利用短暂性大脑中动脉闭塞小鼠模型评估甘草根及根茎提取物的神经保护作用

摘要

本研究通过建立大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型，改进了现有的实验方法，以获得更可重复的实验结果。在诱导脑卒中后口服甘草根及根茎（GR）甲醇提取物（GRex），与未治疗的对照组相比，显著降低了总体梗死体积。

摘要

脑卒中后脑血流缺血再灌注会导致神经细胞死亡和脑组织丧失。研究脑卒中最常用的动物模型是大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。既往研究报道，即使在相同实验动物种类和相似MCAO条件下，梗死体积仍存在差异。因此，我们建立了一种改进的实验方法以解决这一差异。采用尼龙线作为闭塞材料对小鼠实施MCAO，以模拟人类脑卒中情况，并通过优化尼龙线直径以获得更可重复的梗死体积。脑卒中诱导后给予甘草根及根茎甲醇提取物（GRex）处理的小鼠，其总梗死体积显著减小，存活细胞数量较未治疗对照组明显增加。该改良实验方案成功且可重复地证明了GRex对缺血性脑卒中的保护作用。

引言

脑血流缺血和再灌注引起的脑损伤会导致神经细胞死亡和脑组织丧失。随着肥胖、高血压和糖尿病等代谢性疾病的蔓延，脑血管疾病的发病率不断上升，此类脑损伤的绝对数量也随之持续增加^1,2。全球范围内，脑卒中老年患者的绝对人数显著增加，而这些患者常遗留长期残疾，其医疗照护成本已成为重大的社会负担。因此，应尽可能减轻继发性残疾，以降低经济负担^1,2。

最常用的大脑梗死啮齿类动物模型是大脑中动脉（MCA）闭塞（MCAO）模型，该模型通过使用硅胶包被的外科缝合丝线闭塞大脑中动脉以阻断血流，从而引起缺血性脑卒中^3,4。采用丝线作为闭塞材料，可通过调节丝线在血管内插入的持续时间，来控制闭塞的时间和永久性。

既往研究表明，即使采用相同的啮齿类动物MCAO模型，不同实验之间的脑梗死总体积仍存在差异，导致研究的可重复性较低。为提高可重复性，我们优化了实验中所用栓线的直径。对脑缺血时间与诱导梗死范围的初步研究结果显示，缺血时间超过60 min时，可观察并定量受损脑组织的体积区域。

方案

所有涉及动物的实验程序均经釜山国立大学伦理委员会批准（批准编号：PNU-2016-1087）。本研究的图示概览见图1。

1. GRex 的制备与给药

注意：本研究中使用的 GR 来自一家商业制药公司。

1. 将200 g GR加入2,000 mL甲醇中，于室温（25 °C）孵育5天。
2. 使用厚度为0.26 mm、孔径为5 µm的滤纸过滤混合物，然后弃去上清液。向GR残留物中加入1,000 mL甲醇，再次过滤。
3. 合并两次上清液，经滤纸过滤，减压浓缩后冷冻干燥残余物，得到GRex。
4. 将GRex溶于二甲基亚砜（DMSO）中，用0.9%生理盐水稀释，并通过0.45 µm针式滤器过滤。然后将DMSO的终浓度调整至 < 5%.
5. 在MCAO再灌注后1小时给予GRex（300 mg/kg体重） 通过 灌胃。仅对正常组和对照组分别给予生理盐水稀释的DMSO（10 mL/kg体重）。
   注意：本实验中使用的GRex浓度是根据我们先前研究中显示具有活性的浓度确定的⁸.

2. 大脑中动脉阻塞小鼠模型

1. 使用6周龄、体....

结果

在假手术正常组中，未观察到脑梗死，而在对照组中，观察到较广泛的损伤区域。在大脑中动脉阻塞（MCAO）模型组中给予300 mg/kg GRex的小鼠，其损伤区域显著减小，差异具有统计学意义（图2）。

通过苏木精-伊红（H&E）或焦油紫染色对缺血性脑组织切片进行染色，以观察其组织学变化。H&E 染色可提供细胞的结构信息及特定功能信息¹⁰，而焦油紫染色则用于估算海马区神经元的总数¹¹。因此，使用 ImageJ 软件测得的 H&E 或焦油紫染色强度（图 3A）可作为细胞存活的指标。与正常组相比，对照组的 H&E 和焦油紫染色强度显著降低（图 .......

讨论

随着慢性高血压、糖尿病和高脂血症等代谢性疾病发病率的不断上升，这些疾病作为脑卒中的主要危险因素，使得脑卒中的预防与治疗已成为医学研究的重要领域^12,13。脑卒中后出现的语言和运动功能障碍与脑组织损伤程度密切相关¹⁴，严重影响患者及其家庭的生活质量¹⁵。为了评估药物治疗的效果，必须采用能够模拟人类疾病相同病理变化的合适动物模型。大脑中动脉闭塞（MCAO）模型通过阻断脑动脉血管来模拟血栓性脑卒中，因其具有较高的可重复性和较低的侵入性，被广泛应用于研究中^16,17,18,19。

然而，比较不同研究人员报道的相同静息时间下诱导.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘草根与根茎	Gwangmyoung Pharmaceuticals Co., Korea		甘草根与根茎
定性滤纸	Advantec	Filter paper No. 2	定性滤纸
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D8418-250ML	二甲基亚砜（DMSO）
注射器滤器（0.45 µm）	Sigma	CLS431220	注射器滤器（0.45 µm）
体视显微镜	Leica	M50	体视显微镜
体视显微镜	Nikon	SMZ745	体视显微镜
激光多普勒血流仪	Moor Instrument	moorVMS-LDF	激光多普勒血流仪
带N2O&O2流量计系统的麻醉台架	Harvard Appratus	34-1352	带N2O&O2流量计系统的麻醉台架
恒温监测系统	Harvard Appratus	55-7020	恒温监测系统
数码相机	Canon	Eos-M2	数码相机
冷冻切片机	Leica	CM3050S	冷冻切片机
显微镜	Carl Zeiss	Zeiss Axio	显微镜
数据分析软件	Systat Software Inc.	SigmaPlot version 12	数据分析软件
数据分析软件	NIH Image	ImageJ	数据分析软件
小鼠饲料	Doo Yeol Biotech	标准啮齿类动物饲料	小鼠饲料
异氟烷	JOONGWAE	A02104781	异氟烷
异氟烷	TROIKAA	ISOTROY 100	异氟烷
丝线缝合线（4-0黑色丝线）	AILEE	SK47510	丝线缝合线（4-0黑色丝线）
丝线缝合线（3-0白色丝线）	Baekjae	57	丝线缝合线（3-0白色丝线）
尼龙缝合线（8-0单股）	AILEE	NB825	尼龙缝合线（8-0单股）
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）	Sigma	T8877-25G	2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）
福尔马林（甲醛溶液）	JUNSEI	69360-1263 20KG	福尔马林（甲醛溶液）
苏木精（Harris苏木精）	YD Diagnostics	EasyStain	苏木精（Harris苏木精）
伊红（1%伊红Y溶液）	MUTO PURE CHEMICALS	3200-2	伊红（1%伊红Y溶液）
焦油紫（醋酸盐）	Sigma	C5042-10G	焦油紫（醋酸盐）
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-1KG	多聚甲醛
蔗糖	JUNSEI	31365-0350 1KG	蔗糖
最佳切割温度（OCT）包埋剂	Scigen	4583	最佳切割温度（OCT）包埋剂
解剖刀	Fine Science Tools	10055-12	解剖刀
#4镊子	Fine Science Tools	11241-30	#4镊子
#5镊子	Fine Science Tools	11254-20	#5镊子
#6镊子	Fine Science Tools	11260-20	#6镊子
#7精细镊子	Fine Science Tools	11274-20	#7精细镊子
手术剪	Fine Science Tools	14001-12	手术剪
超精细波恩剪	Fine Science Tools	14084-08	超精细波恩剪
Moria Pascheff-Wolff弹簧剪	Fine Science Tools	15371-92	Moria Pascheff-Wolff弹簧剪
血管扩张镊	Fine Science Tools	18153-11	血管扩张镊