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方法文章

从小鼠成年心脏中分离、鉴定及分化心脏干细胞

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DOI：

10.3791/58448

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2019年1月7日

 , 
1Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Anesthesiology, University of Nebraska Medical Center

本文内容

摘要

本文的总体目标是规范从小鼠成年心脏中分离、鉴定和分化心脏干细胞（CSCs）的实验方案。本文介绍了一种利用密度梯度离心法分离小鼠心脏干细胞的方法，并详细阐述了心脏干细胞的培养、增殖以及向心肌细胞分化的具体方法。

摘要

心肌梗死（MI）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。再生医学的一个主要目标是在心肌梗死后补充已坏死的心肌组织。尽管已有多种策略被用于心肌再生，干细胞治疗仍是补充心肌梗死心脏中坏死心肌的主要方法。越来越多的证据表明，成年心脏中存在内源性心脏干细胞（CSCs），并具有内分泌和/或旁分泌作用，参与心脏再生过程。然而，CSCs的分离及其鉴定和向心肌细胞（尤其是心肌细胞）的分化仍面临技术挑战。在本研究中，我们提供了一种从成年小鼠心脏中分离、鉴定及诱导CSCs分化的简便方法。本文描述了一种利用密度梯度法分离CSCs的技术，其中心脏组织通过0.2% II型胶原酶溶液进行消化。为鉴定所分离的CSCs，我们检测了CSCs/心脏标志物Sca-1、NKX2-5和GATA4，以及多能性/干性标志物OCT4、SOX2和Nanog的表达情况。我们还将分离得到的CSCs在培养皿中进行培养，并检测增殖标志物Ki-67的表达，以评估其增殖潜能。为评估CSCs的分化潜能，我们选取培养7至10天的CSCs，将其转移至含有心肌细胞分化培养基的新培养板中，在细胞培养箱中孵育12天，期间每3天更换一次分化培养基。分化后的CSCs表达心肌细胞特异性标志物：肌动蛋白结合蛋白（actinin）和肌钙蛋白I（troponin I）。因此，采用本方案分离的CSCs具有干性及心脏特异性标志物，并具备向心肌细胞谱系增殖和分化的潜能。

引言

缺血性心脏病，包括心肌梗死（MI），是全球主要的死亡原因之一1。利用干细胞治疗来再生坏死的心肌仍是改善MI心脏功能的主要策略2,3,4,5。已有多种类型的干细胞被用于补充坏死的心肌组织并改善MI心脏的功能，大致可分为胚胎干细胞6和成体干细胞。在成体干细胞中，已应用的类型包括骨髓来源的单个核细胞7,8、骨髓来源的间充质干细胞9,10、脂肪组织来源的间充质干细胞11,12、脐带来源的间充质干细胞13以及心脏干细胞（CSCs）14,15。干细胞可通过内分泌和/或旁分泌作用促进心脏再生16,17,18,19,20。然而，干细胞治疗的一个主要局限在于获得足够数量的、能够增殖和/或向特定心肌谱系分化的干细胞21,22。自体和异体干细胞移植在干细胞治疗中仍面临重要挑战9。由于心脏干细胞来源于心脏本身，相较于非心脏来源的干细胞更易于向心肌谱系分化，因此可能成为更优的心脏再生策略。此外，使用心脏干细胞可降低畸胎瘤发生的风险。同时，心脏干细胞的内分泌和旁分泌效应（如其释放的外泌体和miRNA）可能比其他类型干细胞更为有效。因此，心脏干细胞仍是心脏再生治疗的更优选择23,24。

尽管由于心脏来源的原因，心脏干细胞（CSCs）在心肌梗死（MI）心脏中进行心脏再生更具优势，但其主要局限性在于缺乏高效的分离方法，导致产量较低。另一个局限性可能是CSCs向心肌细胞谱系分化的能力受损2,25,26,27。为了克服这些局限性，建立一种高效的心脏干细胞分离、鉴定及向心脏谱系分化的实验方案至关重要。目前尚无单一被广泛接受的心脏干细胞标志物，基于特定细胞表面标志物的分离方法所获得的CSCs数量较少。本文中，我们标准化了一种简单且经济有效的梯度离心方法，用于从小鼠心脏中分离CSCs，该方法可显著提高CSCs的得率。所分离的CSCs可通过荧光激活细胞分选技术，依据特定的细胞表面标志物进行进一步筛选。此外，我们还提供了CSCs的培养、鉴定以及向心肌细胞谱系分化的完整实验流程。因此，本文展示了一种优雅且系统的方法，用于从成年小鼠心脏中分离、鉴定、培养并诱导CSCs向心肌细胞谱系分化（图5）。

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方案

小鼠的饲养、麻醉和处死均按照内布拉斯加医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 材料

  1. 使用机构动物实验中心自繁的10至12周龄C57BL/6J黑色雄性小鼠，用于分离心脏干细胞（CSCs）。CSCs也可从非妊娠雌性小鼠中分离。
  2. 在小鼠安乐死后前，通过高压灭菌法对所有必要的手术器械进行灭菌，包括手术剪、精细手术剪、弯柄镊子和手术刀片。
  3. 在无菌条件下配制CSC分离缓冲液，并将其置于冰上4 °C保存。这些缓冲液包括密度调整为1.077 g/mL的聚蔗糖与碘海醇钠溶液、不完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium）、1x汉克平衡盐溶液（HBSS）以及细胞培养级1x磷酸盐缓冲液（PBS）。配制1%胶原酶II储备液（过滤除菌），并在HBSS中稀释为0.2%工作液。
  4. 将组织培养所需材料置于生物安全柜内的无菌环境中，包括10 mm培养皿、6孔板、24孔板、T-25和T-75培养瓶、15 mL和50 mL锥形离心管，以及带有40 µm和100 µm细胞筛网和0.22 µm滤器的一次性移液管。
  5. 通过高压灭菌法对10 µL、200 µL和1,000 µL的移液器吸头进行灭菌。
  6. 实验全程佩戴无粉腈类手套，并使用70%乙醇维持无菌环境。
  7. 使用10%次氯酸钠溶液作为消毒剂。
  8. 分别使用市售的心脏干细胞维持培养基和心肌细胞分化培养基进行CSC的培养与分化。

2. 心脏干细胞的分离方法

  1. 使用 CO2 室处死四至五只成年雄性（或未怀孕雌性）小鼠。用针或胶带将每只小鼠的前肢固定在独立的解剖纸板上。
  2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠体表以去除外部微生物，并在心脏采集过程中维持无菌条件。用剪刀在腹部中央做切口，沿直线从腹部向上剪开皮肤至胸腔。将中线切口两侧的皮肤掀开，清除腹部区域的皮肤和毛发。使用剪刀和镊子剪开肋骨下方的膈肌。
  3. 在生物安全柜内剪开肋骨以打开小鼠胸腔。暴露心脏并清除心脏周围的血液。用冰浴 PBS 冲洗心脏周围区域，以去除心脏附近的任何残留血液。
  4. 使用手术剪刀和镊子分离心脏。将心脏置于含有 10 mL 冰浴 PBS 的 100 mm 培养皿中。
  5. 用弯柄镊轻轻挤压心脏，以去除心脏内部的残余血液。
  6. 使用完整心脏进行心脏干细胞（CSCs）的分离。
  7. 将全部四至五只完整心脏转移至含有 10 mL 冰浴 HBSS 的 50 mL 锥形管中。将管子置于冰上，待后续处理。
  8. 用 70% 乙醇擦拭生物安全柜的内部和外部，以建立无菌环境。用 70% 乙醇对含心脏的管子及其他所需材料进行消毒。将含心脏的管子放入生物安全柜中，准备后续操作。
  9. 将心脏转移至含有 10 mL 冰浴 HBSS 的 100 mm 培养皿中。通过挤压心脏再次清洗，以去除心脏内部的任何残余血液。每次清洗后更换 HBSS 溶液，确保血液被完全清除。
  10. 在含有 5–7 mL HBSS 溶液的 100 mm 培养皿中，使用精细手术剪刀或手术刀片将心脏切成小块。用一对镊子夹住每只心脏，使用精细手术剪刀或手术刀片将其切成 2–4 mm 的小片。频繁更换 HBSS 溶液，以确保使用无血的 HBSS。在 HBSS 溶液中将心脏组织切碎。
  11. 将切碎的组织在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留沉淀。
  12. 将沉淀重悬于 5–6 mL 含 0.2% 胶原酶 II 的溶液中，置于 50 mL 锥形管内。胶原酶溶液的体积应约为沉淀体积的 1.5 至 2 倍。
    注意：用于组织消化时，0.2% 胶原酶 I 和 2.5 U/mL 分散酶溶液可替代 0.2% 胶原酶 II。分散酶溶液的体积应与胶原酶 I 溶液体积大致相等。
  13. 通过振荡管子或在 37 °C 条件下以 75 x g 在摇床上摇动 45–60 分钟，使沉淀与 0.2% 胶原酶 II 溶液充分混合。每隔 20–30 分钟用手剧烈振荡管子，以增强组织裂解效果。
  14. 使用 5 mL 血清移液管和 1 mL 移液枪头反复吹打裂解后的组织混合物，将组织团块解离为单细胞悬液。
    注意：为最大程度回收心脏干细胞（CSCs），吹打裂解混合物至少 5 分钟。若组织团块相对较大，可用剪刀或手术刀片剪去 1 mL 移液枪头的尖端，再用于吹打。
  15. 加入市售的心脏干细胞维持培养基，以终止组织的酶消化过程。加入的维持培养基体积约为步骤 2.14 中裂解组织体积的 2–3 倍。
  16. 将消化后的细胞悬液通过 100 µm 细胞滤网，以去除未消化的组织碎片。
  17. 使用 40 µm 细胞滤网重复步骤 2.16。
  18. 通过密度梯度离心分离细胞。分离细胞时，将等体积的滤液小心地叠加在多聚蔗糖和泛影酸钠溶液上。例如，先在 50 mL 锥形管中加入 20 mL 多聚蔗糖和泛影酸钠溶液，然后将步骤 2.17 得到的 20 mL 滤液小心地加在多聚蔗糖和泛影酸钠溶液之上。
    注意：使用前将多聚蔗糖和泛影酸钠溶液在 37 °C 预热。将步骤 2.17 的滤液非常小心且缓慢地加在多聚蔗糖和泛影酸钠溶液上，避免两种溶液混合。此步骤至关重要。
  19. 将含有两种溶液的管子置于水平转子离心机中，在室温下以 500 x g 离心 20 分钟。设置较低的加速度和减速度，以避免溶液混合并确保心脏干细胞（CSCs）的正确分离。这是心脏干细胞分离中的关键步骤。将含梯度混合液的管子缓慢、平稳地放入离心机中，并开始离心。
  20. 使用 1 mL 移液枪或塑料巴氏移液管，从上层液体中取出白膜层及其上方的额外液体，转移至 15 mL 无菌管中。该白膜层将含有心脏干细胞（CSCs）。
    注意：吸取白膜层时需格外小心，避免吸取到下方的多聚蔗糖和泛影酸钠溶液层，因其对心脏干细胞具有毒性。
  21. 向步骤 2.20 得到的细胞悬液中加入等体积的心脏干细胞维持培养基，并充分混匀，以中和可能残留的多聚蔗糖和泛影酸钠溶液。
  22. 将上述细胞悬液在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。
  23. 将沉淀重悬于 7–10 mL 不完全 DMEM 培养基中，并在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟，以去除任何残留的多聚蔗糖和泛影酸钠溶液。
  24. 收集含有纯化心脏干细胞（CSCs）的沉淀。
  25. 将沉淀重悬于 1 mL 心脏干细胞维持培养基中，计数心脏干细胞数量，并用于后续培养。计数时使用台盼蓝染色和血细胞计数板。使用四只雄性小鼠心脏，心脏干细胞的产量约为 180 万个。
  26. 将心脏干细胞接种于涂有含 0.5% 纤连蛋白的 0.02% 明胶溶液的 6 孔培养板中。每孔加入 2 mL 完全维持培养基。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。
  27. 在第三天之前，每天更换一次培养的心脏干细胞培养基。此后，每隔一天更换一次培养基。
  28. 通过显微镜观察确定心脏干细胞的生长情况。

3. 心脏干细胞的培养维持与传代

  1. 将分离的CSCs在市售的维持培养基中进行培养。每隔一天用新鲜的维持培养基更换培养液。当CSCs培养至汇合状态时，按照步骤2.26所述，将CSCs转移至经明胶和纤连蛋白包被的新培养板中。使用酶法细胞解离缓冲液解离培养的CSCs，并遵循标准的细胞从培养板上解离的操作流程。此阶段的CSCs被视为第0代（P0）细胞。
  2. 将P0代CSCs接种于新的经明胶和纤连蛋白包被的培养板中，在37 °C、5% CO2的培养箱中，使用完全CSC维持培养基进行培养，待其生长至汇合后，按照步骤3.1操作获得第1代（P1）CSCs。将P1代CSCs储存于液氮中或用于后续实验。
  3. 在6孔板中接种50万个细胞，或在T-25培养瓶中接种100万个细胞，以维持CSCs培养的初始状态。
  4. 当CSCs达到85%–90%汇合时进行传代。CSCs可在维持培养基中连续培养四至六周。
    注意：CSCs的初始接种密度应保持相对较高（40%–50%），因为在较低接种密度下，CSCs的形态可能变为扁平且拉长。

4. 心脏干细胞的表征

  1. 为表征培养的心脏干细胞（CSCs），需在相差显微镜或明场显微镜下进行观察。将含有CSCs的培养板置于荧光显微镜的物镜下，先将放大倍数设为较低倍率（10X）以聚焦细胞，使用相差光阑观察细胞。随后更换物镜，将放大倍数提高至20X，对CSCs进行成像；再将物镜倍数提高至40X，再次对CSCs进行成像。培养两天后，CSCs呈近乎圆形，但细胞体积随时间逐渐增大，至第七天时，CSCs呈近乎圆柱形（图 1A - 1C）。
  2. 使用多能性/干性标志物（OCT4、SOX2或Nanog）、增殖标志物（Ki-67）（图 2A - 2D）以及心脏来源/前体细胞标志物（Sca-1、NKX2-5或GATA4）（图 3A - 3C）对CSCs进行免疫染色。
    1. 进行CSCs免疫染色时，将10,000个CSCs接种于24孔培养板中。
    2. 次日（培养18–24小时后），用300 µL的4%多聚甲醛固定CSCs，固定10分钟。
    3. 用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。
    4. 用300 µL含0.2% Triton X-100的PBS溶液对CSCs进行通透处理，持续10分钟。
    5. 用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。
    6. 使用300 µL含1% BSA的PBST溶液（PBS + 0.1% Tween 20）或300 µL含10%正常鸡血清的PBST溶液，在室温下封闭CSCs 1小时。
    7. 将CSCs与200 µL用封闭液稀释的一抗在4 °C下孵育过夜。一抗稀释比例应依据抗体说明书推荐或已建立的标准方法进行。
    8. 用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。
    9. 将CSCs与200 µL用封闭液（见步骤4.2.6）稀释的二抗在室温下孵育1小时。二抗稀释比例应依据抗体说明书推荐或已建立的标准方法进行。
    10. 用500 µL预冷的PBS洗涤CSCs，每次间隔5分钟，共洗涤3次。
    11. 用200 µL含DAPI（1 µg/mL）的PBS溶液对CSCs进行复染，孵育5分钟。
    12. 用500 µL预冷的PBS洗涤1次，然后每孔加入300 µL预冷的PBS。
    13. 使用荧光显微镜进行成像。遵循荧光成像操作说明，例如避免强光直射培养板。将培养板置于显微镜下，调节不同放大倍数对细胞进行聚焦，通过相差显微镜和/或不同激发滤光片观察细胞，并保存图像。
    14. 将培养板置于4 °C避光保存。

5. 心脏干细胞向心肌细胞的分化

  1. 进行CSCs的分化时，将500,000个CSCs接种于6孔板中，加入2 mL预热（37 °C）的市售CSC维持培养基。
  2. 将含有CSCs的培养板置于37 °C的CO2培养箱中孵育。让CSCs贴壁并增殖至亚汇合状态。若培养基变黄，需更换为新鲜的维持培养基。
  3. 当细胞融合度达到85%–90%时，弃去维持培养基，加入2 mL预热（37 °C）的心肌细胞分化培养基。将培养板置于37 °C的CO2培养箱中孵育，持续2–3周。
  4. 每2–3天更换一次分化培养基。每次换液时在显微镜下观察CSCs的形态，以确保良好的培养状态。
  5. 在分化培养基中培养CSCs 12天后，按照标准免疫染色方案检测分化标志物（见步骤4.2.1–4.2.14）。保存荧光图像以显示心肌细胞标志物的表达（图 4A–4B）。

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结果

在本研究中，我们从10至12周龄的C57BL/6J雄性小鼠心脏中分离出心脏干细胞（CSCs）。本文介绍了一种利用多能性标志物对CSCs进行分离与鉴定的简便方法。同时，我们还展示了一种优雅的方法用于诱导CSCs向心肌细胞谱系分化，并对分化后的CSCs进行表征。在相差显微镜下观察培养2至3天的CSCs，可见其呈纺锤形形态（图1A 和 1B）。在维持培养基中培养7天后，CSCs的形态发生变化，细胞变得细长（图1C）。我们对CSCs的多能性标志物进行了鉴定，发现其表达OCT4、SOX2和Nanog（图2A - 2C）。此外，我们发现CSCs在培养基中能够增殖，并表达增殖标志物Ki-67（图2D）。为鉴定CSCs的心脏来源特性，我们检测了其心脏标志物Sca-1、NKX2-5和GA...

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讨论

该心脏干细胞（CSC）分离方案的关键步骤如下：1）从小鼠体内取出心脏时必须保持无菌条件，心脏提取过程中的任何污染都可能影响CSC的质量。2）在切碎心脏组织前必须彻底清除血液，可通过多次使用HBSS溶液洗涤完整心脏及心脏组织块来实现。3）心脏组织块必须使用胶原酶溶液完全消化，形成单细胞悬液。4）用于细胞分离的聚蔗糖和泛影酸钠梯度溶液必须预先温育。5）CSC培养所用的培养基必须预先温育。6）将CSC接种至培养皿时，细胞汇合度应较高，因为在低汇合度条件下，CSC可能发生形态改变。7）应在从心脏组织中分离出CSC后、接种至培养皿前对CSC数量进行计数。CSC的数量反映了从心脏组织中分离细胞的效率，准确计数对后续在培养板中接种CSC至关重要。

我们采用成年小鼠分离心脏干细胞（CSCs），该方法已被其他研究者在啮齿类动物模型中使用23,28。CSCs 可从新生啮齿类动物心脏29,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为HL-113281和HL116205，授予Paras Kumar Mishra。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠美国杰克逊实验室货号：000664
抗体：
OCT4-Abcamab18976（兔多克隆）OCT4-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
SOX2Abcamab97959（兔多克隆）SOX2-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
NanogAbcamab80892（兔多克隆）Nanog-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
Ki67Abcamab16667（兔多克隆）Ki67-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
Sca IMilliporeAB4336（兔多克隆）Sca I 一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
NKX2-5Santa Cruzsc-8697（山羊多克隆）NKX2-5-一抗-1:50 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
GATA4Abcamab84593（兔多克隆）GATA4-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
MEF2CSanta Cruzsc-13268（山羊多克隆）MEF2C-一抗-1:50 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
肌钙蛋白 IMilliporeMAB1691（小鼠单克隆）肌钙蛋白 I-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
肌动蛋白结合蛋白MilliporeMAB1682（小鼠单克隆）肌动蛋白结合蛋白-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
ANPMilliporeAB5490（小鼠多克隆）ANP-一抗-1:100 稀释，二抗-1:200 稀释，溶于封闭液中
Alex Fluor-488 鸡抗兔Life technology货号：A21441
Alex Fluor-594 山羊抗兔Life technology货号：A11012
Alex Fluor-594 兔抗山羊Life technology货号：A11078
Alex Fluor-488 鸡抗小鼠Life technology货号：A21200
Alex Fluor-594 鸡抗山羊Life technology货号：A21468
名称公司货号备注
培养基：
CSC 维持培养基MilliporeSCM101注：用于 CSC 培养时，使用 PBS 或不完全 DMEM 培养基洗涤细胞
心肌细胞分化培养基MilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
名称公司货号备注
细胞分离缓冲液：
聚蔗糖与碘海醇溶液（Histopaque1077）Sigma10771
HBSSGibco2018-03
胶原酶 ISigmaC0130
Dispase 溶液STEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase 细胞解离试剂ThermoscientificA1110501
其他试剂：
BSASigmaA7030
正常鸡血清Vector laboratoryS3000
DAPI 溶液ApplichemA100,0010DAPI，工作浓度为 1 µg/mL
台盼蓝Biorad145-0013
胰蛋白酶SigmaT4049
StemPro Accutase 细胞解离试剂Thermo Fisher ScientificA1110501
甲醛Sigma158127
吐温-100ACROSCas No. 900-293-1
吐温 20Fisher Sceintific批号：160170
乙醇Thermo Scientific
名称公司货号备注
组织培养材料：
100 mm 培养皿Thermo Scientific
6 孔板Thermo Scientific
24 孔板Thermo Scientific
T-25 培养瓶Thermo Scientific
T-75 培养瓶Thermo Scientific
15 ml 锥形管Thermo Scientific
50 mL 锥形管Thermo Scientific
40 µm 细胞筛Fisher Scientific22363547
100 µm 细胞筛Fisher Scientific22363549
0.22 µm 滤器Fisher Scientific09-719C
10 mL 注射器BD货号：309604
10 µL、200 µL、1000 µL 移液枪头Fisher Scientific
5 mL、10 mL、25 mL 一次性塑料移液管Thermo Scientific
名称公司货号备注
仪器
离心机Thermo ScientificLEGEND X1R 离心机
EVOS 显微镜Life technology
自动细胞计数仪Biorad
细胞计数板Biorad145-0011
移液器辅助器Thermo ScientificS1 移液器辅助器
名称公司货号备注
手术器械：
手术剪刀Fine Scientific Tool
精细手术剪刀Fine Scientific Tool
弯柄镊Fine Scientific Tool
手术刀片Fine Scientific Tool

参考文献

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