低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

Summary

在这里, 我们提出了一个方案来筛选细胞外蛋白微阵列, 以识别新的受体配体相互作用在高通量。我们还描述了一种利用蛋白质微珠复合物来增强瞬态蛋白相互作用的检测方法。

Abstract

分泌因子、膜相连受体及其相互作用的伙伴是细胞通信的主要调节器, 并在稳态和疾病期间启动信号级联, 因此是主要的治疗靶点。尽管这些互动网络具有相关性, 但在现有数据库中的代表性仍然严重不足;因此, 大多数细胞外蛋白没有记录的结合伙伴。这种差异主要是由于与细胞外蛋白的研究相关的挑战, 包括功能蛋白的表达, 以及细胞表面受体之间经常建立的弱、低亲和力、蛋白质相互作用。这种方法的目的是描述打印细胞外蛋白库的微阵列格式, 以筛选蛋白质-蛋白质相互作用。为了能够检测弱相互作用, 描述了一种基于查询蛋白多化的方法。结合这种基于微珠的多聚化方法, 提高多价, 蛋白质微阵列允许在高吞吐量下对瞬态蛋白-蛋白质相互作用进行可靠的检测。这种方法提供了一种快速和低样本的方法, 用于识别适用于任何细胞外蛋白的新相互作用。介绍了蛋白质微阵列的制备和筛选方案。这项技术将有助于研究人员寻求一种可靠的方法来发现细胞外空间中的蛋白质相互作用。

Introduction

本文回顾的方法描述了以微阵列格式打印细胞外蛋白的方法, 然后是针对该库筛选感兴趣的目标的方法。我们已经确定蛋白质多化是检测以低结合亲和力为特征的相互作用的关键一步。为了加强对这些相互作用的检测, 我们描述了一种基于使用微珠对感兴趣的查询蛋白进行多聚合的协议。

分泌和细胞表面表达的蛋白质 (统称为细胞外蛋白) 及其相互作用的伙伴是细胞通信、信号传递和与微环境相互作用的关键调节剂。因此, 它们对于调节许多生理和病理过程至关重要。大约四分之一的人类基因组 (5, 000 蛋白质) 编码细胞外蛋白, 鉴于其对系统交付药物的重要性和可获得性, 是药物开发的关键目标¹。因此, 细胞外蛋白占市场上已知的药物药理作用的蛋白质靶点的70% 以上, 被称为 "可吸毒蛋白质组"。尽管细胞外蛋白-蛋白质相互作用 (eppi) 网络的重要性和丰富性, 但在现有数据库中的代表性仍然明显不足。这从根本上说是由于细胞外蛋白的复杂生化性质, 从而使其无法使用最可用的技术^进行表征2。首先, 膜蛋白很难溶解, 这一过程通常涉及苛刻的洗涤条件和洗涤剂;其次, 细胞外蛋白往往缺乏相关的翻译后修饰, 如糖基化, 当这些蛋白质表达在常用的异源系统中时, 糖基化是不存在的。最后, 受体之间的相互作用, 如在免疫细胞上表达的共同受体, 往往是短暂的, 并具有非常低的亲和力 (k_{d 在}~ 1μm 到 & gt;....

Protocol

1. 细胞外人类蛋白质库的生成

1. 编制一份细胞表面受体或感兴趣的分泌蛋白列表, 以建立蛋白质微阵列库。特定的蛋白质家族 (例如, 免疫球蛋白超家族) 或在特定细胞类型中选择性表达的蛋白质可以选择进行研究。
2. 对于细胞表面受体, 通过使用软件工具识别信号肽和跨膜区域来确定细胞外域 (ecd) 边界。一些在网上免费提供的相关工具, 在^{材料表 15、16、17、18 中}有所提及.
3. 综合相关基因的 ecd, 克隆到相关载体中。分泌的蛋白质或 stm 受体的 ecd 融合到一些常见的亲和力标签可以从通过适当载体转染的细胞的条件培养基中纯化, 也可以从 baculovirus-虫细胞表达系统中纯化。
   注: 建议使用哺乳动物细胞基系统 (如 hek/293 或 cho 细胞), 以最大限度地提高适当的蛋白质折叠和添加相关的翻译后修饰 (如糖基化) 的可能性。
4. 采用标准的亲和纯化方法对蛋白质进行纯化。以前的努力描述了适用于纯化数百种蛋白质的自动化或半自动程序, 这些蛋白质可以缩放以生成感兴趣的蛋白质^{集 9、}<....

Results

细胞外蛋白微阵列技术的工作流程示意图如图 1所示。一旦含有细胞外蛋白库的微阵列幻灯片可用, 即可在一天内完成感兴趣的蛋白质筛选和数据分析。膜内化受体之间许多生理上相关的相互作用的特点是非常弱的结合强度 (_kd在微摩尔范围内)。为了提高对这种相互作用的检测能力, 提出了一种基于查询蛋白 (以 fc 融合表示) 的方法, 该方法对 a-微珠蛋白进行了多聚化。本文介绍了此协议,图 2显示了此增强检测 ppi 的方法性能的一个代表性示例。

图 3给出了一个蛋白质微阵列屏幕的典型示例。在所示的例子中, 对一个孤儿人类腺病毒免疫调节蛋白进行筛选, 以便与一个由 1, 500多个受体 ecd 或分泌蛋白14组成的文库进行相互作用^.<.......

Discussion

大量的孤立受体仍然存在于人类基因组中, 新的相互作用的伙伴继续出现的细胞外蛋白与以前的特征配体。定义人类和模型生物中的受体配体相互作用对于了解在稳态过程中决定细胞通信的机制以及导致疾病的失调至关重要, 因此为新的或改进的机制提供信息治疗方案。然而, 广泛使用的技术检测细胞外蛋白相互作用是一个重要的障碍, 主要原因是与细胞受体及其相互作用伙伴的生物化学相关的技术挑战。在本报告中, 我们描述了使用细胞外蛋白微阵列筛选感兴趣的查询蛋白, 重点是利用微珠复合物增强检测 ppi。

探针受体相互作用是特别具有挑战性的, 因为许多生理相关的对的特点是非常弱的相互作用与结合亲和力在微摩尔范围^2,3。通过多聚化增强亲和力已被证明是提高低亲和力 ppi 检测灵敏度的有用策略。我们开发了一种基于 fc 融合蛋白的方法, 用于高效形成多价微珠蛋白查询复合物⁴。查询蛋白的多化是检测低亲和力 ppi 的关键步骤。如

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
超纯 MB 级甘油	USB Corporation	56-81-5	蛋白质储存
SeptoMark 封闭缓冲液	Zeptosens	BB1， 90-40	封闭缓冲液微阵列载玻片
牛血清白蛋白	Roche	03-117-957-001	用于面罩安装的载玻片控制器（可选）
聚丙烯多孔板	Greiner Bio One	82050-678	蛋白质储存
聚丙烯多孔板	Arrayit	MMP384	载玻片打印
NanoPrint LM60，或类似触点微阵列仪	Arrayit	NanoPrint LM60 或类似的接触式微阵列仪	载玻片打印
微点样针	Arrayit	微点样针	载玻片打印
ZeptoFOG 封闭站	Zeptosens	ZeptoFOG 封闭站，1210	打印后封闭切片
脱脂奶粉	Thermo Fisher	LP0031	封闭液
环氧硅烷涂层载玻片	Nextrion 载玻	E 1064016	微阵列载玻片
架和载玻片架套件	Wheaton	900303	载玻片储存
Cy5 单反应染料	GE Healthcare	PA23031	白蛋白标记
Cy5 单反应染料	GE Healthcare	PA25001	人 IgG 标记
Pro-spin 脱盐柱	Princeton分离	CS-800	去除免费染料
粘合铝箔密封	AlumaSeal	F-384-100	密封库存板
聚丙烯低温小瓶	康宁	430658	用于蛋白质库存储的主小瓶
蛋白质A微珠	Miltenyi	120-000-396	查询蛋白质多聚化
人IgG	Jackson免疫研究	009-000-003	用于标记
蛋白 A	Sigma	P7837	微阵列玻片封闭
杂交站，a-Hyb 或类似物	Miltenyi	杂交站，a-Hyb 或类似物	自动微阵列芯片处理（可选）
GenePix 4000B 扫描仪或类似物	Molecular Devices	GenePix 4000B 扫描仪或类似	物 载玻片扫描
GenePix Pro 或同等数据提取软件	Molecular Devices	GenePix Pro 或同等数据提取软件	数据处理
信号 P4.1	DTU 生物信息学，丹麦技术大学	在线软件	确定信号肽切割位点的存在和位置的预测工具
TMHMM 2.0 服务器	DTU 生物信息学，丹麦技术大学	在线软件	预测蛋白质中的跨膜螺旋
恐惧	症斯德哥尔摩生物信息学中心	在线软件	跨膜拓扑和信号肽预测器的组合
TOPCONS	斯德哥尔摩大学	在线软件	膜拓扑和信号肽的预测