本文介绍了一种用于高通量筛选细胞外蛋白微阵列以鉴定新型受体-配体相互作用的实验方案。同时，我们还描述了一种通过使用蛋白-微珠复合物来增强瞬时蛋白质-蛋白质相互作用检测的方法。
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本文内容
摘要
摘要
分泌因子、膜锚定受体及其相互作用伙伴是稳态和疾病过程中细胞间通讯及信号级联启动的主要调控分子，因此也是重要的治疗靶点。尽管如此，这些相互作用网络在当前数据库中的收录仍严重不足，导致大多数细胞外蛋白尚无已记录的结合伴侣。这一差距主要源于研究细胞外蛋白所面临的挑战，包括功能性蛋白的表达困难，以及细胞表面受体之间常形成的微弱且低亲和力的蛋白相互作用。本方法旨在描述以微阵列形式打印细胞外蛋白文库，用于蛋白-蛋白相互作用的筛选。为实现对弱相互作用的检测，本文介绍了一种基于待研究查询蛋白多聚化的方法。结合基于微珠的多价增强策略，该蛋白微阵列可实现高通量条件下瞬时蛋白-蛋白相互作用的稳健检测。该方法提供了一种快速、低样本消耗的技术路径，适用于任何细胞外蛋白的新相互作用鉴定。文中详细描述了蛋白微阵列的打印与筛选流程。该技术将为致力于在细胞外空间发现蛋白相互作用的科研人员提供一种可靠的实验手段。
引言
本文综述的方法描述了以微阵列形式打印一系列细胞外蛋白，并进一步介绍针对该文库筛选目标蛋白的方法。我们已确定蛋白多聚化是检测低结合亲和力相互作用的关键步骤。为了增强对这类相互作用的检测，本文描述了一种利用微珠对目标查询蛋白进行多聚化的实验方案。
分泌型蛋白和细胞表面表达蛋白（统称为细胞外蛋白）及其相互作用伙伴是细胞间通讯、信号传导以及与微环境相互作用的关键调控因子，因此在调控多种生理和病理过程中具有重要作用。人类基因组中约有四分之一的基因≈5,000 种蛋白质）编码细胞外蛋白质，鉴于其重要性及对系统性给药药物的可及性，这些蛋白质是药物开发的关键靶点1因此，细胞外蛋白代表了市场上已批准药物中具有已知药理作用的蛋白质靶点的70%以上，这些靶点被称为 "可成药蛋白质组"尽管细胞外蛋白质具有重要性和丰富性，但现有的数据库中细胞外蛋白质相互作用（ePPI）网络仍显著缺乏代表性。这主要归因于细胞外蛋白质复杂的生化特性，使得大多数现有技术难以对其进行表征。2首先，膜蛋白难以溶解，该过程通常需要使用剧烈的洗涤条件和去垢剂；其次，当这些蛋白在常用的异源表达系统中表达时，往往缺乏重要的翻译后修饰，例如糖基化；最后，受体之间的相互作用（如免疫细胞上共表达的共受体）通常是瞬时的，并具有极低的亲和力（KD 在约1 μM 至 >100 μM 范围）。综上所述，这些蛋白质及其结合伴侣的特性使得大多数常用技术（如亲和纯化/质谱法（AP/MS）或酵母双杂交系统）均不适用于细胞外空间相互作用的检测2,3.
为克服这些技术难题并加速发现细胞外蛋白的新相互作用，我们开发了一种高覆盖度的细胞外蛋白微阵列4,5微阵列技术具有使用少量样本即可生成高密度表面的优势，通常适用于高通量研究。基于蛋白微阵列的研究此前已为多种模式生物的蛋白质相互作用提供了重要见解，尽管这些研究主要集中于胞质内相互作用或特定蛋白质家族。6,7,8相比之下，利用该技术研究细胞外蛋白相互作用的工作还十分有限。我们开发了一种蛋白微阵列方法，通过构建一个包含大量高多样性纯化分泌蛋白及单次跨膜（STM）受体的文库，以实现对细胞外蛋白-蛋白相互作用（ePPIs）的研究。这些蛋白以重组形式表达其细胞外结构域（ECD），并融合通用标签，便于亲和纯化。4蛋白微阵列筛选的成功在很大程度上依赖于高质量蛋白文库的建立。为表达文库蛋白和查询蛋白，优先选择哺乳动物细胞或昆虫细胞作为异源表达系统，以确保正确添加糖基化或二硫键等翻译后修饰。SDS-PAGE、尺寸排阻色谱和多角度激光光散射是常用于评估重组蛋白质量的技术。随后将蛋白文库点样至环氧硅烷玻片上，并于 -20 ℃ 保存 °长期使用建议保存于 C。下述方案推荐使用蛋白浓度高于 0.4 mg/mL 的样品。因此，表达量较低的蛋白在点样和储存前可能需要进行浓缩步骤。然而，该技术的主要优势在于所需蛋白样品体积小（50 μ克蛋白质足以进行 >2,000 次筛选），同时查询蛋白消耗量极低（20–25 μ每份重复筛选需 g。使用此处描述的方案和设备，若有现成的文库，则可在一个工作日内获得单个查询蛋白的实验结果。
在细胞外环境中检测蛋白质相互作用的主要挑战源于这些相互作用通常具有较弱或瞬时的特性，导致大多数常用方法难以对其进行鉴定。提高结合亲和力可显著增强对弱相互作用蛋白的检测灵敏度9,10,11。基于这一原理，我们开发了一种利用蛋白A包被的微珠对目的蛋白（以Fc融合形式表达）进行多聚化的方法4,5。为了避免因随机标记可能导致的目的蛋白失活，我们不对目的蛋白直接标记，而是将无关的人源免疫球蛋白G用Cy5标记后，与目的蛋白一同加入蛋白A微珠中，从而避免了将荧光染料直接共价连接至目标蛋白所可能引入的人工假象。鉴于多个共受体对之间的亲和力处于微摩尔级别，与以可溶性蛋白形式筛选的Fc融合目的蛋白相比，这种多价复合物可显著提高信噪比4。
总之，本实验方案的目的是描述如何制备含有现有胞外蛋白文库的微阵列玻片，以用于鉴定受体-配体相互作用。我们回顾了玻片打印的步骤，随后介绍了针对该胞外蛋白文库筛选目标蛋白的实验流程。此外，我们还描述了一种基于微珠的增强检测方法，通过提高目标蛋白的多价性来增强胞外蛋白-蛋白相互作用（ePPI）的检测灵敏度。本文所述的胞外蛋白微阵列技术是一种快速、稳健且高效的筛选和检测新ePPI的方法，假阳性率低，且仅需微克级的目标蛋白。该技术已推动多项研究，为多种受体此前未知的细胞功能和信号通路提供了重要见解12,13，包括病毒免疫调节因子14，并可用于对任何感兴趣的胞外蛋白进行去孤儿化研究。
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方案
1. 胞外人类蛋白质文库的构建
- 列出感兴趣的细胞表面受体或分泌蛋白，以构建蛋白质微阵列文库。可针对特定的蛋白家族（例如免疫球蛋白超家族）或在特定细胞类型中选择性表达的蛋白进行研究。
- 对于细胞表面受体，使用软件工具识别信号肽和跨膜区，从而确定胞外域（ECD）的边界。一些相关的在线免费工具见于材料表15,16,17,18。
- 合成目标基因的ECD并克隆至相应载体中。将分泌蛋白或STM受体的ECD与多种常见的亲和标签融合后，可通过转染适当载体的细胞条件培养基，或通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行纯化。
注意：建议使用哺乳动物细胞表达系统（如HEK/293或CHO细胞），以最大程度确保蛋白正确折叠以及添加相关翻译后修饰（如糖基化）。 - 采用标准的亲和纯化方法纯化蛋白。已有研究描述了适用于纯化数百种蛋白的自动化或半自动化流程，可据此扩增以获得所需的目标蛋白集合9,19,20,21。
注意：建议使用SDS-PAGE、尺寸排阻色谱（S）或多角度激光光散射（MALLS）来评估是否存在非共价聚集，并控制蛋白制备物的整体质量。 - 尽可能将蛋白浓度调整为200或400 μg/mL，并用80%甘油稀释后分装于冻存管中，在-20 °C长期保存。这些为母液，仅在必要时取用。
- 将每种蛋白的等分试样（100 μL）转移至96孔板（储存板）中，用粘性封膜密封，并在-20 °C保存直至用于微阵列玻片制备。制备储存板旨在减少冻融循环次数，以保证蛋白稳定性。
2. 胞外蛋白微阵列打印
- 使用标准微阵列点样仪进行玻片打印。本方案所用仪器每次运行可处理57张玻片，点样头配备48根点样针。这些点样针产生的点样直径约为100 μm，点间距离约为350 μm，每次加载吸取0.25 μL样品。在此配置下，每张玻片最多可容纳8,000个点样。
- 从原液板制备工作板（384孔板，每孔10 μL样品）。此步骤需在使用微阵列点样仪进行玻片打印前手动完成。随后，在60%湿度条件下，使用毛细管型点样针将蛋白质点样至环氧硅烷修饰的玻片上（以防止蛋白质点样脱水）。
注意：可在每个蛋白质样品之间以重复形式点样Cy3标记的牛血清白蛋白（BSA）（5 μg/mL溶于PBS/40%甘油），用于阵列可视化及掩模匹配（见第4节）。此步骤虽为推荐，但非必需。 - 点样完成后，将蛋白微阵列玻片从湿润环境中取出，并在PBST中用5%脱脂奶粉溶液封闭过夜，以钝化表面活性。
注意：推荐方法是使用超声波雾化器产生封闭液的细微雾状，使其沉降于玻片表面。 - 将玻片储存在含50%甘油的-20 °C环境中，以防止冻结。
3. 多价诱饵复合物的制备
注意：细胞外蛋白之间的相互作用通常具有较低的亲和力。为了通过增加结合的协同效应来检测这些相互作用，已开发出一种多价方法，即将目的蛋白以Fc标签化的胞外域（ECD）形式表达，并捕获在蛋白A包被的微珠上4。
- 使用Cy5单反应性染料标记用于检测的载体IgG，并通过脱盐柱去除游离染料。通过测定280 nm和650 nm处的紫外吸收值确定染料与蛋白质的比率。
注意：通常使用的蛋白质-染料比例为2.0至4.0。建议将Cy5偶联物在100,000 × g下离心15分钟，以去除标记过程可能产生的可溶性聚集体。 - 通过将蛋白A对固定量的待测蛋白进行滴定，确定微珠与蛋白的最佳比例。在竞争性实验中，利用生物膜干涉技术检测，当Fc标签蛋白完全结合、无游离蛋白残留时，所用的最低微珠体积即为筛选所需的饱和体积。
- 将Fc标签的待测蛋白与Cy5标记的IgG和蛋白A微珠在PBS中混合，避光、室温孵育30分钟，同时在旋转仪上轻轻旋转，以形成微珠-蛋白复合物。
- 为形成这些复合物，使用目的蛋白的终浓度为 20 μg/mL。为计算目的蛋白与 Cy5-IgG 的摩尔比，将目的蛋白的分子量除以 IgG 的分子量（150,000 Da），再乘以 40 μg/mL，以确定所需 Cy5-IgG 的浓度。
- 在与微阵列玻片孵育之前（见下文第4.2节），立即向样品中添加可溶性蛋白A（1 mg/mL），以防止任何游离的蛋白A磁珠与阵列上可能存在的Fc融合蛋白发生结合。
注意：最终反应体积可能因所使用的杂交仪或孵育 chamber 而异。文中所述仪器的 材料表 可使用相对较小的体积（约每张载玻片200 μL）进行样品孵育。
4. 胞外蛋白微阵列筛选与处理。
注意：有多个厂商提供自动处理平台。如果无杂交炉可用，以下步骤可手动操作，但需确保缓冲液体积充足，始终浸没载玻片。
- 将载玻片在室温下预热，并用含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBST）冲洗，以去除残留的甘油，然后装载到杂交仪上。
- 使用以下筛选程序：
- 用PBST洗涤1分钟。
- 加入200 μL含1 mg/mL蛋白A的PBS/5%脱脂奶粉溶液，孵育30分钟，以防止未结合的蛋白A磁珠与微阵列中可能存在的Fc标签蛋白结合。
- 用PBST洗涤5次，每次1分钟。
- 加入200 μL待测样品与磁珠的复合物，并在含1 mg/mL蛋白A的条件下孵育30分钟。
- 用PBST洗涤1分钟。
- 杂交完成后，用水冲洗载玻片，放入单独的50 mL锥形管中，并在900 × g条件下离心5分钟以干燥。
- 最后，使用适合检测Cy3（若已点样BSA-Cy3）和Cy5荧光的微阵列扫描仪进行扫描，激发波长分别为532 nm和635 nm。
- 使用配套的微阵列数据分析软件进行数据分析。将相应的阵列列表（.gal文件）载入数据提取软件。在此阶段，利用Cy3-BSA点样位点识别区块，使用软件中的自动拟合功能，并在必要时手动校正特征位置。将文件保存为.gpr格式以供进一步分析。
5. 数据分析
- 将数据保存为 GPR 文件，并使用 limma 软件包在 R 中进行处理，该软件包常用于微阵列数据分析4,5。
- 进行预处理时，执行背景校正和片内标准化。由于每种蛋白质在芯片上均以两个重复点样打印，需将两个重复测量值合并，为文库中该蛋白质生成一个单一评分。
- 计算每张芯片的评分，并分析各芯片间高评分候选蛋白的交集结果。
- 使用不同打印批次的重复微阵列以控制芯片间的变异性，并利用代表两次筛选数据的交集图来确定最终的阳性结果。
- 最后，进行额外一层过滤，以排除阵列中的广谱结合蛋白。这类非特异性结合蛋白被定义为在独立筛选实验中超过用户设定特定阈值命中频率的蛋白质。
注意：该方案在 Tom et al. 20135 中有详细描述。在本研究中，非特异性结合蛋白的判定基于累积猎物命中率的计算，并采用数据驱动的5%消除阈值。
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结果
细胞外蛋白微阵列技术的工作流程示意图如图1所示。一旦获得包含细胞外蛋白文库的微阵列芯片，对目标蛋白的筛选及数据分析可在一天内完成。许多在生理条件下相关的跨膜受体之间的相互作用具有非常弱的结合强度（KD 处于微摩尔范围）。为了提高此类相互作用的检测灵敏度，已开发出一种基于查询蛋白（以Fc融合形式表达）在蛋白A-微珠上发生多聚化的方法。本文描述了该实验方案，并在图2中展示了该方法在增强蛋白质相互作用（PPI）检测性能方面的代表性结果。
蛋白质微阵列筛选的一个代表性示例如下所示 图3在所示示例中，一种孤儿人腺病毒免疫调节蛋白被用于筛选其与包含1,500多种受体胞外域或分泌蛋白的文库之间的相互作用14如所述，病毒蛋...
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讨论
人类基因组中仍存在大量孤儿受体，同时针对此前已知配体的胞外蛋白，新的相互作用伙伴仍在不断被发现。明确人类及模式生物中的受体-配体相互作用，对于理解稳态过程中细胞通讯的调控机制，以及疾病发生过程中的功能失调至关重要，从而为开发新的或改进的治疗策略提供依据。然而，目前广泛应用的技术在检测胞外蛋白相互作用方面仍面临显著障碍，主要源于细胞受体及其相互作用分子在生物化学特性上的技术挑战。本报告中，我们描述了一种利用胞外蛋白微阵列筛选目标查询蛋白的方法，重点介绍了利用微珠复合物以增强蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）检测的策略。
研究受体-受体相互作用具有较大挑战性，因为许多在生理上具有重要意义的受体对之间的相互作用非常微弱，其结合亲和力通常处于微摩尔（µM）范围2,3。通过多聚化增强亲和力已被证明是提高低亲和力蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）检测灵敏度的有效策略。我们开发了一种基于Fc融合蛋白的方法，可高效形成多价微珠-蛋白探针复合物4
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披露
B.H.、S.R-R 和 N.M-M 是基因泰克（Genentech）公司的员工，并持有基因泰克公司/罗氏集团（Genentech Inc./Roche group）的股份。
致谢
感谢 Philamer Calses 和 Kobe Yuen 对手稿的审阅。感谢 Randy Yen 提供出色的技术建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 超纯MB级甘油 | USB Corporation | 56-81-5 | 蛋白质储存 |
| SeptoMark封闭缓冲液 | Zeptosens | BB1, 90-40 | 微阵列玻片封闭 |
| 牛血清白蛋白 | Roche | 03-117-957-001 | 用于掩模适配的玻片对照（可选） |
| 聚丙烯多孔板 | Greiner Bio One | 82050-678 | 蛋白质储存 |
| 聚丙烯多孔板 | Arrayit | MMP384 | 玻片点样 |
| NanoPrint LM60或类似接触式微阵列点样仪 | Arrayit | NanoPrint LM60, or similar contact microarrayer | 玻片点样 |
| 微点样针 | Arrayit | Micro spotting pins | 玻片点样 |
| ZeptoFOG封闭工作站 | Zeptosens | ZeptoFOG blocking station, 1210 | 点样后封闭玻片 |
| 脱脂奶粉 | Thermo Fisher | LP0031 | 封闭溶液 |
| 环氧硅烷涂层玻片 | Nextrion Slide E | 1064016 | 微阵列玻片 |
| 玻璃片架和玻片架套装 | Wheaton | 900303 | 玻片储存 |
| Cy5单反应性染料 | GE Healthcare | PA23031 | 白蛋白标记 |
| Cy5单反应性染料 | GE Healthcare | PA25001 | 人IgG标记 |
| Pro-spin脱盐柱 | Princeton Separations | CS-800 | 去除游离染料 |
| 粘性铝箔封膜 | AlumaSeal | F-384-100 | 密封储备板 |
| 聚丙烯低温冻存管 | Corning | 430658 | 蛋白质文库储存主管 |
| Protein A磁珠 | Miltenyi | 120-000-396 | 查询蛋白质多聚化 |
| 人IgG | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | 无关IgG标记 |
| Protein A | Sigma | P7837 | 微阵列玻片封闭 |
| 杂交工作站，a-Hyb或类似设备 | Miltenyi | Hybridization station, a-Hyb or similar | 自动化微阵列处理（可选） |
| GenePix 4000B扫描仪或类似设备 | Molecular Devices | GenePix 4000B scanner or similar | 玻片扫描 |
| GenePix Pro或等效数据提取软件 | Molecular Devices | GenePix Pro or equivalent data extraction software | 数据处理 |
| Signal P4.1 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | 在线软件 | 用于预测信号肽切割位点存在及位置的工具 |
| TMHMM 2.0服务器 | DTU Bioinformatics, Technical University of Denmark | 在线软件 | 预测蛋白质中的跨膜螺旋 |
| Phobius | 斯德哥尔摩生物信息学中心 | 在线软件 | 联合预测跨膜拓扑结构和信号肽 |
| TOPCONS | 斯德哥尔摩大学 | 在线软件 | 预测膜蛋白拓扑结构和信号肽 |
参考文献
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