用于高通量检测低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

摘要

本文介绍了一种用于高通量筛选细胞外蛋白微阵列以鉴定新型受体-配体相互作用的实验方案。同时，我们还描述了一种通过使用蛋白-微珠复合物来增强瞬时蛋白质-蛋白质相互作用检测的方法。

摘要

分泌因子、膜锚定受体及其相互作用伙伴是稳态和疾病过程中细胞间通讯及信号级联启动的主要调控分子，因此也是重要的治疗靶点。尽管如此，这些相互作用网络在当前数据库中的收录仍严重不足，导致大多数细胞外蛋白尚无已记录的结合伴侣。这一差距主要源于研究细胞外蛋白所面临的挑战，包括功能性蛋白的表达困难，以及细胞表面受体之间常形成的微弱且低亲和力的蛋白相互作用。本方法旨在描述以微阵列形式打印细胞外蛋白文库，用于蛋白-蛋白相互作用的筛选。为实现对弱相互作用的检测，本文介绍了一种基于待研究查询蛋白多聚化的方法。结合基于微珠的多价增强策略，该蛋白微阵列可实现高通量条件下瞬时蛋白-蛋白相互作用的稳健检测。该方法提供了一种快速、低样本消耗的技术路径，适用于任何细胞外蛋白的新相互作用鉴定。文中详细描述了蛋白微阵列的打印与筛选流程。该技术将为致力于在细胞外空间发现蛋白相互作用的科研人员提供一种可靠的实验手段。

引言

本文综述的方法描述了以微阵列形式打印一系列细胞外蛋白，并进一步介绍针对该文库筛选目标蛋白的方法。我们已确定蛋白多聚化是检测低结合亲和力相互作用的关键步骤。为了增强对这类相互作用的检测，本文描述了一种利用微珠对目标查询蛋白进行多聚化的实验方案。

分泌型蛋白和细胞表面表达蛋白（统称为细胞外蛋白）及其相互作用伙伴是细胞间通讯、信号传导以及与微环境相互作用的关键调控因子，因此在调控多种生理和病理过程中具有重要作用。人类基因组中约有四分之一的基因≈5,000 种蛋白质）编码细胞外蛋白质，鉴于其重要性及对系统性给药药物的可及性，这些蛋白质是药物开发的关键靶点¹因此，细胞外蛋白代表了市场上已批准药物中具有已知药理作用的蛋白质靶点的70%以上，这些靶点被称为 "可成药蛋白质组"尽管细胞外蛋白质具有重要性和丰富性，但现有的数据库中细胞外蛋白质相互作用（ePPI）网络仍显著缺乏代表性。这主要归因于细胞外蛋白质复杂的生化特性，使得大多数现有技术难以对其进行表征。²首先，膜蛋白难以溶解，该过程通常需要使用剧烈的洗涤条件和去垢剂；其次，当这些蛋白在常用的异源表达系统中表达时，往往缺乏重要的翻译后修饰，例如糖基化；最后，受体之间的相互作用（如免疫细胞上共表达的共受体）通常是瞬时的，并具有极低的亲和力（K_D 在约1 μM 至 >100 _....

方案

1. 胞外人类蛋白质文库的构建

1. 列出感兴趣的细胞表面受体或分泌蛋白，以构建蛋白质微阵列文库。可针对特定的蛋白家族（例如免疫球蛋白超家族）或在特定细胞类型中选择性表达的蛋白进行研究。
2. 对于细胞表面受体，使用软件工具识别信号肽和跨膜区，从而确定胞外域（ECD）的边界。一些相关的在线免费工具见于材料表^15,16,17,18。
3. 合成目标基因的ECD并克隆至相应载体中。将分泌蛋白或STM受体的ECD与多种常见的亲和标签融合后，可通过转染适当载体的细胞条件培养基，或通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行纯化。
   注意：建议使用哺乳动物细胞表达系统（如HEK/293或CHO细胞），以最大程度确保蛋白正确折叠以及添加相关翻译后修饰（如糖基化）。
4. 采用标准的亲和纯化方法纯化蛋白。已有研究描述了适用于纯化数百种蛋白的自动化或半自动化流程，可据此扩增以获得所需的目标蛋白集合^9,19,20

结果

细胞外蛋白微阵列技术的工作流程示意图如图1所示。一旦获得包含细胞外蛋白文库的微阵列芯片，对目标蛋白的筛选及数据分析可在一天内完成。许多在生理条件下相关的跨膜受体之间的相互作用具有非常弱的结合强度（K_D 处于微摩尔范围）。为了提高此类相互作用的检测灵敏度，已开发出一种基于查询蛋白（以Fc融合形式表达）在蛋白A-微珠上发生多聚化的方法。本文描述了该实验方案，并在图2中展示了该方法在增强蛋白质相互作用（PPI）检测性能方面的代表性结果。

蛋白质微阵列筛选的一个代表性示例如下所示 图3在所示示例中，一种孤儿人腺病毒免疫调节蛋白被用于筛选其与包含1,500多种受体胞外域或分泌蛋白的文库之间的相互作用¹⁴如所述，病毒蛋.......

讨论

人类基因组中仍存在大量孤儿受体，同时针对此前已知配体的胞外蛋白，新的相互作用伙伴仍在不断被发现。明确人类及模式生物中的受体-配体相互作用，对于理解稳态过程中细胞通讯的调控机制，以及疾病发生过程中的功能失调至关重要，从而为开发新的或改进的治疗策略提供依据。然而，目前广泛应用的技术在检测胞外蛋白相互作用方面仍面临显著障碍，主要源于细胞受体及其相互作用分子在生物化学特性上的技术挑战。本报告中，我们描述了一种利用胞外蛋白微阵列筛选目标查询蛋白的方法，重点介绍了利用微珠复合物以增强蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）检测的策略。

研究受体-受体相互作用具有较大挑战性，因为许多在生理上具有重要意义的受体对之间的相互作用非常微弱，其结合亲和力通常处于微摩尔（µM）范围^2,3。通过多聚化增强亲和力已被证明是提高低亲和力蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）检测灵敏度的有效策略。我们开发了一种基于Fc融合蛋白的方法，可高效形成多价微珠-蛋白探针复合物⁴

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超纯MB级甘油	USB Corporation	56-81-5	蛋白质储存
SeptoMark封闭缓冲液	Zeptosens	BB1, 90-40	微阵列玻片封闭
牛血清白蛋白	Roche	03-117-957-001	用于掩模适配的玻片对照（可选）
聚丙烯多孔板	Greiner Bio One	82050-678	蛋白质储存
聚丙烯多孔板	Arrayit	MMP384	玻片点样
NanoPrint LM60或类似接触式微阵列点样仪	Arrayit	NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer	玻片点样
微点样针	Arrayit	Micro spotting pins	玻片点样
ZeptoFOG封闭工作站	Zeptosens	ZeptoFOG blocking station, 1210	点样后封闭玻片
脱脂奶粉	Thermo Fisher	LP0031	封闭溶液
环氧硅烷涂层玻片	Nextrion Slide E	1064016	微阵列玻片
玻璃片架和玻片架套装	Wheaton	900303	玻片储存
Cy5单反应性染料	GE Healthcare	PA23031	白蛋白标记
Cy5单反应性染料	GE Healthcare	PA25001	人IgG标记
Pro-spin脱盐柱	Princeton Separations	CS-800	去除游离染料
粘性铝箔封膜	AlumaSeal	F-384-100	密封储备板
聚丙烯低温冻存管	Corning	430658	蛋白质文库储存主管
Protein A磁珠	Miltenyi	120-000-396	查询蛋白质多聚化
人IgG	Jackson Immunoresearch	009-000-003	无关IgG标记
Protein A	Sigma	P7837	微阵列玻片封闭
杂交工作站，a-Hyb或类似设备	Miltenyi	Hybridization station, a-Hyb or similar	自动化微阵列处理（可选）
GenePix 4000B扫描仪或类似设备	Molecular Devices	GenePix 4000B scanner or similar	玻片扫描
GenePix Pro或等效数据提取软件	Molecular Devices	GenePix Pro or equivalent data extraction software	数据处理
Signal P4.1	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	在线软件	用于预测信号肽切割位点存在及位置的工具
TMHMM 2.0服务器	DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark	在线软件	预测蛋白质中的跨膜螺旋
Phobius	斯德哥尔摩生物信息学中心	在线软件	联合预测跨膜拓扑结构和信号肽
TOPCONS	斯德哥尔摩大学	在线软件	预测膜蛋白拓扑结构和信号肽