本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。
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本文内容
摘要
摘要
心肌梗死（MI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。再生医学的一个主要目标是在心肌梗死后补充已坏死的心肌组织。尽管已有多种策略被用于心肌再生，干细胞治疗仍是补充心肌梗死心脏中坏死心肌的主要方法。越来越多的证据表明，成年心脏中存在内源性心脏干细胞（CSCs），并具有内分泌和/或旁分泌作用，参与心脏再生过程。然而，CSCs的分离及其鉴定和向心肌细胞（尤其是心肌细胞）的分化仍面临技术挑战。在本研究中，我们提供了一种从成年小鼠心脏中分离、鉴定及诱导CSCs分化的简便方法。本文描述了一种利用密度梯度法分离CSCs的技术，其中心脏组织通过0.2% II型胶原酶溶液进行消化。为鉴定所分离的CSCs，我们检测了CSCs/心脏标志物Sca-1、NKX2-5和GATA4，以及多能性/干性标志物OCT4、SOX2和Nanog的表达情况。我们还将分离得到的CSCs在培养皿中进行培养，并检测增殖标志物Ki-67的表达，以评估其增殖潜能。为评估CSCs的分化潜能，我们选取培养7至10天的CSCs，将其转移至含有心肌细胞分化培养基的新培养板中，在细胞培养箱中孵育12天，期间每3天更换一次分化培养基。分化后的CSCs表达心肌细胞特异性标志物：肌动蛋白结合蛋白（actinin）和肌钙蛋白I（troponin I）。因此，采用本方案分离的CSCs具有干性及心脏特异性标志物，并具备向心肌细胞谱系增殖和分化的潜能。
引言
缺血性心脏病，包括心肌梗死（MI），是全球主要的死亡原因之一1。利用干细胞治疗来再生坏死的心肌仍是改善MI心脏功能的主要策略2,3,4,5。已有多种类型的干细胞被用于补充坏死的心肌组织并改善MI心脏的功能，大致可分为胚胎干细胞6和成体干细胞。在成体干细胞中，已应用的类型包括骨髓来源的单个核细胞7,8、骨髓来源的间充质干细胞9,10、脂肪组织来源的间充质干细胞11,12、脐带来源的间充质干细胞13以及心脏干细胞（CSCs）14,15。干细胞可通过内分泌和/或旁分泌作用促进心脏....
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方案
小鼠的饲养、麻醉和处死均按照内布拉斯加医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 材料
- 使用机构动物实验中心自繁的10至12周龄C57BL/6J黑色雄性小鼠，用于分离心脏干细胞（CSCs）。CSCs也可从非妊娠雌性小鼠中分离。
- 在小鼠安乐死后前，通过高压灭菌法对所有必要的手术器械进行灭菌，包括手术剪、精细手术剪、弯柄镊子和手术刀片。
- 在无菌条件下配制CSC分离缓冲液，并将其置于冰上4 °C保存。这些缓冲液包括密度调整为1.077 g/mL的聚蔗糖与碘海醇钠溶液、不完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium）、1x汉克平衡盐溶液（HBSS）以及细胞培养级1x磷酸盐缓冲液（PBS）。配制1%胶原酶II储备液（过滤除菌），并在HBSS中稀释为0.2%工作液。
- 将组织培养所需材料置于生物安全柜内的无菌环境中，包括10 mm培养皿、6孔板、24孔板、T-25和T-75培养瓶、15 mL和50 mL锥形离心管，以及带有40 µm和100 µm细胞筛网和0.22 µm滤器的一次性移液管。
- 通过高压灭菌法对10 µL、200 µL和1,000 µL的移液器吸头进行灭菌。
- 实验全程佩戴无粉腈类手套，并使用70%乙醇维持无菌环境。
- 使用10%次氯酸钠溶液作为消毒剂。
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结果
在本研究中，我们从10至12周龄的C57BL/6J雄性小鼠心脏中分离出心脏干细胞（CSCs）。本文介绍了一种利用多能性标志物对CSCs进行分离与鉴定的简便方法。同时，我们还展示了一种优雅的方法用于诱导CSCs向心肌细胞谱系分化，并对分化后的CSCs进行表征。在相差显微镜下观察培养2至3天的CSCs，可见其呈纺锤形形态（图1A 和 1B）。在维持培养基中培养7天后，CSCs的形态发生变化，细胞变得细长（图1C）。我们对CSCs的多能性标志物进行了鉴定，发现其表达OCT4、SOX2和Nanog（图2A - 2C）。此外，我们发现CSCs在培养基中能够增殖，并表达增殖标志物Ki-67（图2D）。为鉴定CSCs的心脏来源特性，我们检测了其心脏标志物Sca-1、NKX2-5和GA.......
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讨论
该心脏干细胞（CSC）分离方案的关键步骤如下：1）从小鼠体内取出心脏时必须保持无菌条件，心脏提取过程中的任何污染都可能影响CSC的质量。2）在切碎心脏组织前必须彻底清除血液，可通过多次使用HBSS溶液洗涤完整心脏及心脏组织块来实现。3）心脏组织块必须使用胶原酶溶液完全消化，形成单细胞悬液。4）用于细胞分离的聚蔗糖和泛影酸钠梯度溶液必须预先温育。5）CSC培养所用的培养基必须预先温育。6）将CSC接种至培养皿时，细胞汇合度应较高，因为在低汇合度条件下，CSC可能发生形态改变。7）应在从心脏组织中分离出CSC后、接种至培养皿前对CSC数量进行计数。CSC的数量反映了从心脏组织中分离细胞的效率，准确计数对后续在培养板中接种CSC至关重要。
我们采用成年小鼠分离心脏干细胞（CSCs），该方法已被其他研究者在啮齿类动物模型中使用23,28。CSCs 可从新生啮齿类动物心脏29,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为HL-113281和HL116205，授予Paras Kumar Mishra。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 小鼠 | 美国杰克逊实验室 | 货号：000664 | |
| 抗体： | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976（兔多克隆） | OCT4-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| SOX2 | Abcam | ab97959（兔多克隆） | SOX2-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| Nanog | Abcam | ab80892（兔多克隆） | Nanog-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| Ki67 | Abcam | ab16667（兔多克隆） | Ki67-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| Sca I | Millipore | AB4336（兔多克隆） | Sca I 一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697（山羊多克隆） | NKX2-5-一抗-1:50 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| GATA4 | Abcam | ab84593（兔多克隆） | GATA4-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268（山羊多克隆） | MEF2C-一抗-1:50 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| 肌钙蛋白 I | Millipore | MAB1691（小鼠单克隆） | 肌钙蛋白 I-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| 肌动蛋白结合蛋白 | Millipore | MAB1682（小鼠单克隆） | 肌动蛋白结合蛋白-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| ANP | Millipore | AB5490（小鼠多克隆） | ANP-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中 |
| Alex Fluor-488 鸡抗兔 | Life technology | 货号：A21441 | |
| Alex Fluor-594 山羊抗兔 | Life technology | 货号：A11012 | |
| Alex Fluor-594 兔抗山羊 | Life technology | 货号：A11078 | |
| Alex Fluor-488 鸡抗小鼠 | Life technology | 货号：A21200 | |
| Alex Fluor-594 鸡抗山羊 | Life technology | 货号：A21468 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 培养基： | |||
| CSC 维持培养基 | Millipore | SCM101 | 注：用于 CSC 培养时，使用 PBS 或不完全 DMEM 培养基洗涤细胞 |
| 心肌细胞分化培养基 | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 细胞分离缓冲液： | |||
| 聚蔗糖与碘海醇溶液（Histopaque1077） | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| 胶原酶 I | Sigma | C0130 | |
| Dispase 溶液 | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Thermoscientific | A1110501 | |
| 其他试剂： | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| 正常鸡血清 | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI 溶液 | Applichem | A100,0010 | DAPI，工作浓度为 1 µg/mL |
| 台盼蓝 | Biorad | 145-0013 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| 甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 吐温-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| 吐温 20 | Fisher Sceintific | 批号：160170 | |
| 乙醇 | Thermo Scientific | ||
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 组织培养材料： | |||
| 100 mm 培养皿 | Thermo Scientific | ||
| 6 孔板 | Thermo Scientific | ||
| 24 孔板 | Thermo Scientific | ||
| T-25 培养瓶 | Thermo Scientific | ||
| T-75 培养瓶 | Thermo Scientific | ||
| 15 ml 锥形管 | Thermo Scientific | ||
| 50 mL 锥形管 | Thermo Scientific | ||
| 40 µm 细胞筛 | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm 细胞筛 | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm 滤器 | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL 注射器 | BD | 货号：309604 | |
| 10 µL、200 µL、1000 µL 移液枪头 | Fisher Scientific | ||
| 5 mL、10 mL、25 mL 一次性塑料移液管 | Thermo Scientific | ||
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 仪器 | |||
| 离心机 | Thermo Scientific | LEGEND X1R 离心机 | |
| EVOS 显微镜 | Life technology | ||
| 自动细胞计数仪 | Biorad | ||
| 细胞计数板 | Biorad | 145-0011 | |
| 移液器辅助器 | Thermo Scientific | S1 移液器辅助器 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 手术器械： | |||
| 手术剪刀 | Fine Scientific Tool | ||
| 精细手术剪刀 | Fine Scientific Tool | ||
| 弯柄镊 | Fine Scientific Tool | ||
| 手术刀片 | Fine Scientific Tool |
参考文献
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. A....
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