此处，我们介绍一种方法 在体 采用微透析技术结合脑电图记录，分析癫痫与非癫痫大鼠腹侧海马中天冬氨酸和谷氨酸的释放情况。细胞外天冬氨酸和谷氨酸浓度可能与疾病的不同阶段相关。
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本文内容
摘要
摘要
微透析是一种成熟的神经科学实验技术，可将扩散进入脑组织间隙空间的神经活性物质的变化与行为学表现和/或特定病理结果相关联。例如， 癫痫发作）。在研究癫痫时，微透析技术常与短期甚至长期的视频脑电图（EEG）监测相结合，以评估自发性癫痫发作的频率、严重程度、进展及发作簇集现象。这种联合应用的微透析-EEG技术依赖于多种方法和仪器的协同使用。本文中，我们进行了 体内 微透析结合连续视频脑电图记录，用于监测癫痫大鼠模型自然病程不同阶段谷氨酸和天冬氨酸随时间变化的流出情况。这种联合方法可将神经递质释放的变化与疾病发展和进展的特定阶段相对应。透析液中氨基酸浓度通过液相色谱法测定。本文描述了相关方法，并概述了实验过程中应采取的主要预防措施 体内 微透析-脑电图联合技术，重点关注立体定位手术、微透析过程中基础状态及高钾刺激条件、深部电极脑电图记录，以及透析液中天冬氨酸和谷氨酸的高效液相色谱分析。该方法可适用于检测多种药物或疾病所引起的脑内天冬氨酸和谷氨酸生理浓度的变化。根据可用的适当分析方法，该技术还可进一步用于在同步进行脑电图记录的同时检测其他可溶性分子。 关键词：微透析-脑电图, 立体定位手术, 基础与高钾刺激, 深部电极脑电图记录, 高效液相色谱, 天冬氨酸, 谷氨酸, 透析液分析
引言
为了深入了解谷氨酸介导的兴奋性神经传递与GABA能抑制性神经传递功能受损导致颞叶癫痫（TLE）中自发性癫痫发作的机制，我们系统地监测了细胞外GABA的浓度1 以及谷氨酸和天冬氨酸的水平2 通过微透析技术在疾病自然病程的不同时间点采集大鼠腹侧海马区的样本， 即，癫痫发生与发展过程中。我们采用了大鼠TLE匹罗卡品模型，该模型在行为学、电生理学和组织病理学改变方面均能高度准确地模拟该疾病3,4 并将微透析液中氨基酸浓度与其不同阶段相关联：致痫损伤后的急性期、潜伏期、首次自发性癫痫发作时期以及慢性期5,6,7通过长期视频脑电图（video-EEG）监测以及对自发性癫痫发作的精确脑电图和临床特征描述，实现了对疾病各阶段的界定。将微透析技术与长期视频脑电图监测相结合，使我们能够提出关于颞叶癫痫（TLE）神经病理机制的假说。综上所述，本文所述技术可在动物模型中将特定脑区内的神经化学变化与癫痫的发生和发展过程进行关联分析。
由深部电极与微透析套管并置组成的配对装置，常用于癫痫研究....
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方案
所有实验程序均已获得费拉拉大学机构动物护理和使用委员会以及意大利卫生部（批准号：D.M. 246/2012-B）的批准，符合1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）中规定的指南。本方案专门针对在癫痫和非癫痫大鼠中通过脑电图（EEG）监控微透析过程所获得的大鼠脑透析液中的谷氨酸和天冬氨酸测定进行了优化。本文描述的许多材料可根据实验室现有的用于脑电图记录或微透析的设备进行替换。
1. 微透析探针-电极装置的组装
- 使用三通道双绞电极（记录电极的有效长度至少为 20 mm，接地电极长度为 10 cm），并将其与引导套管连接以制备装置。参见 图 1A–1B 中用于透析的三通道电极和引导套管示例。
- 在将金属引导套管植入动物体内并更换为微透析探针之前，先将其从假性塑料套管中取出（图 1C）并重新插入（图 1D）数次，以便于后续操作时顺利移除。
- 将记录电极的双绞导线弯曲两次（图 1E–1F），使其与引导套管的假性套管对齐，并使用数显卡尺将电极尖端剪裁至比引导套管尖端长 0.5 mm（
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结果
探针回收
平均回收率（即， 灌流液中氨基酸平均含量相对于同等体积小瓶溶液中含量的百分比为15.49 ± 0.42%，在流速为 2 μL/min 和 6.32 ± 0.64 在 3 μL/min 谷氨酸在流速为14.89 ± 0.36%时 2 μL/min 和 10.13 ± 0.51 在 3 μL/min 使用铜仿膜探针时，天冬氨酸的回收率。若使用聚丙烯腈膜探针，在流速为 2 μL/min 和 6.55 ± 1.07 在 3 μL/min 谷氨酸在流速为 2 μL/min 和 8.49 ± 0.15 在 3 μL/min 天冬氨酸图 4A-4B）。如图中清晰可见， 图 4A，较慢的流速（2 μL/min) 提高了两种探针的透析性能。在后续实验中，采用以铜仿膜修饰并以特定流速灌注的探针 2 .......
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讨论
在本研究中，我们展示了如何在TLE的实验模型中结合连续视频脑电图（video-EEG）记录与微透析技术进行操作。视频脑电图记录技术用于准确诊断动物疾病进展的不同阶段，而微透析技术则用于描述谷氨酸随时间变化的释放情况（在先前已发表的研究中未发现天冬氨酸有变化2）。基于引言中讨论的原因，我们强烈建议在每只动物体内使用单一装置/植入物同时完成这两项操作。
在条件允许的情况下，慢性脑电图记录应优先选择遥测技术而非有线系统，因为遥测可最大限度减少对动物行为的干扰，并降低动物遭受伤害和痛苦的风险54。然而，有线脑电图记录的成本远低于遥测技术。
在我们的实验室中，我们将脑电图（EEG）记录系统的连接线与微透析管路并行使用，使导线和管路分别连接到两个不同的旋转连接器上。这是此类实验中最关键的问题：由于动物的活动，导线和管路容易频繁缠绕。因此，我们使用的连接器和管路需足够长，以允许动物追逐自己的尾巴（这种行为通常在钾刺激时出现）或在全身性癫痫发作期间.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 Anna Binaschi、Paolo Roncon 和 Eleonora Palma 为先前发表的论文所做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三通道双绞电极 | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | 材料 |
| 引导套管 | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | MAB 4.15.IC | 材料 |
| 树脂 KK2 塑料 | Elettra Sport, Lecco, Italy | KK2 | 材料 |
| Super Attack 凝胶 Loctite | Henkel Italia Srl, Milano, Italy | 2047420_71941 | 材料 |
| Imalgene-Ketamine | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | 溶液 |
| 赛拉嗪 | Sigma, Milano, Italy | X1251 | 材料 |
| 异氟烷-兽用 | Merial, Toulouse, France | 103120022 (AIC) | 溶液 |
| Altadol 50 mg/mL - 曲马多 | Formevet, Milano, Italy | 103703017 (AIC) | 溶液 |
| Gentalyn 0.1% 乳膏 - 庆大霉素 | MSD Italia, Roma, Italy | 20891077 (AIC) | 材料 |
| 速凝牙科水泥 | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | 材料 |
| 玻璃离子 CX-Plus 水泥 | Shofu, Kyoto, Japan | PN1167 | 材料 |
| 探针夹持器 | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | p/n 100 5001 | 设备 |
| Histoacryl® 蓝色外用皮肤粘合剂 | TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA | TS1050044FP | 材料 |
| 安定 10 mg/2 mL - 地西泮 | Roche, Monza, Italy | 019995063 (AIC) | 材料 |
| 1 mL 注射器配 25G 针头 | Vetrotecnica, Padova, Italy | 11.3500.05 | 材料 |
| 大鼠用柔性饲喂针 17G | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | 材料 |
| Grass Technology 装置 | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | 设备（AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40） |
| 模块化数据采集与 分析系统 MP150 | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | 设备 |
| 数字视频监控系统 | AverMedia Technologies, Fremont, California, USA | V4.7.0041FD | 设备 |
| 微透析探针 | Agn Tho's, Lindigö Sweden | MAB 4.15.1.Cu | 材料 |
| 微透析探针 | Synaptech, Colorado Springs, Colorado, USA | S-8010 | 材料 |
| 恒温加热块 | Grant Instruments, Cambridge, England | QBD2 | 设备 |
| 搅拌器 | Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy | 711 | 设备 |
| 输注泵 | Univentor, Zejtun, Malta | 864 | 设备 |
| 细内径聚乙烯管 | Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA | 800/100/100/100 | 材料 |
| 蓝色管路接头 | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1002 | 材料 |
| 红色管路接头 | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 1003 | 材料 |
| 2.5 mL 注射器配 22G 针头 | Chemil, Padova, Italy | S02G22 | 材料 |
| 小瓶盖 | Cronus, Labicom, Olomouc, Czech Republic | VCA-1004TB-100 | 材料 |
| 隔垫 | Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA | National C4013-60 8 mm TEF/SIL 隔垫 | 材料 |
| 带底弹簧的玻璃衬管 | Supelco, Sigma, Milano, Italy | 27400-U | 材料 |
| 自动进样瓶 | National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italy | C4013-2 | 材料 |
| Smartline manager 5000 系统控制器与脱气装置 | Knauer, Berlin, Germany | V7602 | 设备 |
| Smartline 1000 四元梯度泵 | Knauer, Berlin, Germany | V7603 | 设备 |
| 荧光检测器 | Shimadzu, Kyoto, Japan | RF-551 | 设备 |
| 色谱柱 | Knauer, Berlin, Germany | 25EK181EBJ | 材料 |
| 色谱预柱 | Knauer, Berlin, Germany | P5DK181EBJ | 材料 |
| 流动相溶液 A | 0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 6.0 | 溶液 | |
| 流动相溶液 B | 40% 0.1 M 磷酸钠缓冲液，30% 甲醇，30% 乙腈，pH 6.5 | 溶液 | |
| 林格氏液 | 成分（单位：mM）：MgCl2 0.85，KCl 2.7，NaCl 148，CaCl2 1.2，0.3% BSA | 溶液 | |
| 改良林格氏液 | 成分（单位：mM）：MgCl2 0.85，KCl 100，NaCl 50.7，CaCl2 1.2，0.3% BSA | 溶液 | |
| 生理盐水 | 0.9% NaCl，pH 调至 7.0 | 溶液 | |
| 蔗糖溶液 | 10% 蔗糖溶于蒸馏水中 | 溶液 |
参考文献
- Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupova, M., et al.
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