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方法文章

利用短暂性大脑中动脉闭塞小鼠模型评估甘草根及根茎提取物的神经保护作用

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DOI：

10.3791/58454

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2018年12月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Korean Medicine, Pusan National University, 2College of Medicine, Dongguk University, 3Kyunghee Naseul Korean Medicine Clinic

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究通过建立大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型，改进了现有的实验方法，以获得更可重复的实验结果。在诱导脑卒中后口服甘草根及根茎（GR）甲醇提取物（GRex），与未治疗的对照组相比，显著降低了总体梗死体积。

摘要

脑卒中后脑血流缺血再灌注会导致神经细胞死亡和脑组织丧失。研究脑卒中最常用的动物模型是大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。既往研究报道，即使在相同实验动物种类和相似MCAO条件下，梗死体积仍存在差异。因此，我们建立了一种改进的实验方法以解决这一差异。采用尼龙线作为闭塞材料对小鼠实施MCAO，以模拟人类脑卒中情况，并通过优化尼龙线直径以获得更可重复的梗死体积。脑卒中诱导后给予甘草根及根茎甲醇提取物（GRex）处理的小鼠，其总梗死体积显著减小，存活细胞数量较未治疗对照组明显增加。该改良实验方案成功且可重复地证明了GRex对缺血性脑卒中的保护作用。

引言

脑血流缺血和再灌注引起的脑损伤会导致神经细胞死亡和脑组织丧失。随着肥胖、高血压和糖尿病等代谢性疾病的蔓延，脑血管疾病的发病率不断上升，此类脑损伤的绝对数量也随之持续增加1,2。全球范围内，脑卒中老年患者的绝对人数显著增加，而这些患者常遗留长期残疾，其医疗照护成本已成为重大的社会负担。因此，应尽可能减轻继发性残疾，以降低经济负担1,2。

最常用的大脑梗死啮齿类动物模型是大脑中动脉（MCA）闭塞（MCAO）模型，该模型通过使用硅胶包被的外科缝合丝线闭塞大脑中动脉以阻断血流，从而引起缺血性脑卒中3,4。采用丝线作为闭塞材料，可通过调节丝线在血管内插入的持续时间，来控制闭塞的时间和永久性。

既往研究表明，即使采用相同的啮齿类动物MCAO模型，不同实验之间的脑梗死总体积仍存在差异，导致研究的可重复性较低。为提高可重复性，我们优化了实验中所用栓线的直径。对脑缺血时间与诱导梗死范围的初步研究结果显示，缺血时间超过60 min时，可观察并定量受损脑组织的体积区域。

甘草（GR），又称甘草根与根茎，由甘草（Glycyrrhiza uralensis）和光果甘草（G. glabra）的干燥根及根茎组成。其在中医和韩国传统医学中被广泛用于多种用途，包括作为食品添加剂以及药用5,6,7。

在之前的一项研究8中，预先使用人参甲醇提取物（GRex）处理显示出对MCAO小鼠具有抗凋亡作用，包括显著防止B细胞淋巴瘤2蛋白（Bcl-2）和Bcl超大蛋白（Bcl-xL）表达水平的下降。本研究旨在通过评估GRex在梗死后治疗中是否能有效减少MCAO诱导的脑损伤中的梗死体积，从而提高传统MCAO小鼠模型的可重复性。

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方案

所有涉及动物的实验程序均经釜山国立大学伦理委员会批准（批准编号：PNU-2016-1087）。本研究的图示概览见图1。

1. GRex 的制备与给药

注意：本研究中使用的 GR 来自一家商业制药公司。

  1. 将200 g GR加入2,000 mL甲醇中，于室温（25 °C）孵育5天。
  2. 使用厚度为0.26 mm、孔径为5 µm的滤纸过滤混合物，然后弃去上清液。向GR残留物中加入1,000 mL甲醇，再次过滤。
  3. 合并两次上清液，经滤纸过滤，减压浓缩后冷冻干燥残余物，得到GRex。
  4. 将GRex溶于二甲基亚砜（DMSO）中，用0.9%生理盐水稀释，并通过0.45 µm针式滤器过滤。然后将DMSO的终浓度调整至 < 5%.
  5. 在MCAO再灌注后1小时给予GRex（300 mg/kg体重） 通过 灌胃。仅对正常组和对照组分别给予生理盐水稀释的DMSO（10 mL/kg体重）。
    注意：本实验中使用的GRex浓度是根据我们先前研究中显示具有活性的浓度确定的8.

2. 大脑中动脉阻塞小鼠模型

  1. 使用6周龄、体重22-25 g的雄性C57BL/6小鼠。所有动物均可自由摄取标准饲料和水，并饲养于温度受控（22 ± 1 °C）且具有12小时光照/黑暗循环的环境中。
    1. 将小鼠分为每组6只的小鼠组，包括假手术正常组、对照组和GRex处理组。
    2. 在对照组和GRex处理组中，使用体视显微镜进行MCAO手术（改良Koizumi等9的方法）。
  2. 使用含2%异氟烷的70% N2O和30% O2混合气体诱导小鼠吸入麻醉。当小鼠对尾部施加的机械刺激无反应时，视为麻醉充分。使用连接体温计的保温毯将小鼠体温维持在36.5 ± 0.5 °C。
  3. 先剃除小鼠胸部和颈部的毛发，再使用脱毛膏彻底去除残留毛发；用聚维酮碘溶液与酒精交替擦拭手术区域皮肤两次进行消毒；然后用手术刀在颈部中央做一条长约2 cm的切口。仔细分离左侧颈总动脉（LCCA）、颈外动脉以及颈内动脉分支周围的结缔组织。
  4. 用手术缝线（4-0丝线，半结扎法）结扎颈外动脉和颈总动脉，以在手术期间暂时阻断血流进入颈内动脉。
  5. 将一根硅胶包被的尼龙缝线（8-0单股，长11 mm）经颈内动脉插入至左侧大脑中动脉（MCA）起始部。调整缝线硅胶包被部分的直径至0.10–0.12 mm范围内。
  6. 使用激光多普勒血流仪测量MCA区域相对脑血流量（rCBF）的下降情况。当缺血期间rCBF持续维持在静息状态值的< 20%时，即可确认MCAO成功。
  7. 在脑动脉闭塞期间，将插入的缝线固定于血管内2小时，随后小心撤出缝线以恢复血流，进行22小时的再灌注。用缝合线在5个位置缝合皮肤（3-0丝线，双半结扎法），并让每只小鼠从麻醉中自然苏醒。
  8. 对于正常组，执行假手术操作，步骤同上（至第2.4步），但有以下例外：仅结扎颈总动脉，然后缝合切开的肌肉和皮肤。

3. 损伤脑组织体积的测量

  1. 小鼠经 CO2 吸入法安乐死后，于大脑中动脉闭塞（MCAO）发作 24 小时后，使用虹膜手术剪和弯头镊子取出小鼠脑组织。
    1. 使用剪刀去除头部后，沿头部正中皮肤切开，将皮肤从颅骨上翻起。
    2. 用弯头镊子敲开顶骨，同时剥离硬脑膜，然后小心地将脑组织从颅骨中分离出来。
  2. 使用小鼠脑切片模具将取出的脑组织切成 1 mm 厚的切片，随后将切片浸入 2% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）溶液中染色 17 分钟。
  3. 将切片置于 10% 甲醛溶液中固定至少 2 小时，然后使用数码相机拍照。TTC 会将存活组织染成红色，而坏死区域则呈白色。
  4. 使用 ImageJ 软件分析并量化每一切片的脑梗死面积。

4. 组织切片的苏木精和伊红（H&E）染色与焦油紫染色

  1. 通过吸入 CO2 处死小鼠用于组织学研究，并经心脏灌注 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注 10 mL 4% 多聚甲醛（PFA）。采用与上述相同的方法（3.1）分离脑组织，并将脑组织浸入 10 mL 30% 蔗糖溶液中过夜。
  2. 将脑组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，使用冷冻切片机冠状切片，厚度为 15 µm。将切片贴附于玻璃载玻片上，随后进行苏木精-伊红（H&E）或焦油紫染色。
  3. 将玻璃载玻片浸入 80% 乙醇中 1 分钟，随后在苏木精染液中染色 5 分钟。
    1. 将载玻片浸入 1% 酸性乙醇中两次，再浸入饱和碳酸锂溶液中 30 秒，用自来水冲洗 30 秒，然后在伊红染液中复染 30 秒。
    2. 用自来水冲洗载玻片，依次浸入 95% 乙醇和无水乙醇中。
    3. 将载玻片自然晾干，用二甲苯透明至少 10 分钟，然后使用封片剂加盖盖玻片。
  4. 将玻璃载玻片置于载玻片加热板上至少 1 小时，随后浸入用氯仿稀释的 50% 乙醇中过夜。
    1. 在 40 °C 干燥烘箱中用 0.1% 焦油紫染色 10 分钟。
    2. 浸入 95% 乙醇中 30 分钟，然后在无水乙醇中脱水两次。
    3. 用二甲苯透明两次，每次 5 分钟，待自然晾干后使用封片剂封片。
  5. 使用显微镜观察 MCAO 诱导脑损伤后发生的组织学变化。

5. 统计分析

  1. 使用数据分析软件，以单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey's post hoc 检验，将实验结果表示为均值 ± 标准差，并确定各组之间的统计学显著性。
  2. 将统计学显著性设定为 p 值 < 0.05。

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结果

在假手术正常组中，未观察到脑梗死，而在对照组中，观察到较广泛的损伤区域。在大脑中动脉阻塞（MCAO）模型组中给予300 mg/kg GRex的小鼠，其损伤区域显著减小，差异具有统计学意义（图2）。

通过苏木精-伊红（H&E）或焦油紫染色对缺血性脑组织切片进行染色，以观察其组织学变化。H&E 染色可提供细胞的结构信息及特定功能信息10，而焦油紫染色则用于估算海马区神经元的总数11。因此，使用 ImageJ 软件测得的 H&E 或焦油紫染色强度（图 3A）可作为细胞存活的指标。与正常组相比，对照组的 H&E 和焦油紫染色强度显著降低（图 ...

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讨论

随着慢性高血压、糖尿病和高脂血症等代谢性疾病发病率的不断上升，这些疾病作为脑卒中的主要危险因素，使得脑卒中的预防与治疗已成为医学研究的重要领域12,13。脑卒中后出现的语言和运动功能障碍与脑组织损伤程度密切相关14，严重影响患者及其家庭的生活质量15。为了评估药物治疗的效果，必须采用能够模拟人类疾病相同病理变化的合适动物模型。大脑中动脉闭塞（MCAO）模型通过阻断脑动脉血管来模拟血栓性脑卒中，因其具有较高的可重复性和较低的侵入性，被广泛应用于研究中16,17,18,19。

然而，比较不同研究人员报道的相同静息时间下诱导...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
甘草根与根茎Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea甘草根与根茎
定性滤纸AdvantecFilter paper No. 2定性滤纸
二甲基亚砜（DMSO）SigmaD8418-250ML二甲基亚砜（DMSO）
注射器滤器（0.45 µm）SigmaCLS431220注射器滤器（0.45 µm）
体视显微镜LeicaM50体视显微镜
体视显微镜NikonSMZ745体视显微镜
激光多普勒血流仪Moor InstrumentmoorVMS-LDF激光多普勒血流仪
带N2O&O2流量计系统的麻醉台架Harvard Appratus34-1352带N2O&O2流量计系统的麻醉台架
恒温监测系统Harvard Appratus55-7020恒温监测系统
数码相机CanonEos-M2数码相机
冷冻切片机LeicaCM3050S冷冻切片机
显微镜Carl ZeissZeiss Axio显微镜
数据分析软件Systat Software Inc.SigmaPlot version 12数据分析软件
数据分析软件NIH ImageImageJ数据分析软件
小鼠饲料Doo Yeol Biotech标准啮齿类动物饲料小鼠饲料
异氟烷JOONGWAEA02104781异氟烷
异氟烷TROIKAAISOTROY 100异氟烷
丝线缝合线（4-0黑色丝线） AILEESK47510丝线缝合线（4-0黑色丝线） 
丝线缝合线（3-0白色丝线） Baekjae57丝线缝合线（3-0白色丝线） 
尼龙缝合线（8-0单股） AILEENB825尼龙缝合线（8-0单股） 
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）SigmaT8877-25G2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）
福尔马林（甲醛溶液）JUNSEI69360-1263 20KG福尔马林（甲醛溶液）
苏木精（Harris苏木精）YD DiagnosticsEasyStain苏木精（Harris苏木精）
伊红（1%伊红Y溶液）MUTO PURE CHEMICALS3200-2伊红（1%伊红Y溶液）
焦油紫（醋酸盐）SigmaC5042-10G焦油紫（醋酸盐）
多聚甲醛 Sigma-AldrichP6148-1KG多聚甲醛 
蔗糖JUNSEI31365-0350 1KG蔗糖
最佳切割温度（OCT）包埋剂Scigen4583最佳切割温度（OCT）包埋剂
解剖刀Fine Science Tools10055-12解剖刀
#4镊子Fine Science Tools11241-30#4镊子
#5镊子Fine Science Tools11254-20#5镊子
#6镊子Fine Science Tools11260-20#6镊子
#7精细镊子Fine Science Tools11274-20#7精细镊子
手术剪Fine Science Tools14001-12手术剪
超精细波恩剪Fine Science Tools14084-08超精细波恩剪
Moria Pascheff-Wolff弹簧剪Fine Science Tools15371-92Moria Pascheff-Wolff弹簧剪
血管扩张镊Fine Science Tools18153-11血管扩张镊

参考文献

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