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方法文章

在自由活动大鼠脑电图记录期间进行兴奋性氨基酸的微透析

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DOI：

10.3791/58455

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2018年11月8日

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1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, Neuroscience Center, University of Ferrara and National Institute of Neuroscience

本文内容

摘要

此处，我们介绍一种方法 在体 采用微透析技术结合脑电图记录，分析癫痫与非癫痫大鼠腹侧海马中天冬氨酸和谷氨酸的释放情况。细胞外天冬氨酸和谷氨酸浓度可能与疾病的不同阶段相关。

摘要

微透析是一种成熟的神经科学实验技术，可将扩散进入脑组织间隙空间的神经活性物质的变化与行为学表现和/或特定病理结果相关联。例如， 癫痫发作）。在研究癫痫时，微透析技术常与短期甚至长期的视频脑电图（EEG）监测相结合，以评估自发性癫痫发作的频率、严重程度、进展及发作簇集现象。这种联合应用的微透析-EEG技术依赖于多种方法和仪器的协同使用。本文中，我们进行了 体内 微透析结合连续视频脑电图记录，用于监测癫痫大鼠模型自然病程不同阶段谷氨酸和天冬氨酸随时间变化的流出情况。这种联合方法可将神经递质释放的变化与疾病发展和进展的特定阶段相对应。透析液中氨基酸浓度通过液相色谱法测定。本文描述了相关方法，并概述了实验过程中应采取的主要预防措施 体内 微透析-脑电图联合技术，重点关注立体定位手术、微透析过程中基础状态及高钾刺激条件、深部电极脑电图记录，以及透析液中天冬氨酸和谷氨酸的高效液相色谱分析。该方法可适用于检测多种药物或疾病所引起的脑内天冬氨酸和谷氨酸生理浓度的变化。根据可用的适当分析方法，该技术还可进一步用于在同步进行脑电图记录的同时检测其他可溶性分子。 关键词：微透析-脑电图, 立体定位手术, 基础与高钾刺激, 深部电极脑电图记录, 高效液相色谱, 天冬氨酸, 谷氨酸, 透析液分析

引言

为了深入了解谷氨酸介导的兴奋性神经传递与GABA能抑制性神经传递功能受损导致颞叶癫痫（TLE）中自发性癫痫发作的机制，我们系统地监测了细胞外GABA的浓度1 以及谷氨酸和天冬氨酸的水平2 通过微透析技术在疾病自然病程的不同时间点采集大鼠腹侧海马区的样本， 即，癫痫发生与发展过程中。我们采用了大鼠TLE匹罗卡品模型，该模型在行为学、电生理学和组织病理学改变方面均能高度准确地模拟该疾病3,4 并将微透析液中氨基酸浓度与其不同阶段相关联：致痫损伤后的急性期、潜伏期、首次自发性癫痫发作时期以及慢性期5,6,7通过长期视频脑电图（video-EEG）监测以及对自发性癫痫发作的精确脑电图和临床特征描述，实现了对疾病各阶段的界定。将微透析技术与长期视频脑电图监测相结合，使我们能够提出关于颞叶癫痫（TLE）神经病理机制的假说。综上所述，本文所述技术可在动物模型中将特定脑区内的神经化学变化与癫痫的发生和发展过程进行关联分析。

由深部电极与微透析套管并置组成的配对装置，常用于癫痫研究，以将神经递质、其代谢物或能量底物的变化与神经元活动相关联。在绝大多数情况下，该技术用于自由活动的动物，但也可在人类中采用类似方法实施，例如，对接受术前深部电极检查的药物难治性癫痫患者进行监测8。脑电图记录和透析液采集可分别单独进行（例如，在一侧大脑半球植入电极而在对侧大脑半球植入微透析探针，或在一组动物中仅进行微透析，而在另一组动物中仅进行脑电图记录）。然而，将电极与探针耦合具有多种优势：可简化立体定位手术，将组织损伤限制于单侧大脑半球（而保留对侧完整，作为组织学研究的对照），并使结果更加均一，因为数据来自同一脑区且在同一动物个体中获得。

另一方面，如果自行制备耦合的微透析探针-电极装置，则需要一定的技术并耗费时间。若从市场上购买，成本相对较高。此外，当微透析探针（探针尖端直径通常为 200–400 µm，长度为 7–12 mm）9 与脑电图（EEG）电极（电极尖端直径通常为 300–500 µm，长度足以到达目标脑区）10 耦合后，所组装的装置会成为动物头部一侧体积较大且相对较重的物体，给动物带来不便，并容易丢失，尤其是在连接透析泵和有线EEG记录系统时更为明显。这一问题在癫痫动物模型中尤为突出，因为这类动物难以操作，且对微透析实验的适应性较差。采用恰当的外科手术技术以及合适的术后护理，可实现长期稳定的植入，并最大程度减少动物的不适，因此在联合微透析-EEG实验中应予以重视10,11,12。

微透析技术的优缺点已被许多神经科学家详细评述。相较于其他方法，其主要优势在于 体内 灌注技术（例如，快速流体推拉或皮层杯灌注）的一个关键优势是探针直径较小，能够覆盖相对精确的目标区域13,14,15其次，微透析膜在组织与灌流液之间形成了一道物理屏障，因此高分子量物质无法透过，不会干扰分析。16,17此外，组织免受灌注液湍流的冲击18另一个重要优势是能够调节灌注液流速，以最大化灌注液中分析物的浓度（即，微透析过程在数学上可以得到明确定义，并可加以改进以使样品中的分析物达到较高浓度19最后，该技术可用于将药物或药理活性物质灌注到目标组织中，并确定其在干预部位的作用效果20另一方面，与电化学或生物传感器相比，微透析技术的时间分辨率有限（通常超过1分钟，因为需要时间收集样品）；该技术具有侵入性，会造成组织损伤；由于所有可溶性物质持续以浓度梯度形式进入灌流液，从而破坏了膜周围空间内的神经化学平衡。最后，微透析技术的结果在很大程度上受到用于测定灌流液中物质含量的分析技术的局限性影响。9,21,22,23经邻苯二甲醛衍生化后用于生物样品中谷氨酸和天冬氨酸分析的高效液相色谱法（HPLC）已得到充分验证24,25,26,27 其广泛讨论超出了本文的范围，但将详细描述通过该方法产生的数据。

若操作得当且不改变灌流液成分，微透析可提供有关神经递质基础释放水平的可靠信息。基础水平的大部分可能源于突触处神经递质的溢出9。然而在许多情况下，仅对突触外间隙中的神经递质进行取样不足以实现研究目的，因此也可利用微透析技术刺激神经元，或使其缺乏重要的生理离子（如 K+ 或 Ca2+），以诱发或抑制神经递质的释放。

高浓度 K+ 刺激常用于神经生物学研究中，不仅可用于清醒动物，也可用于原代和器官型培养物中的神经元活动刺激。将健康的中枢神经系统暴露于高 K+ 浓度（40–100 mM）的溶液中，可诱发神经递质的释放28。神经元在高 K+ 条件下额外释放神经递质的能力，在癫痫动物模型及其他神经退行性疾病中可能受损1,29,30。类似地，通过灌注无钙溶液实现的 Ca2+ 缺乏，常用于建立通过微透析测定的大多数神经递质的钙依赖性释放。通常认为，Ca2+ 依赖性释放来源于神经元，而 Ca2+ 非依赖性释放则来源于胶质细胞；但许多研究对微透析检测到的谷氨酸或 GABA 等物质的 Ca2+ 敏感性测量结果的解释提出了争议9。因此，若条件允许，建议结合微传感器技术开展研究，因为后者具有更高的空间分辨率，且电极可更接近突触部位31。

关于在癫痫动物模型中进行的微透析研究，需要强调的是，大多数研究获得的数据依赖于对发作的视频或视频-脑电图（EEG）监测，即基于脑内神经元异常过度放电或同步化活动所导致的短暂性体征和/或症状的观察32。在制备实验时，应考虑使用匹罗卡品处理动物后脑电图上癫痫发作的一些特定特征。自发性癫痫发作之后常伴随活动抑制，并频繁出现脑电图发作间期棘波3，且发作多呈簇状发生33,34。假手术的非癫痫动物也可能表现出类似癫痫的电活动35，因此脑电图记录的评估参数应标准化36，并且如果可能，微透析采样时间点应明确定义。最后，我们强烈推荐遵循国际抗癫痫联盟和美国癫痫学会专家在其最新报告中提出的针对对照成年啮齿类动物视频-脑电图监测的原则与方法学标准37,38。

本文介绍了在癫痫动物模型中并行进行谷氨酸和天冬氨酸的微透析，同时开展长期视频脑电图（EEG）记录，并通过高效液相色谱法（HPLC）对透析液中的分析物进行检测。我们将重点强调该实验方案中需特别注意的关键步骤，以获得最佳结果。

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方案

所有实验程序均已获得费拉拉大学机构动物护理和使用委员会以及意大利卫生部（批准号：D.M. 246/2012-B）的批准，符合1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）中规定的指南。本方案专门针对在癫痫和非癫痫大鼠中通过脑电图（EEG）监控微透析过程所获得的大鼠脑透析液中的谷氨酸和天冬氨酸测定进行了优化。本文描述的许多材料可根据实验室现有的用于脑电图记录或微透析的设备进行替换。

1. 微透析探针-电极装置的组装

  1. 使用三通道双绞电极（记录电极的有效长度至少为 20 mm，接地电极长度为 10 cm），并将其与引导套管连接以制备装置。参见 图 1A–1B 中用于透析的三通道电极和引导套管示例。
  2. 在将金属引导套管植入动物体内并更换为微透析探针之前，先将其从假性塑料套管中取出（图 1C）并重新插入（图 1D）数次，以便于后续操作时顺利移除。
  3. 将记录电极的双绞导线弯曲两次（图 1E–1F），使其与引导套管的假性套管对齐，并使用数显卡尺将电极尖端剪裁至比引导套管尖端长 0.5 mm（图 1G）（图 1H）。
  4. 准备好一段长 1 mm 的硅胶环（外径 2 mm，厚度 0.3 mm；图 1I），用镊子将引导套管尖端和双绞电极尖端插入硅胶环中（图 1J）。使用快速聚合胶水或树脂将其固定在引导套管底座的基脚上（图 1K）。参见 图 1L 和 图 2A 中已完成装置的示例。
  5. 将装置置于杀菌紫外灯下灭菌 4 小时。每隔 1 小时翻转装置一次，共翻转四次，确保每个侧面均暴露于紫外线下 1 小时。
    注意：许多自制电极和微透析探针均可采用类似方式组装。上述用于大鼠的植入装置头部尺寸如下：从顶部到底座前端为 7 mm 宽 × 5 mm 深 × 10 mm 长；植入体尖端长约 11 mm，直径 600 µm，整个装置重量约为 330–360 mg。若满足以下两个条件，该装置可重复使用两到三次：（i）手术时在颅骨上保留足够长度的接地电极以供下次使用；（ii）动物处死后，将装置连同牙科水泥一起取出，并在丙酮中浸泡过夜，使水泥可被机械性剥离，随后对装置进行清洗并再次灭菌。

2. 立体定位手术

  1. 使用立体定位装置和探针夹持器（图2B）进行设备植入，操作需遵循当前无菌且无痛手术的标准39,40,41。
    1. 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（43 mg/kg 和 7 mg/kg，腹腔注射）对成年Sprague-Dawley大鼠进行麻醉，并将其固定在立体定位仪上。在初始氯胺酮/赛拉嗪注射基础上添加异氟烷麻醉（空气中浓度1.4%；流速1.2 mL/min），以便实时调控麻醉深度。剃除动物头部的毛发。
  2. 使用含碘溶液擦拭头部皮肤表面，随后用70%乙醇处理，以准备无菌手术39。
    1. 将先前制备好的导管-电极装置（步骤1.1–1.5）植入右侧腹侧海马，定位坐标如下：鼻杆 +5.0 mm，前囟后 -3.4 mm，右侧 +4.5 mm，后囟前 +6.5 mm1,2。遵循立体定位手术的标准技术10,11,12。
    2. 确保装置不覆盖固定螺钉。将装置安装至立体定位仪时，应握住导管头部进行操作，以便与探针夹持器准确对齐。
  3. 使用至少四枚不锈钢螺钉将装置固定于颅骨上（左侧和右侧额骨各一枚，左侧顶骨和间顶骨各一枚）。每枚螺钉周围滴加一滴组织胶，以进一步将其固定于颅骨。
    1. 用甲基丙烯酸酯水泥覆盖螺钉约一半的螺纹部分。通过在骨面上制作浅槽以增强水泥结合力，提高附着强度。
  4. 当装置尖端定位至脑组织后，将接地电极的导线缠绕在3枚固定螺钉上。使用牙科水泥覆盖所有已安装的螺钉及装置12,42,43。
  5. 在手术期间及术后约1小时内持续监测动物状态，直至其恢复直立并能在笼内活动。使用加热垫维持体温，防止低体温。设备植入后，让大鼠至少恢复7天。
  6. 术后至少连续3天每日观察动物一次，检查是否存在疼痛或不适迹象。在切口部位涂抹抗生素软膏（庆大霉素0.1%），预防感染；并给予镇痛药（曲马多5 mg/kg，腹腔注射）连续3天，以预防术后疼痛。

3. 匹罗卡品诱导颞叶癫痫及实验动物分组

  1. 术后恢复一周后，将动物随机分组：(i) 接受溶剂的对照组动物，以及 (ii) 接受匹罗卡品的癫痫动物。由于并非所有给予匹罗卡品的大鼠都会发病，因此癫痫组的动物数量应按比例增加。
  2. 注射甲基东莨菪碱（1 mg/kg，皮下注射），30 分钟后，单次注射匹罗卡品（350 mg/kg，腹腔注射）以诱导癫痫持续状态（SE）。对照组大鼠注射甲基东莨菪碱和溶剂（生理盐水）。所有腹腔注射均使用 1 mL 注射器配 25G 针头。
    1. 通过肉眼观察动物是否开始出现行为性癫痫发作（5 分钟内胡须抖动、点头、肢体抽搐），并在 25 分钟内发展为全身持续性抽搐（SE）。
  3. 在癫痫持续状态发作 2 小时后，通过注射地西泮（20 mg/kg，腹腔注射）终止发作，以实现约 25% 的死亡率，并使平均潜伏期约为 10 天。从匹罗卡品注射后立即开始观察并记录任何癫痫行为，持续至少 6 小时。
  4. 在癫痫持续状态后 2–3 天内，使用 1 mL 注射器配 25G 针头给予动物生理盐水（1 mL，腹腔注射），并使用 1 mL 注射器配 17G 柔性饲喂针给予蔗糖溶液（1 mL，口服），以促进体重恢复。
    1. 将匹罗卡品诱导的癫痫持续状态后第一周内未能恢复至初始体重的动物排除出研究（急性组除外，该组在癫痫持续状态后 24 小时处死，无法进行体重追踪）。
  5. 将癫痫持续状态后的动物随机分配至不同的实验组（图 3）：急性期（微透析在癫痫持续状态后 24 小时进行）、潜伏期（癫痫持续状态后 7–9 天）、首次自发性癫痫发作期（癫痫持续状态后约 11 天）和慢性期（始于癫痫持续状态后约 22–24 天，即首次癫痫发作后约 10 天）。监测动物是否出现自发性癫痫发作。
    注意：对癫痫大鼠后续实验采用以下纳入/排除标准：在给予匹罗卡品后 1 小时内出现惊厥性癫痫持续状态；癫痫持续状态后第一周体重增加；微透析探针和电极位置正确。

4. 癫痫行为监测与分析

  1. 癫痫行为的长期监测
    1. 匹鲁卡品给药后约6小时即在研究人员直接观察结束后，将动物放入清洁的饲养笼中，并开始24小时视频监测。
    2. 使用数字视频监控系统，持续进行24小时视频监测，直至第5天。
    3. 从第5天开始，将大鼠连接至其饲养用矩形笼具中的拴线式脑电图记录系统，并继续进行24小时视频监测。
    4. 在法拉第笼外的放大器上设置参数（根据每只动物脑电图信号的特异性设置各通道的放大倍数），并开始采集未连接导线时产生的脑电图信号。采样率设置为 200 Hz，低通滤波器设置为 0.5 Hz。
    5. 用一只手的两个手指夹住动物的头部，另一只手将电缆连接至动物头部的电极基座并拧紧连接器。开始信号采集。
      警告： 确保信号无伪影。常见的伪影是远超量程的尖峰。
    6. 微透析实验前一天，将动物转移至配备有机玻璃圆筒的拴线式脑电图系统中。将动物从脑电图拴线系统断开时，需在动物不被限制的情况下，将其电极连接器从笼内拧下。随后将动物放入较高的有机玻璃圆筒中。
  2. 癫痫行为的监测：微透析前一日及微透析期间
    1. 打开位于法拉第笼外部的放大器。启动脑电图（EEG）软件。开始采集脑电图信号，观察未连接电极时导联产生的脑电图信号。
    2. 用一只手的两个手指夹住动物的头部，将其连接到固定的脑电图（EEG）记录系统，并用另一只空闲的手将连接器旋紧至电极基座上。根据单个动物电极信号的大小，在放大器的每个通道上设置适当的放大倍数（增益），使脑电图信号处于合适的量程范围内。在研究人员直接观察下，让动物在新的笼子（圆筒）中自由探索至少1小时。
    3. 注意： 在微透析实验前24小时，用异氟烷对大鼠进行短暂麻醉，以将引导套管更换为微透析探针。利用动物处于麻醉状态的时机，将其连接至脑电图（EEG）记录系统。
    4. 根据动物的体型调整悬挂电缆的长度。确保电缆不会妨碍动物的活动和躺卧姿势。
    5. 检查视频摄像机的图像构图是否正确。开始视频-脑电图记录。
  3. 癫痫发作与脑电图活动的识别
    1. 使用软件播放器观看视频。将视频播放速度调快至实际速度的8倍，识别全面性发作（表现为动物前肢阵挛性抽搐伴直立，或直立后倒下并伴有前肢阵挛性抽搐）。随后放慢视频速度，记录行为性发作开始和结束的精确时间。
    2. 通过统计24小时视频记录中观察到的全面性发作次数，将数据处理为24小时内所有观察到的发作事件的平均发作频率和持续时间。
    3. 将脑电图癫痫发作定义为高频（>5 Hz）阵发性活动持续超过10秒的时段。>5 Hz）特征的 >基线基础上振幅增加3倍，伴随持续至少3秒的尖峰频率进展2,44 或类似物28使用脑电图软件处理原始脑电图记录。将脑电图轨迹分割为每小时一段。将脑电图片段复制到文件中，用于软件自动进行尖波分析。
    4. 使用脑电图软件和预设参数（4.3.3.）分析脑电活动数据。所有视频分析均由两名对所分析动物分组不知情的独立研究者进行。若存在分歧，应共同重新审查数据以达成共识45.

5. 微透析

  1. 体外 探针回收率测定
    1. 根据制造商的说明，在保护套管中操作，准备探针的首次使用。
    2. 实验设三个重复：准备三个1.5 mL离心管，每管加入1 mL含有标准品混合物的林格氏液（2.5 µM谷氨酸和2.5 µM天冬氨酸）。将这三个装有溶液的1.5 mL离心管放入设定为37 °C的金属浴中，并置于搅拌器上。
      注意：色谱校准使用相同的标准溶液。
    3. 用石蜡膜密封1.5 mL离心管，并用尖头镊子刺穿石蜡膜，制造一个直径约1 mm的孔。
    4. 取出探针并将其插入石蜡膜上的孔中，确保膜部分至少浸入液面以下2 mm。再用石蜡膜将探针固定在1.5 mL离心管上。
      注意：确保探针尖端不接触1.5 mL离心管的管壁。
    5. 使用FEP管和管接头将探针的入口连接至安装在灌注泵上的注射器。可选地，使用内径0.28 mm、外径0.61 mm的细孔聚乙烯管，以及彩色管接头（红色和蓝色管接头）进行连接。
    6. 启动泵，流速设为2 µL/min，使液体从出口端流出。使用FEP管和管接头将探针出口连接至0.2 mL收集管。
      注意：所有连接均使用FEP管。使用剃刀片切割所需长度的管路。探针的入口和出口使用不同颜色的管接头。让泵运行60分钟。检查是否存在泄漏或气泡，这些情况不应出现。
    7. 将泵的流速设为2 µL/min，开始在管路出口端收集样品。
    8. 收集三个30分钟的灌流液样品，以及三个等体积的1.5 mL离心管中的溶液样品。使用微量注射器从1.5 mL离心管中每30分钟取一次等体积样品，插入标准溶液中取样。
    9. 重复实验（5.1.1–5.1.8），将泵的流速设为3 µL/min（步骤5.1.7），以比较两种不同灌注流速下的探针回收率。
    10. 实验结束后，停止泵运行，用蒸馏水和70%乙醇冲洗管路，并向其中推入空气。将探针储存于装有洁净蒸馏水的小瓶中。在储存前，用蒸馏水以2 µL/min的流速对探针进行充分冲洗。
    11. 通过色谱法分析样品中谷氨酸和天冬氨酸的浓度（详见下文6.3节）。
    12. 使用以下公式计算回收率：
      回收率 (%) = (C灌流液 /C透析液) × 100。
  2. 自由活动大鼠的微透析实验
    1. 准备程序：探针插入与测试、灌注泵设置与启动
      1. 根据制造商的用户指南准备微透析探针的首次使用，并用林格氏液填充。剪取约10 cm长的FEP管，使用不同颜色的管接头将其连接至探针的入口和出口套管。
      2. 确保所有连接处管路与接头紧密接触，无死腔。
      3. 5.2.1.3. 微透析实验前24小时，将动物置于诱导室中，用5%异氟烷（空气中）短暂麻醉至侧卧。用镊子牢固握住动物头部，从引导套管中取出假性套管。将带有透析膜的微透析探针插入引导套管中，并用模型蜡进一步固定已插入引导套管中的微透析套管。
        注意：提取过程中，避免探针接触保护套管的管壁。
      4. 将动物放入有机玻璃圆筒中，使其适应新环境。按照前述方法（参见4.2.2和4.2.3节）将动物连接至固定式脑电图记录系统。
      5. 观察清醒且自由活动的大鼠行为，使用管接头将探针入口连接至装有林格氏液、配有钝头22G针头的2.5 mL注射器。持续推动2.5 mL注射器活塞，在10秒内向探针内推注1 mL林格氏液，观察出口端是否有液滴出现。此时探针已准备就绪，可供使用。
      6. 用林格氏液填充连接FEP管的2.5 mL注射器，并将其安装至灌注泵上。将泵启动，流速设为2 µL/min，持续运行过夜。
        注意：可使用任意长度的FEP管，但需计算管路死腔体积，以确定高K+刺激的起始时间，并将定量数据与动物脑内神经化学变化相关联。利用工作流速下管路中形成的气泡来计算该时间。
    2. 脑电图记录及钾离子刺激期间的样品采集
      1. 确认在样品采集开始前3小时内无癫痫发作（通过视频脑电图记录），并在微透析过程中持续监测癫痫活动。
      2. 停止携带装有林格氏液的FEP管连接注射器的泵运行。将另一组装有含100 mM K+的改良林格氏液、并通过管接头连接FEP管的2.5 mL注射器安装至泵上。
      3. 启动泵，流速设为2 µL/min并持续运行。为更快填充管路，可在填充期间将泵速设为5 µL/min。检查系统中无气泡存在。确保所有连接处管路与接头紧密接触，无死腔。
      4. 按照前述方法（5.2.1.5）测试探针是否可在动物中使用。
        注意：若探针因任何原因无法工作，应予以更换。为此，应在微透析-脑电图工作站附近准备若干已备好的微透析探针以备更换。必要时，断开动物的脑电图电缆并用异氟烷短暂麻醉动物以完成更换。
      5. 将装有林格氏液的注射器FEP管连接至每只动物探针的入口套管，并等待出口端出现液滴。
      6. 将探针出口连接至FEP管，该管通向收集管。将FEP管插入带穿孔盖的0.2 mL封闭离心管中，并用模型蜡固定，确保管路位置稳定。
      7. 以2 µL/min流速继续运行泵60分钟，期间不收集样品，以平衡系统（零样品）。
      8. 在基础条件下（使用正常林格氏液灌注），连续收集5个30分钟的透析液样品（每份60 µL）。将样品置于冰上保存。
      9. 计算液体从泵到达动物头部所需的时间（取决于管路死腔体积，即气泡运行时间），并在该时间点切换FEP管，将连接正常林格氏液注射器的管路切换至连接含100 mM K+改良林格氏液的注射器，切换过程中不停止泵运行。检查系统中无气泡。让泵继续运行10分钟。
        注意：在10分钟高K+刺激期间，动物通常会剧烈活动，并频繁出现湿狗样抖动（对照组及非癫痫簇动物）或行为性癫痫发作（癫痫动物），因此需准备随时干预，防止管路和电缆缠绕。
      10. 10分钟后，将管路从含100 mM K+林格氏液的注射器切换回正常林格氏液注射器，并继续运行泵。在更换溶液过程中不要关闭泵，以确保待连接管路末端有液滴存在。
      11. 从透析液中出现高钾离子开始，即第五个平衡后透析液样品采集后，每10分钟（20 µL）收集一次透析液组分，持续1小时。再额外收集3个30分钟的透析液样品，然后停止泵运行。将样品置于冰上保存。
      12. 实验结束后，将样品在-80 °C保存，直至进行HPLC分析。
      13. 除急性（24小时）组和首次自发癫痫发作组（仅在状态性癫痫后24小时内或首次自发癫痫发作后24小时内进行一次微透析实验）外，其余组连续进行3天的微透析实验（图3）。
      14. 每次实验结束后，使用过量麻醉剂处死动物，并取出脑组织以验证探针和电极的位置。
  3. 微透析后处理程序
    1. 用蒸馏水冲洗使用过的微透析探针，并将其储存在装有洁净蒸馏水的小瓶中，以备下次使用。
      注意：重复使用的膜可能通透性增加；再次使用前应检测探针回收率。
    2. 用蒸馏水冲洗整个微透析装置（管路、连接器和注射器），随后用70%乙醇冲洗。用空气替换乙醇，并将装置储存在无菌环境中。
    3. 将基础透析液样品分装为20 µL的组分，仅使用一份20 µL样品进行氨基酸基础浓度分析。将剩余样品体积在-80 °C保存，用于进一步或验证性分析。
    4. 用10%福尔马林固定脑组织，并通过石蜡包埋进行保存1。将脑组织冠状切片，并用苏木精-伊红染色。检查脑组织中探针和电极的放置位置是否正确1,2。
      注意：将脑组织在冷却的2-甲基丁烷中固定，并在-80 °C保存。可使用其他经证实的神经组织切片染色方法，以清晰显示探针和电极的轨迹。

6. 谷氨酸和天冬氨酸的色谱分析

  1. 衍生试剂的制备
    1. 在样品瓶中按20:1（v/v）的体积比混合邻苯二甲醛试剂（OPA）和2-巯基乙醇（5-ME）。用瓶盖和密封隔垫密闭样品瓶。
      注意：请在通风橱内操作。
    2. 将配制好的溶液涡旋混匀，然后放入自动进样器中指定用于衍生试剂的位置。
  2. 透析液样品的制备
    1. 将带底部弹簧的玻璃插管放入2 mL棕色自动进样瓶中。为同一批次中所有待测样品准备好相应的样品瓶。
    2. 从-80 °C冰箱中取出20 µL透析液样品，使其融化。移除1 µL溶液，并向剩余19 µL样品中加入1 µL内标物（IS）L-高丝氨酸（50 µM），使样品中内标物终浓度为2.5 µM。用移液器将20 µL透析液样品加入瓶中的玻璃插管内，并用密封隔垫封口。
    3. 使用色谱软件将装有样品的样品瓶放入自动进样器，并标记各样品的位置。
  3. 样品的色谱分析以测定谷氨酸和天冬氨酸浓度
    1. 在配备荧光检测器的液相色谱系统上进行分析。在样品中加入20 μL邻苯二甲醛/5-巯基乙醇（20:1，v/v）试剂，进行2 min柱前衍生后检测氨基酸。
    2. 准备系统用于氨基酸分析。开启自动进样器、泵、脱气装置、检测器以及控制单元和计算机。
    3. 将虹吸管浸入装有流动相的瓶中，冲洗色谱泵中用于分析的流路通道。
    4. 开始逐步增加流动相流速，同时监测色谱柱压力（例如，从0.2 mL/min开始，每5 min增加0.2 mL/min，直至达到工作流速）。让系统在0.8 mL/min的工作流速下运行至少1 h，以平衡色谱柱。
      注意：压力不稳定表明系统中存在气泡。压力不得超过25 MPa。
    5. 在检测器上设置增益、高灵敏度模式，激发波长和发射波长分别设为345 nm和455 nm。重置检测器信号（自动调零，AUTOZERO）。
    6. 通过色谱软件将方法发送至仪器。此时色谱仪应已准备就绪，可进行测定。
    7. 在合适的色谱柱上分离透析液样品、加标透析液样品以及标准品（Ringer溶液中含0.25 µM – 2.5 µM的天冬氨酸和谷氨酸）。在分析任何透析液样品前，校准色谱方法并确定检测限和定量限。
    8. 使用色谱软件启动单次分析，或创建待测样品序列并运行该序列。
      注意：在透析液样品序列中应运行多个空白样品和不同浓度的标准品，以监控方法的准确性。
    9. 获得色谱图后，使用色谱软件进行分析。检查目标峰在标准曲线中的积分情况。采用峰高或峰面积进行定量。
    10. 样品记录完成后，用有机溶剂（例如，50%乙腈的超纯水溶液）冲洗并填充色谱柱和系统，以防止系统老化和霉菌生长。
    11. 关闭系统。

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结果

探针回收

平均回收率（即， 灌流液中氨基酸平均含量相对于同等体积小瓶溶液中含量的百分比为15.49 ± 0.42%，在流速为 2 μL/min 和 6.32 ± 0.64 在 3 μL/min 谷氨酸在流速为14.89 ± 0.36%时 2 μL/min 和 10.13 ± 0.51 在 3 μL/min 使用铜仿膜探针时，天冬氨酸的回收率。若使用聚丙烯腈膜探针，在流速为 2 μL/min 和 6.55 ± 1.07 在 3 μL/min 谷氨酸在流速为 2 μL/min 和 8.49 ± 0.15 在 3 μL/min 天冬氨酸图 4A-4B）。如图中清晰可见， 图 4A，较慢的流速（2 μL/min) 提高了两种探针的透析性能。在后续实验中，采用以铜仿膜修饰并以特定流速灌注的探针 2 ...

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讨论

在本研究中，我们展示了如何在TLE的实验模型中结合连续视频脑电图（video-EEG）记录与微透析技术进行操作。视频脑电图记录技术用于准确诊断动物疾病进展的不同阶段，而微透析技术则用于描述谷氨酸随时间变化的释放情况（在先前已发表的研究中未发现天冬氨酸有变化2）。基于引言中讨论的原因，我们强烈建议在每只动物体内使用单一装置/植入物同时完成这两项操作。

在条件允许的情况下，慢性脑电图记录应优先选择遥测技术而非有线系统，因为遥测可最大限度减少对动物行为的干扰，并降低动物遭受伤害和痛苦的风险54。然而，有线脑电图记录的成本远低于遥测技术。

在我们的实验室中，我们将脑电图（EEG）记录系统的连接线与微透析管路并行使用，使导线和管路分别连接到两个不同的旋转连接器上。这是此类实验中最关键的问题：由于动物的活动，导线和管路容易频繁缠绕。因此，我们使用的连接器和管路需足够长，以允许动物追逐自己的尾巴（这种行为通常在钾刺激时出现）或在全身性癫痫发作期间...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Anna Binaschi、Paolo Roncon 和 Eleonora Palma 为先前发表的论文所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三通道双绞电极Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPC材料
引导套管Agn Tho's, Lindigö, SwedenMAB 4.15.IC材料
树脂 KK2 塑料Elettra Sport, Lecco, ItalyKK2材料
Super Attack 凝胶 LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italy2047420_71941材料
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)溶液
赛拉嗪Sigma, Milano, ItalyX1251材料
异氟烷-兽用Merial, Toulouse, France103120022 (AIC)溶液
Altadol 50 mg/mL - 曲马多Formevet, Milano, Italy103703017 (AIC)溶液
Gentalyn 0.1% 乳膏 - 庆大霉素MSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC)材料
速凝牙科水泥Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811材料
玻璃离子 CX-Plus 水泥Shofu, Kyoto, JapanPN1167材料
探针夹持器Agn Tho's, Lindigö, Swedenp/n 100 5001设备
Histoacryl® 蓝色外用皮肤粘合剂TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FP材料
安定 10 mg/2 mL - 地西泮Roche, Monza, Italy019995063 (AIC)材料
1 mL 注射器配 25G 针头Vetrotecnica, Padova, Italy11.3500.05材料
大鼠用柔性饲喂针 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206材料
Grass Technology 装置Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08设备（AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40）
模块化数据采集与 分析系统 MP150Biopac, Goleta, California, USAMP150WSW设备
数字视频监控系统AverMedia Technologies, Fremont, California, USAV4.7.0041FD设备
微透析探针Agn Tho's, Lindigö SwedenMAB 4.15.1.Cu材料
微透析探针Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USAS-8010材料
恒温加热块Grant Instruments, Cambridge, EnglandQBD2设备
搅拌器Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy711设备
输注泵Univentor, Zejtun, Malta864设备
细内径聚乙烯管Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA800/100/100/100材料
蓝色管路接头Agn Tho's, Lindigö Sweden1002材料
红色管路接头Agn Tho's, Lindigö Sweden1003材料
2.5 mL 注射器配 22G 针头Chemil, Padova, ItalyS02G22材料
小瓶盖Cronus, Labicom, Olomouc, Czech RepublicVCA-1004TB-100材料
隔垫Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USANational C4013-60 8 mm TEF/SIL 隔垫材料
带底弹簧的玻璃衬管Supelco, Sigma, Milano, Italy27400-U材料
自动进样瓶National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItalyC4013-2材料
Smartline manager 5000 系统控制器与脱气装置Knauer, Berlin, GermanyV7602设备
Smartline 1000 四元梯度泵Knauer, Berlin, GermanyV7603设备
荧光检测器Shimadzu, Kyoto, JapanRF-551设备
色谱柱Knauer, Berlin, Germany25EK181EBJ材料
色谱预柱Knauer, Berlin, GermanyP5DK181EBJ材料
流动相溶液 A0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 6.0溶液
流动相溶液 B40% 0.1 M 磷酸钠缓冲液，30% 甲醇，30% 乙腈，pH 6.5溶液
林格氏液成分（单位：mM）：MgCl2 0.85，KCl 2.7，NaCl 148，CaCl2 1.2，0.3% BSA溶液
改良林格氏液成分（单位：mM）：MgCl2 0.85，KCl 100，NaCl 50.7，CaCl2 1.2，0.3% BSA溶液
生理盐水0.9% NaCl，pH 调至 7.0溶液
蔗糖溶液10% 蔗糖溶于蒸馏水中溶液

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在自由活动大鼠脑电图记录期间进行兴奋性氨基酸的微透析
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