内的啮齿类动物栖息舱中，环境条件（包括CO2浓度、温度和相对湿度）与飞行组动物完全相同。
  3. 根据国家研究委员会（NRC）对小鼠的营养需求37，为动物提供自由摄取的定制NASA营养优化啮齿类食物条（NuRFB），并通过压力激活式饮水装置提供饮水。
  4. 监测动物的健康状况和行为表现；啮齿类动物栖息舱内设有12:12小时光照周期，白天使用LED照明，夜间进行视频健康检查时使用红外照明，光照周期与标准设施中的动物饲养笼相似。
  5. 在啮齿类动物栖息舱内安装四个摄像头，用于每日监测动物的健康与行为，并在夜间使用红外照明采集视频资料。
  6. 将啮齿类动物装载于运输舱（图2B）中，通过“龙”飞船或类似运载工具运送至国际空间站（ISS）。
  7. 确保啮齿类动物在装载入运输舱发射前由NASA飞行兽医进行观察和检查，并在抵达国际空间站后由受过培训的机组人员再次检查，随后转移至啮齿类动物栖息舱。
  8. 在此过渡期间，运输舱内最多可容纳20只小鼠（每侧10只）或12只大鼠。
    注意：与啮齿类动物栖息舱类似，运输舱对环境条件为被动维持。在此短暂过渡期内，该单体装置最多可容纳20只小鼠。

2. 用于太空飞行实验的啮齿类动物操作

  1. 从标准供应商处获取啮齿类动物。
    注意： 运输后，将啮齿类动物分组安置于标准的动物饲养笼内，让动物在装载至运输装置前，适应NASA NuRFB、饮水阀和抬高的金属网底。将啮齿类动物保留在笼中可使其自然适应。小鼠在啮齿类栖息舱和动物饲养笼之间的转移操作，应遵循所有啮齿类实验通用的操作规程。12,27,28啮齿类动物栖息系统（图1A将分别用于航天飞机（STS）和国际空间站（ISS）的太空飞行任务，以及模拟ISS或STS环境条件的地面对照实验。
  2. 对于某些任务，使用标准的动物饲养笼具（图1B) 作为动物房对照。每个标准动物房笼具使用5只或10只小鼠。
  3. 对于啮齿类动物栖息地，将10只小鼠分配至两个不同隔间，每隔间5只。移除笼具隔板，使每个栖息地的10只小鼠共同饲养于同一隔间内。
  4. 在太空飞行任务中使用啮齿类硬件的三个组件，具体如下所述（图2).
    1. 将啮齿类动物放入运输器（图2B) 用于地球与国际空间站之间往返运输，以双倍密度装载（每侧10只小鼠，每个运输装置共20只小鼠）。
    2. 到达国际空间站后，连接动物接入单元（AAU）（图2C）转移至运输装置。使用小鼠转移箱（MTB）将啮齿类动物从运输装置转移至饲养栖息地（每只MTB放置5只小鼠）（图 2D).
      注意： AAU用于存放所有动物制品（例如, 粪便、尿液、毛发）进入ISS舱内。
    3. 将AAU从运输装置上拆下并连接至啮齿类动物栖息舱。然后将动物从MTB转移至啮齿类动物栖息舱（图2A任务期间，他们将一直居住在其中。
      注意： CO2 由于国际空间站舱内所有啮齿类动物栖息舱的浓度升高，其浓度为 5,000 ppm。
  5. 监测啮齿类动物栖息地的温度和湿度，但该栖息地无主动温控系统。需确保啮齿类动物研究团队与国际空间站（ISS）协作，维持并控制舱内温度，因为舱内温度决定了啮齿类动物栖息地的温度。
    注意： 啮齿动物饲养环境中的光照与黑暗循环每12小时交替一次（例如, 5:00–17:00（世界时），光照开启）以及国际空间站（ISS）乘组定期且频繁更换食物（每周或每两周一次），并每约28天补充一次水。

3. 啮齿类动物的安乐死与组织处理

  1. 为实施安乐死，通过腹腔注射（IP）给予啮齿类动物过量的全身麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪，剂量最高达150/45 mg/kg体重，用磷酸盐缓冲液稀释至总体积0.3 mL） 与第二种安乐死方法（颈椎脱位或胸腔切开术）联合使用。
  2. 在国际空间站（ISS）上进行的实验：
    1. 将啮齿类动物活体送回，或
    2. 在ISS上实施安乐死。
      1. 将啮齿类动物尸体在国际空间站的冰箱中于 -95 ± 2 °C 冷冻，并通过现有的返回舱（目前为 SpaceX 龙飞船）返回地球。
      2. 啮齿类动物返回地球后，解剖所有器官和组织（即, 肝脏、肾脏、皮肤、肌肉、心脏、脾脏、眼睛、肾上腺、肺和脑），并于 -80 °C 或RNA稳定溶液中保存。
  3. 所有对照地面实验的步骤和时间安排均需与飞行实验保持一致，仅以3–5天的时间差进行，以匹配国际空间站的遥测数据。
  4. 从保存的组织中，采用 GeneLab 平台（genelab.nasa.gov）上各数据集相关页面详细描述的标准方案，分别进行 RNA、蛋白质和 DNA 的提取。
    注意： 未被主要研究者使用的啮齿类动物组织将纳入美国国家航空航天局（NASA）机构科学样本库。这些样本保存在艾姆斯研究中心（ARC）的非人类生物样本库中，经过编目后向科学界开放申请获取。可获取的组织样本信息可通过生命科学数据档案公共网站查询： https://Lsda.jsc.nasa.gov/Biospecimen

4. 从RNA、DNA和蛋白质提取物生成组学数据

  1. 从提取的大分子（RNA、DNA、蛋白质）出发，采用标准方案生成组学数据。这些方案在GeneLab的相关研究元数据中有详细描述。

5. GeneLab 数据库与数据提交

注意： 与空间生物学相关的组学数据已提交至 GeneLab 数据库。GeneLab 接收并托管由全球多家空间机构资助的空间相关组学数据。

  1. 生成可托管在 GeneLab 仓库中的组学相关数据。
    1. 在分析完成时或根据研究者的判断，将生成的数据提交至 GeneLab。
      注意： 提交至其他公共组学数据库的数据将被导入并发布到 GeneLab 仓库中。GeneLab 生成的数据在无 embargo 期的情况下进行整理并发布。GeneLab，特别是样本处理实验室，利用优化的提取方案和技术，从各类太空飞行实验中生成组学数据。
  2. 当数据准备就绪后，按照以下方法对元数据和数据进行格式化并传输至 GeneLab（补充图 1）：
    1. 使用 ISAcreator 工具定义实验研究并存储元数据。
      注意： ISAcreator 工具可在此处下载，并附有指导教程38。
    2. 参考此处列出的数据39，了解原始数据和处理后数据文件所接受的数据类型和格式。
      1. 为优化上传和存储，请压缩数据文件。
    3. 通过工作区将元数据以及原始和/或处理后的数据传输给 GeneLab 数据管理员40。
    4. 创建用户名和密码，并上传数据。
  3. 数据上传至工作区后，与 GeneLab 管理员共享数据。
    注意： 有关如何上传和共享文件的详细步骤，请参见《数据提交指南》41。
  4. 每项提交均将由管理员核实，并发布至 GeneLab 仓库42。

6. 使用 GeneLab 上的搜索功能查找用于分析的数据集

  1. 通过访问链接（补充图2）在GeneLab中搜索不同的数据集38。
    1. 特别与之前的一项出版物相关36，请搜索以下术语：GLDS-21、GLDS-111、GLDS-25 和 GLDS-63。
  2. 点击屏幕左侧的 "GeneLab Data System" 进入GeneLab主页。
  3. 在 "search data" 框中输入关键词，以搜索特定感兴趣领域。本例中，请分别单独输入以下每个数据集标识符：GLDS-21、GLDS-111、GLDS-25 和 GLDS-63。
  4. 除了搜索GeneLab数据库外，还可通过在搜索栏下方选择所需的复选框，在其他数据库（包括NIH GEO、EBI Pride和ANL MG-RAST）中进行跨库搜索。
    注意： 目前仅在GeneLab数据库中，用户可通过以下过滤类别进行搜索：生物体、检测类型、影响因素和项目类型。

7. 分析相关文件的存储与转移

注意： GeneLab 工作区旨在直接从 GeneLab 数据库存储和传输文件（补充图 3）。

  1. 点击数据系统菜单顶部的 "Workspace"。
  2. 如果是新用户，请注册一个新账户。
    注意： GeneLab 工作区由 GenomeSpace43 提供支持。
  3. 通过点击顶部菜单中的 "Help" 并选择用户指南，获取有关如何使用工作区的详细说明。
  4. 每位用户均可通过左侧菜单中选择 "Public/genelab" 文件夹，访问 GeneLab 仓库中的所有数据集。
  5. 通过进入目标数据所在的文件夹，右键单击特定文件，在弹出的菜单中选择 "copy/move"，选择要复制到的目标文件夹，然后点击 "copy"，将感兴趣的数据集复制到本地目录工作区。
    1. 根据上述说明，查找与先前发表的研究36相关的以下数据集：GLDS-21、GLDS-111、GLDS-25 和 GLDS-63，并将其复制到本地工作区。

8. 访问每项研究的元数据和描述

注意： GeneLab 仓库中每个数据集的元数据文件位于左侧菜单中的 "Public/genelab" 数据集子文件夹中。

  1. 通过访问每个数据集内名为 "metadata" 的子文件夹中的一个或多个元数据文件，查找目标数据集的元数据信息。例如，对于 GLDS-100 数据集，"Public/genelab/GLDS-100/metadata" 子文件夹中包含两个文件："GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-Eye-ISA.zip" 和 "GLDS-100_metadata_RR1ExpDesign.pdf"。
    1. 确保每个数据集均包含一个按照 ISATab 规范提供元数据的单一压缩文件（该规范涵盖 MIAME、MIAPE 及其他 MIBBI 框架标准中关于最小元数据要求的内容）。此类文件的名称应始终以 "ISA.zip" 结尾。例如，GLDS-100 数据集的该文件为 "GLDS-100_metadata_RR1_BIOBANK-Eye-ISA.zip"。
  2. 使用 ISACreator 工具44 或文本编辑器查看和访问 ISATab 元数据，其中包含研究描述以及每个数据集的检测（assay）元数据。
    注意： 在 ISATab 元数据中，样本被描述并关联至生物检测（bioassay），而生物检测也被描述并关联至输出数据文件。
  3. 检查各数据集中按检测类型划分的子文件夹中是否存在输出检测数据文件。例如，对于 GLDS-100 数据集，RNA-Seq 输出检测文件位于 "Public/genelab/GLDS-100/transcriptomics/" 文件夹中。

9. GeneLab 数据分析

注意： 可针对不同的组学数据实施多种分析流程。此处以一种无偏倚的系统生物学转录组学分析流程为例，用于确定所研究系统的"关键驱动因子"。

  1. 查阅先前已发表的文献36,45,46,47,48,49,50，以理解本流程。
  2. 选定感兴趣的特定数据集进行分析后，使用以下方法将数据下载至本地计算机：
    1. 点击特定数据集。
    2. 点击标题栏最左侧的 "Study Files" 选项卡。
    3. 确保该菜单中包含所有数据文件和元数据。
    4. 要下载每个文件，请点击具体的文件名。
  3. 对于将从 GeneLab 下载的微阵列数据集，请使用以下预处理步骤：
    1. 使用 RMAExpress51 对商用微阵列数据分别进行背景扣除和分位数归一化（Quantile normalization）处理。
    2. 使用 R 生成主成分分析（PCA）图，以确定生物学重复样本的聚类情况。
    3. 将数据导入 MultiExperiment Viewer52，首先使用错误发现率（FDR）统计方法计算显著差异基因，初始设定为 FDR < 0.05；若 FDR 统计未发现显著基因，则改用标准 t 检验，初始设定 p 值 < 0.05 来确定显著差异基因。
    4. 在确定统计学上显著调控的基因后，设定倍数变化（fold-change）阈值为 ≥ 1.2 或 ≤ -1.2，用于比较实验样本与对照样本。
  4. 使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）53 进行通路和功能预测：
    1. 可通过 GenePattern54,55、直接访问 GSEA 平台，或使用 R 编程环境执行 GSEA 分析。
    2. 使用以下基因集确定显著调控的通路：C2、C5 和 hallmarks（标志性基因集）。
    3. 对显著调控的基因集进行前沿分析（leading-edge analysis），确定与各实验比较组及基因集相关的前沿基因。
    4. 找出在每种实验条件下所有基因集中重叠的前沿基因。
  5. 使用另一平台确定显著调控的预测功能和通路。本例中使用 Ingenuity 通路分析（Ingenuity Pathway Analysis, IPA）来识别显著的上游调控因子、生物功能和经典通路。
    1. 上传在步骤 9.4.4 中确定的具有倍数变化值的显著差异基因列表。
    2. 按照 IPA 的操作指南，为每个实验比较组生成上游调控因子、生物功能和经典通路。
    3. 确定与上游调控因子、生物功能和经典通路相关的基因，其激活 z 值评分需满足 ≥ 2（表示激活）或 ≤ -2（表示抑制）。
    4. 找出与上述所有预测结果相关的重叠基因。
  6. 确定步骤 9.4 与 9.5 中的共有/重叠基因。
    注意：这些基因被视为在所分析的实验条件下控制大多数预测功能和活性的关键/驱动基因。已有研究表明，敲除或促进这些基因的表达将导致所研究的实验条件或系统功能丧失45,46,49。
    1. 通过 IPA（或任何网络构建软件）构建网络，以确定基因之间的连接性。
    2. 将连接度最高的基因视为驱动关键基因的中心枢纽（central hub）。
    3. 为确定不同数据集之间的关联性，将所有关键基因整合到一个网络中，并重复连接性分析，以识别在所有被分析数据集中共同出现的中心枢纽基因。

10. 在 GeneLab 上使用 Galaxy56 界面分析转录组数据

注意：本文描述了使用 GeneLab Galaxy 界面（2018 年秋季上线）分析 GeneLab 转录组数据的实验方案。Galaxy 教程资源丰富，有关 Galaxy 通用操作的示例教程可参见其他文献57,58。

  1. 用户可以使用 Google 或 NASA 凭据登录 GeneLab。GeneLab Galaxy 工具位于 "分析"菜单下。
  2. 通过以下三种方式将数据导入 GeneLab Galaxy 平台。
    1. 使用 "上传数据"功能从本地文件系统上传数据。
    2. 使用 "获取数据"部分中的 GenomeSpace 导入工具，从 GeneLab GenomeSpace 导入数据。
      注意：所有 GeneLab 数据文件均位于 "公共"文件夹中，并按数据集登录号（见上文）进行组织。
    3. 导入的数据将显示在右侧分析区域的 "历史记录"中。用户可拥有多个历史记录，可通过历史记录面板顶部的 "历史记录选项"或 "查看所有历史记录"按钮进行管理。
  3. 分析工具列在界面左侧，并支持搜索功能。
  4. 检查已导入的数据集是否出现在当前历史记录中。
    注意：每个数据集均有大量相关数据详情可供查看。
  5. 在左侧选择一个工具，将在中心面板填充相应的表单，用于设置分析选项和指定输入数据。填写表单后点击 "执行"按钮，即可创建并提交分析任务。
  6. 检查已提交的任务，这些任务会在历史记录中显示，并以颜色编码标识其执行状态（排队中、执行中、已完成且无错误或有错误）。
  7. 将多个工具连接成复杂的分析流程。通过 "工作流"菜单中的工具管理工作流。图 3 展示了一个用于处理 RNA-seq 数据的示例工作流。
  8. 使用 "共享数据"菜单与他人共享数据集、工作流和历史记录。

结果

从航天飞行转录组数据中确定关键驱动因素，将有助于美国国家航空航天局（NASA）评估健康风险，并开发潜在的对抗措施，以减轻对宇航员健康的不利影响。在我们最近的出版物中，已遵循上述步骤并利用GeneLab数据集，成功揭示了一项新发现，即国际空间站（ISS）内的CO2浓度可能影响健康36。我们还在其他研究中应用了上述技术，成功确定了所研究系统的关键驱动因素45,46,47,48,49,50。本文将展示如何成功利用该方案的结果来确定关键驱动因素。

本研究主要关注饲养在啮齿类动物栖息系统地面对照组和动物房对照组中的啮齿类动物所发生的生物学差异。如上所述，深入理解这两种栖息环境至关重要，这将帮助我们了解可能因国际空间站（ISS）环境而影响健康的潜在混杂因素。对于所有啮齿类动物太空飞行实验而言，这些地面对照组对于确定哪些生物学变化直接与太空飞行相关，或由国际空间站的环境条件引起，同样至关重要。如实验方案中所述，动物房栖息环境未暴露于啮齿类动物栖息系统中存在的较高 CO2 水平；其 CO2 浓度维持在地球上正常的水平（目前为 300 至 380 ppm）。两种栖息环境的温度和湿度条件相似。

我们使用 GeneLab 平台的以下数据集来确定饲养在 Rodent Habitat 地面对照组和动物饲养室对照组中的啮齿类动物之间驱动两种栖息环境差异的关键基因：GLDS-21、GLDS-111、GLDS-25 和 GLDS-63。如上所述，针对每个数据集分别独立分析 Rodent Habitat（此前称为 AEM）与动物饲养室对照组之间的显著差异基因。主成分分析（PCA）图显示了生物学重复样本的聚类情况（图4 展示了 GLDS-21 的 PCA 图）。基于预处理后的数据，我们从不同的 GSEA 基因集分析中确定了主导性基因。利用变化倍数达 1.2 倍（log2）的基因，我们预测了与上游调控因子、经典信号通路及生物功能相关的基因。随后，我们针对每个数据集找出所有基因中共同/重叠的基因（图5）。这些基因目前被认为驱动了 Rodent Habitat（或 AEM）与动物饲养室对照组中啮齿类动物之间的生物学响应差异。这些关键基因之间相互关联的网络图展示了各数据集中分析所得的核心枢纽基因（图6）。例如，MAPK1 是来自小鼠 STS-108 骨骼肌组织的核心枢纽基因（图6A）。这表明该基因是驱动关键基因表达的核心因素，最有可能是导致饲养在 Rodent Habitat 与动物饲养室笼具中小鼠产生生物学差异的主要作用基因。在我们之前的研究中，我们讨论了这些关键基因如何与现有科学文献中关于 CO2 响应的相关性，以及这些基因如何可能导致在小鼠中观察到的生物学变化36。

接下来，我们采用系统生物学方法，确定了一个“主调控因子”，该因子连接所有数据集/组织，并可能负责在动物实验环境模块（AEMs）中饲养的啮齿类动物相较于传统动物房笼具中动物所表现出的普遍生物学效应。该方法通过分析所有数据集中构建关键基因网络时连接性最强的基因来实现。结果表明，MAPK1 是所有关键基因中连接性最强的基因，处于网络中心位置（图7）。为了验证 MAPK1 是否可能介导了因 AEMs 中较高 CO2 水平所引起的小鼠生物学变化，我们查阅了相关科学文献以寻找支持性证据。我们发现多项研究提示 MAPK1 与 CO259 及缺氧19,60,61 存在关联。

动物饲养模块示意图及活体动物饲养笼具的生物学研究设置
图1啮齿动物栖息盒（此前称为 AEM）与动物饲养笼的比较。 (A) NASA 提供的 AEM 笼具图像（致谢：NASA/Dominic Hart）。B) 目前使用的标准动物饲养笼（由本实验室拍摄）。该图片改编自 Beheshti 等36. 请点击此处查看该图的放大版本。

空间模块 containment units 示意图；微重力实验的设备设置。
图 2：在航天任务往返运输过程中涉及的啮齿类动物栖息硬件系统的三个不同模块。左侧模块（A）为啮齿类动物栖息模块（此前称为 AEM），中间模块（B）为运输器，右侧模块（C）为动物接入单元（AAU）。（D）小鼠转移箱（MTB）。（来源：NASA/Dominic Hart）。请点击此处查看此图的放大版本。

基因组数据处理工作流程图；用于生物信息学中的序列比对与分析设置。
图 3：可在 GeneLab Galaxy 界面中用于处理 RNA-seq 数据的分析工作流程示例。 请点击此处查看该图的高清版本。

主成分分析（PCA）三维图；小鼠骨骼肌数据比较，AEM 与普通饲养环境（Vivarium）
图4：预处理步骤后代表性数据集的主成分分析（PCA）。 AEM 用 GLDS-21 数据集 与 STS-118 任务中来自小鼠骨骼肌的动物饲养笼示意图。 请点击此处以查看此图的放大版本。

使用预测的IPA上游调节因子、通路和生物功能进行基因分析的维恩图
图5： 维恩图展示使用不同通路预测工具所确定的关键基因。 请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达调控示意图；激酶与转录调控因子的上调/下调
图6：在AEM与所有条件及小鼠组织之间确定的关键基因. 动物饲养笼具 (A-E) 每个数据集/啮齿类动物组织关键基因的网络图谱。Log2 以倍数变化（以1.2倍变化为阈值）表示基因表达水平的变化，用于呈现下调基因绿色深浅的差异，而不同深浅的红色表示上调基因的倍数变化。绿色或红色越深，表示倍数变化越大。该图已根据Beheshti修改 等36. 请点击此处以查看此图的放大版本。

基因调控网络示意图；箭头表示基因相互作用和信号通路。
图 7：与普通动物房笼具相比，确定 Rodent Habitat 饲养环境中啮齿类动物的“主调控因子”。 所有单个关键基因（图 6）之间的连接关系通过 IPA 分析确定，并以网络形式展示。该网络以径向图形式呈现，连接度最高的关键基因 MAPK1 位于中心位置。 请点击此处查看该图的高清版本。

补充材料 图1GeneLab-GenomeSpace 与 ISACreator 的集成以简化数据处理操作。  请点击此处下载该图片。

补充 图2：使用联邦/整合异构生物信息学外部数据库（GEO、PRIDE、MG-RAST）在 GeneLab 中进行搜索的截图。 请点击此处下载该图

补充 图3：GeneLab 协作工作区的截图，显示用户账户管理以及访问控制（例如，，私有、共享、公共文件夹）。 请点击此处下载该图

讨论

NASA GeneLab 平台是一个全面的组学数据库与分析平台，可使科学界围绕空间生物学提出新的假设。本文详细介绍了一项从航天飞行开始到利用公开可用的空间生物学平台分析数据并生成新假设的大鼠实验完整流程。此外，我们还提供了一套广泛适用的无偏倚系统生物学分析方案，用于识别驱动所研究系统的关键基因。我们以近期的一项研究36为例，展示了该方案如何有效应用于空间生物学中新假设的生成。我们希望这能帮助研究人员更深入地理解空间飞行实验的实施方式，以及这些实验所产生的数据如何成为 GeneLab 上的可用资源，最终有助于对公开获取的空间生物学组学数据进行更清晰的解读。

在我们的实验方案中，关于啮齿类动物空间飞行实验及其所产生数据的分析，存在若干关键步骤。理解啮齿类动物栖息环境（Rodent Habitat）的设置对于设计和开展最优的空间飞行实验至关重要。这具体包括我们在本方案第1步中提供的操作流程和描述。一旦研究人员充分了解啮齿类动物栖息环境与普通动物饲养室笼具之间存在的不同条件，便可将所获得的生物学结果恰当地与太空中的环境条件相关联。此外，啮齿类动物栖息环境不得进行任何修改，因其已由美国国家航空航天局（NASA）优化设计并批准用于空间飞行任务。

为了阐释生物学结果，我们提供了从将数据上传至 GeneLab 到数据分析并生成新的空间生物学假说的完整操作流程。尽管理解如何生成数据的每一步都至关重要，但数据分析中最关键的步骤是第 9 步和第 10 步。第 9 步提供了一种使用无偏倚系统生物学方法分析转录组数据的方案，以确定真正驱动所分析实验条件的基因或通路。第 10 步尤为关键，因为它为用户提供了一种简便的方法，通过 GeneLab 平台分析组学 GeneLab 数据集。针对数据分析的某些步骤，可对所提供的方案进行适当修改。具体而言，步骤 9.4–9.6 可使用 R 编程语言或用户偏好的其他工具完成。根据数据集的不同，可采用不同的统计方法和倍数变化阈值来确定显著差异表达的基因。此外，在步骤 9.5 和 9.6 中确定关键基因时，用户可对该方案进行调整，并使用任何基于显著差异表达基因来预测功能的工具。核心理念在于，利用多种预测性功能组学工具，可识别出参与研究系统中大多数受调控功能的相关基因。

GeneLab 平台正在持续开发中，尽管本文所述的分析是在数据下载后进行的，但 GeneLab 的下一阶段将允许直接在 GeneLab 平台上对组学数据进行分析，从而提供一个简便的工作流程，以生成可用于高级分析的处理后数据。此外，尽管我们目前重点介绍了解读转录组数据的方案，GeneLab 平台实际上包含多种类型的组学数据，如蛋白质组、基因组、代谢组和表观基因组数据。未来的平台将包含针对这些不同类型组学数据的分析流程和指导规范。GeneLab 的最终阶段还将实现一个系统层面的可视化界面，使基础用户能够便捷地生成空间生物学假说。

最后，我们的系统生物学分析为利用组学数据集确定任何研究系统中的关键驱动基因/通路提供了一种独特且无偏倚的方法。我们已在多个独立研究中成功应用该方法，有效鉴定了关键驱动因子36,45,46,47,48,49,50。在一项与癌症相关的组学研究中，我们通过体外敲除关键基因，实验验证了该方法所预测的关键基因/通路确实在驱动药物治疗反应45。我们观察到，正如本方案所预测的那样，由于关键基因的缺失，药物治疗不再有效。我们认为，这种无偏倚的系统生物学方案可作为确定任何组学研究中关键通路的有力工具。

本方案提供了一种快速且高效的方法，用于生成新的空间生物学假说。研究人员可利用GeneLab生成的数据，为未来的经费申请、实验验证以及针对微重力和空间辐射的防护措施开发潜在靶点提供支持。本文提供的方案将有助于未来空间生物学研究以最优效率开展，从而保障长期空间任务的安全实施。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢美国宇航局艾姆斯生命科学数据档案馆的 Alison French 在获取与啮齿类动物栖息地相关的视频以及整体协助获取笼具相关信息方面提供的帮助。我们还感谢美国宇航局艾姆斯研究中心的 Marla Smithwick 在获取正确信息方面给予的支持。本研究经费由美国宇航局艾姆斯研究中心的 GeneLab 项目提供，资金来源于美国宇航局空间生命与物理科学研究与应用部（SLPSRA）的空间生物学计划。文中所提及的任何商品名称仅用于描述目的，不意味着美国政府的认可。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
野生型C57BL/6小鼠The Jackson LaboratoryC57BL/6JC57BL/6小鼠用于与啮齿类动物研究-1实验相关的数据集
BALB/c小鼠TaconicBALBBALB/c小鼠用于与啮齿类动物研究-3实验相关的数据集
动物饲养笼具Charles River Laboratory从Charles River Laboratory购买的标准小鼠笼具
啮齿类动物栖息舱NASA该笼具及其所有组件均由NASA内部研制
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020RNAlater用于组织保存，以便后续进行RNA提取

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利用开放获取的 NASA GeneLab 平台研究太空飞行对小鼠生理学的影响
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