一个 在体 内 评估肠道-血液屏障及肠道微生物产物肝脏代谢的方法

摘要

营养物质、肠道微生物代谢物和药物进入循环系统的过程受到肠-血屏障（GBB）的调控。本文介绍一种直接测定GBB通透性的方法。 体内与常用的间接方法不同，该方法几乎不受肝肾功能的影响。

摘要

肠-血屏障（GBB）控制营养物质、细菌代谢产物和药物从肠腔进入血液的过程。在胃肠道、心血管和代谢性疾病中，GBB的完整性受到破坏，可能导致生物活性化合物（如肠道细菌代谢产物）更容易进入血液。因此，GBB的通透性可能是肠道内外多种疾病的标志物。此外，细菌代谢产物通透性增加可能影响整个机体的功能。

研究肠-血脑屏障（GBB）通透性的常用方法是在离体条件下进行的。ex vivo 方法的准确性有限，因为 GBB 的功能依赖于肠道血流。另一方面，常用的活体in vivo 方法可能受到肝脏和肾脏功能的干扰，因为这些方法依赖于对外源性标志物在尿液和/或外周血中浓度的评估。本文介绍一种基于门静脉采血的活体in vivo 方法，用于直接测量大鼠 GBB 的通透性，该方法保留了肠道血流，且几乎不受肝肾功能的影响。

将聚氨酯导管插入门静脉以及肝静脉汇合处上方的下腔静脉。在基线状态以及向胃肠道特定部位给予选定标记物后，采集血液样本。本文展示了该方法的若干应用，包括：（1）评估结肠对肠道细菌代谢物三甲胺（TMA）的通透性；（2）评估肝脏对TMA的清除能力；（3）评估肠道细菌来源的短链脂肪酸经肠道-门静脉-肝脏-外周血的转运途径。此外，该方案还可用于追踪药物的肠道吸收和肝脏代谢过程，或用于门静脉血压的测量。

引言

肠-血屏障（GBB），也称为肠道屏障，是一种复杂的多层系统，其作用是将肠腔与血液分隔开来，以限制有害物质的通过，同时允许营养物质的吸收¹。它主要由三层结构组成：黏液层、上皮层和固有层。

多种因素可能影响肠-血屏障（GBB）的完整性和功能²。研究表明，胃肠道内外的多种疾病（包括心血管疾病和代谢性疾病）均可导致GBB功能紊乱³，这可能导致肠道细菌代谢产物更易进入血液循环⁴。肠道细菌代谢产物通透性增加可能影响整个机体的功能。例如，近期研究显示，吲哚类物质、H2S、短链脂肪酸（SCFA）以及氧化三甲胺等细菌代谢产物对循环系统功能具有显著影响^5,6,7,8,9。最终，有研究提出，GBB通透性增加可作为与肠道形态和功能改变相关的心血管疾病和代谢性疾病的潜在标志物¹⁰。因此，追踪细菌代谢产物从肠道经门静脉血至肝脏再至全身血液循环的路....

方案

实验按照欧盟关于用于科研目的动物保护的2010/63号指令，在雄性Wistar Kyoto大鼠上进行，并经华沙第一地方法学伦理委员会批准。

1. 肠内给药导管的置入

注意： 本文提出通过导管进行结肠内给药标记物的方法。该方法可根据需要修改为经口给药或在消化道不同部位进行灌胃给药。 例如 胃或十二指肠。请务必使用一次性外科手术服，包括手术袍、头罩和手套，并严格遵守手术中使用锐器（如针头、 等等。) 在步骤 1-6 期间。

1. 实验前对动物进行禁食过夜处理。所有操作均需在全身麻醉下进行。 即， 通过腹腔注射1.5 g/kg体重的乌拉坦获得麻醉效果。通过眼睑反射和角膜反射的消失，以及脚趾夹捏和尾部夹捏法评估麻醉是否充分。
2. 使用儿科 Foley 导尿管（10F 或 8F）作为结肠导管。在导管上做标记，标示将插入结肠的部分（约 8 cm）。
3. 在将导管插入结肠前，检查肛门区域及直肠内的粪便情况。若存在粪便，通过按摩直肠区域排空直肠。
4. 涂抹润滑剂（例如 沿导管涂抹甘油或凡士林。用润滑剂湿润肛门及其周围区域。
5. 将导管沿导丝缓慢插入外肛门括约肌约8 cm，同时进行轻柔的前后移动和环形运动。
   注意：插入导管时，需通过腹部触诊持续....

结果

我们已成功测定了大鼠体内TMA的血脑屏障通透性和肝脏清除率。结果表明，与正常血压大鼠相比，高血压大鼠对TMA的结肠通透性增加。图2)⁴在另一项研究中，我们发现高盐摄入不影响TMA的GBB通透性和肝脏清除率图3)¹⁴.

通过测定粪便、门静脉血和外周血中短链脂肪酸（SCFA）的浓度，我们追踪了这些分子从肠道到外周血的转运路径。这些实验的典型结果见表3。

讨论

所述的直接体内测量血脑屏障通透性的方法，在胃肠道系统中保持了接近生理的状态（保留了肠道血流），且几乎不受肝肾功能的影响。

该技术的关键步骤是门静脉导管的插入。此操作必须同时做到轻柔且果断。正确穿刺门静脉后可能会出现轻微、短暂的出血；然而，当针头插入血管后，出血便会停止。持续出血则提示门静脉已被穿透。为了便于导管插入，应充分暴露门静脉。在将肠管移出体外后，若肠系膜根部已充分暴露，则通常也可看到肠系膜上静脉（肠系膜静脉头侧汇入门静脉）。门静脉通常被肝叶覆盖，需将其向两侧推开。此外，门静脉导管的妥善固定对于手术成功至关重要，因为导管移动可能导致门静脉破裂和出血，尤其在较长时间的实验中更需注意。可通过组织胶将导管粘附于肠系膜，或使用两针单缝线（6/0缝线）固定，以进一步增强导管的稳定性。关闭腹腔以固定导管位置后，可在导管上应用荷包缝合。

实验过程中可能会出现一些小困难。股静脉插管后，若导管内无静脉血回流，可尝试以下解决方法：用肝素化生理盐水冲洗导管，将导管从静脉内轻轻外拉1-2 mm，拆除手术结并重新打结 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针外径：9 mm	Becton Dickinson  S.A.	301300
聚乙烯导管内径：0.025"，外径：0.040"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-40
聚乙烯导管内径：0.012"，外径：0.025"	Scientific Commodities, Inc.	#BB520-25
C-Flex 管，不透明白色，1/50"内径 × 1/12 " 外径	Cole-Parmer Instrument Co.	06424-59
小儿用Foley导尿管（10F或8F）	Sigmed	0000 80305
外科结扎线 3/0	Yavo Sp. Z o.o.	P48JE
可吸收外科缝线 - 聚乳酸-乙醇酸共聚物 910 4/0	KRUUSE Polska Sp. Zo.o.	152336
组织胶 - Loctite 454氰基丙烯酸酯粘合剂	Loctite	1370127
聚维酮碘	EGIS Pharmaceuticals PLC	4449 11
肝素 - Heparinium WZF	WZF Polfa S.A.	02BK0417	用生理盐水稀释10倍
甘油 86%	Laboratorium Farmaceutyczne Avena	5.90999E+12	用于结肠插管时的润滑剂
利多卡因 2%	AstraZenca	9941342
氨基甲酸乙酯	Sigma-Aldrich (Merck)	U2500-500G
三甲胺溶液 45%	Sigma-Aldrich (Merck)	92262-1L
2 mL 注射器	B.Braun Melsungen AG	4606027V
生理盐水 250 mL	Fraesenius Kabi Polska Sp. Z o.o.	15LL707WL
手术剪，直型，长度115 mm，4 1/2 " 钝头	Braun	NS-010-115-PKM
动脉钳，Micro-Adson弯型，长度140 mm，5 1/2 "	Braun	KN-008-140-ZMK
解剖镊，长度95 mm，3 3/4" 尖头 0.7×0.55	Braun	PO-001-007-ZMK
Vannas型显微剪，  直型，长度85 mm，3 3/8 "，刀刃长度6 mm	Braun	NO-010-085-PMK
Backhouse型巾钳，长度130 mm，5 1/8"	Braun	HO-128-130-PMK
持针器，长度150 mm，6" t=0.4 1/2	Braun	IM-927-150-PZMK
精细剪，长度110 mm，直型，4 3/8” 尖头	Braun	NO-052-110-PMK
解剖镊，长度95 mm，3 3/4" 尖头	Braun	PO-022-001-PMK