利用双相循环流动系统对真菌生物膜发育进行实时成像与定量分析

摘要

我们描述了一种用于在流动条件下实时成像真菌生物膜形成的流动装置的组装、操作和清洗方法。同时，我们还提供并讨论了用于分析所获取图像的定量算法。

摘要

在口咽念珠菌病中，念珠菌属（Candida）的成员必须在唾液流动的作用下黏附于口腔黏膜表面并生长。尽管已有用于流动条件下生长的模型，但许多此类系统价格昂贵，或无法在细胞处于流动状态时进行成像。我们开发了一种新型装置，可实现对白色念珠菌（Candida albicans）细胞在流动条件下实时生长与发育过程的成像。本文详细描述了该流动装置的组装与使用方案，以及所生成数据的量化方法。我们能够量化细胞在载玻片上的黏附与脱离速率，并测定随时间推移载玻片上生物量的变化。该系统成本低廉且用途广泛，可兼容多种类型的光学显微镜，包括价格较低的台式显微镜，并且相较于其他流动系统，能够支持更长时间的成像。总体而言，这是一种低通量系统，可提供关于真菌物种在流动条件下生物膜生长的高分辨率实时信息。

引言

白色念珠菌 (C. albicans是一种人类机会性真菌病原体，可感染多种组织类型，包括口腔黏膜表面，引起口咽念珠菌病，导致患者生活质量下降¹生物膜形成是病原体致病过程中的一个重要特征 C. albicans，且已有大量研究探讨其形成与功能 C. albicans 生物膜^2,3,4,5，其中许多研究采用静态（无流动）条件进行 体外 模型。然而， C. albicans 必须在口腔内唾液流动的条件下黏附并生长。已开发出多种流动系统，以实现活细胞成像^6,7,8,9,10这些不同的流动系统设计目的各异，因此每种系统都有其各自的优势与局限性。我们发现，许多适用于 白色念珠菌 成本高昂，需要复杂的加工部件，或在流体流动过程中无法成像，必须在成像前停止流动。因此，我们开发了一种新型流动装置用于研究 C. albicans 流动条件下的生物膜形成¹¹在设计我们的流动装置时，我们遵循了以下主要考虑因素。首先，我们希望能够在无需使用荧光标记细胞的情况下，实时定量分析生物膜生长和发育的多个方面（从而便于我们轻松研究突变菌株和未经修饰的临床分离株）。其次，我们希望所有组件均可商业采购，且几乎无需或完全无需修改即，无需定制加工），使他人更容易重现我们的系统，并便于维修。第三，我们希望在相对较高的流速下仍能实现较长时间的成像。最后，我们希望在细胞于流动条件下附着到基底一段时间后，能够在不引入新细胞的情况下，对生物膜的生长进行长时间的监测。

这些考虑促使我们开发了如图1所示的双烧瓶循环流动系统。两个烧瓶使我们能够将实验分为两个阶段：一个是从接种细胞的附着烧瓶中取液的附着阶段，另一个是使用无细胞培养基继续生物膜生长而不添加新细胞的生长阶段。该系统设计为与显微镜的培养箱配合使用，其中载玻片及前端管路（2至5， 图1）置于培养箱内，其余组件则放置在显微镜外部的一个大型次级容器中。此外，附着烧瓶中使用带温度探针的加热磁力搅拌器，以维持真菌细胞在37 °C。由于系统为循环流动，可在流动条件下实现持续成像（根据条件不同可持续超过36小时），并适用于大多数标准显微镜，包括正置或倒置的台式显微镜。本文将介绍该流动装置的组装、操作和清洗方法，并提供一些基本的ImageJ定量分析算法，用于实验后对视频进行分析。

方案

1. 组装流动装置

1. 根据材料表中列出的部件，结合下文讨论的注意事项，按照图1中的示意图进行配置。
   注意：为方便起见，将流动装置分为两个部分，绿色部分（从培养液瓶到载玻片之间的上游部分）和橙色部分（从载玻片到培养液瓶之间的下游部分）。
   1. 确保流动装置的所有部分均密封不漏气，仅培养液瓶（图1，1）除外。为此，在组装时，除脉动阻尼器（PD）和2 µm滤瓶（FB）外，所有带外螺纹的连接处均应缠绕生料带；脉动阻尼器和滤瓶无需生料带，因其橡胶垫圈可保证气密性。
   2. 在正常运行期间承受正压的每个带卡箍接头处（即泵的下游侧），均应安装耳夹。
   3. 使用颜色编码的实验室胶带对阀门位置进行标记（A代表连接，G代表生长），并标记泵的位置、载玻片连接位置以及0.2 µm滤器连接位置。
   4. 根据流动系统与显微镜之间的距离确定所用管路的长度，需注意泵下游至培养液瓶之间的所有管路（橙色部分的大部分）应置于二级 containment 装置内。在载玻片上游（最好包括气泡捕集器）额外预留约1 m的管路，以便放置于显微镜培养箱内，从而确保到达载玻片的培养液处于正确温度。
   5. 将气泡捕集器尽可能靠近载玻片放置，实验期间最好将其置于培养箱内部（气泡常沿管壁形成）；但需注意，气泡捕集器必须连接真空源才能正常工作。
   6. 确保滤瓶（FB）与0.2 µm一次性滤器之间的管路长度约为0.5 m。
   7. 在每个培养液瓶中加入一根长约2 cm的磁力搅拌子。
   8. 准备一些管夹作为关闭阀使用（可用止血钳代替）。
   9. 为便于操作，将流动装置整体置于一个可高压灭菌的篮子中。建议使用一个较大的篮子内嵌一个较小的篮子，以便于绿色部分和橙色部分的分离。
   10. 对于连接用培养液瓶，使用直径4 mm的钻头在橡胶塞上额外钻一个孔，用于插入热敏探头（注意避免与其他孔贯通）。为将管路穿过端口，可用镊子将管路推入；穿过之后，夹紧管路以固定其位置，然后将镊子抽出。
       注意：若无法在橡胶塞上增加额外孔，可使用带四孔螺口盖的广口螺口瓶替代原培养液瓶和橡胶塞。
2. 流动系统完全组装完成后，关闭绿色和橙色两侧生长培养液瓶的阀门。使用连接连接瓶的管路和量筒中的水，按照制造商说明书校准蠕动泵。

2. 进行实验

1. 实验前一天，开始将显微镜培养箱预热至 37 °C，并准备一管真菌菌株的过夜培养物（无需荧光标记）。
2. 收集一次性组件和泵，并置于无菌生物安全柜中。
3. 从流动装置上取下气泡捕集器和温度探头，并将其放入生物安全柜中。
4. 如有必要，解开并整理管路。
5. 将流动装置（包括搅拌子）进行高压灭菌 30 分钟以确保无菌；完成后转移至生物安全柜中。
6. 按照图1所示，连接气泡捕集器、温度探头以及所有一次性组件（载玻片除外）。
   1. 对于 0.2 µm 滤器（图1，11），从 1 mL 注射器上取下活塞，使其作为“适配器”。将来自 FB 的管路强行插入该端，并将 0.2 µm 滤器连接至通向生长瓶的管路。
   2. 在连接前，在载玻片适配器的接头处涂抹硅基真空润滑脂（注意不要将润滑脂沾到内部），这有助于防止空气泄漏进入系统。
7. 在连接瓶中加入 100 mL 含 1% (w/v) 酵母提取物、2% (w/v) 蛋白胨和 2% (w/v) 葡萄糖的 YPD 培养基，在生长瓶中加入 200 mL YPD 培养基。确保绿色侧管路末端浸入各瓶中的培养基内。
8. 确保所有阀门均处于打开状态。将气泡捕集器连接至真空源，并将泵连接至气泡捕集器下游的绿色侧管路。
9. 以 3.3 mL/min 的流速泵送液体，完全充满绿色侧管路，然后排出并弃去约 1–2 mL 培养基，因为最初几毫升液体中常含有死细胞或随机杂质。继续操作前，确保绿色侧管路中充满培养基，且气泡捕集器下游无气泡。
10. 用 YPD 培养基填充通道载玻片和储液槽，注意避免引入气泡。
11. 将载玻片连接至流动装置，并继续泵送液体，在橙色侧形成约 0.5 m 的缓冲段，以防止回流时意外将空气困在载玻片中。
12. 准备将流动装置转移至显微镜：夹闭气泡捕集器的进样口和出样口，同时夹闭绿色侧和橙色侧连接瓶的阀门。确保 PD 和 FB 的螺帽拧紧，因为在高压灭菌过程中它们可能会松动。
13. 断开泵与管路的连接以便运输。然后将所有组件（包括加热磁力搅拌器）移至显微镜附近的次级容器中。
14. 准备流动装置进行成像。
    1. 将温度探头连接至加热磁力搅拌器，并开始将连接瓶加热至 37 °C。以 300 rpm 搅拌培养基，并在整个实验过程中保持此转速。
    2. 将载玻片安装到显微镜上，必要时使用胶带牢固固定。
    3. 将气泡捕集器连接至真空源（暂不松开夹子）。
    4. 按照图1所示位置，将泵连接至流动装置。
    5. 以 3.3 mL/min 的流速启动泵，运行约 5–10 秒后，松开气泡捕集器的进样口/出样口夹子。
    6. 在连接瓶加热过程中保持泵持续运行。待培养基在整个流动系统中循环后，检查系统是否正常工作。
       1. 检查泵上游接头处是否有空气泄漏（少量气泡形成属正常现象），或下游是否有液体泄漏。
       2. 检查生长培养基瓶、PD 和 FB 的进样管是否均有培养基滴落（若无，则可能表明滤器堵塞或耳夹过紧）。
       3. 使用显微镜检查通道载玻片上是否有附着或滚动的细胞。若细胞数量过多，可能提示设置过程中发生污染，或气泡捕集器的聚四氟乙烯（PTFE）膜需要更换。
15. 当连接瓶和培养箱均达到 37 °C 时，向连接瓶中加入适量的真菌细胞过夜培养物，使终浓度达到 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
    注：所需加入体积（µL）可通过以下公式计算：
    
16. 等待 15 分钟，使细胞适应环境。
17. 打开绿色侧和橙色侧连接瓶的阀门，同时关闭两个生长瓶的阀门，以启动细胞流动。
18. 等待约 5 分钟，使细胞到达载玻片，并进行显微镜初步聚焦（此时间可能需根据绿色侧管路长度调整）。在此期间，将显微镜调整为与之前实验相同的成像参数。若为首次运行，请按以下步骤操作：
    1. 切换至低倍空气物镜。
    2. 找到并聚焦于一个附着细胞或小芽生细胞。
    3. 调节聚光镜实现科勒照明，然后切换至暗场模式。
    4. 将曝光时间设为 300 ms。
    5. 调节照明强度，使小细胞在背景中微弱但清晰可见（对于芽生子细胞，信噪比约为 7–8 是合理值）。记录/标记该照明强度，供后续实验参考。
    6. 设置软件在 2 小时内每 2 分钟采集一次图像。
19. 开始附着阶段的图像采集。约 5 和 10 分钟后返回检查焦点是否保持。若未保持，应在下一张图像采集后立即尝试重新调焦。
20. 附着阶段结束后，立即保存文件，然后打开绿色侧和橙色侧生长瓶的阀门，同时关闭两个连接瓶的阀门。注意：若任何阀门位于培养箱内部，应避免碰撞载物台。
21. 从加热磁力搅拌器上拔下温度探头。
22. 将连接瓶从加热磁力搅拌器上取下，并将生长瓶放置其上。
23. 设置软件在 22 小时内每 15 分钟采集一次图像，并开始生长阶段的图像采集。通常无需重新调焦，但强烈建议在数小时后检查流动装置。
    1. 检查泵上游接头处是否有空气泄漏（少量气泡形成仍属正常），或下游是否有液体泄漏。
    2. 检查生长培养基瓶、PD 和 FB 是否均有培养基滴落（若无，则可能表明滤器堵塞、耳夹过紧，或若所用细胞易成团，则可能在接头处发生堵塞）。
    3. 检查 FB 中的液位。若培养基接近瓶顶（高于滤器顶部超过 1.5 cm），应拧紧两个螺帽（切勿松开，因该瓶处于加压状态）。若无法进一步拧紧，可继续实验（但可能导致泄漏），并在下次清洗后更换 PD 和 FB 上的橡胶垫圈。
24. 生长阶段图像采集完成后，保存文件，然后打开绿色侧和橙色侧连接瓶的阀门（橙色侧压力释放时可能发出声响）。向上提起来自两个培养基瓶的绿色侧管路，使其至少高出液面数厘米。以高速（约 100 mL/min 或按住泵上的快进按钮）运行泵，将管路中所有培养基排出，以便于后续清洗。排空后，断开流动装置与泵的连接，并将其从显微镜上取下。

3. 清洁流体装置

1. 移除所有不可高压灭菌的组件（一次性组件、气泡捕集器和温度探头），并将流动装置高压灭菌30分钟。丢弃使用过的一次性组件，用70%乙醇清洁探头，并将气泡捕集器放置一旁备用。
2. 高压灭菌完成后，丢弃培养基，并冲洗培养瓶后放置一旁。然后重新连接气泡捕集器，连接一个ibidi通道载玻片（可重复使用，用于清洗），并将流动系统连接至泵，位置如图1所示。
3. 夹闭橙色侧生长瓶的阀门。
4. 将约200 mL未稀释的漂白剂倒入烧杯中。将橡胶塞浸入漂白剂中，然后以高速启动泵，使漂白剂在整个流动装置中循环（所有滤器除外）。当系统充满漂白剂后，停止泵的运行，因为长时间高速运行会磨损或损坏管路。
5. 漂白15分钟后，将橡胶塞从烧杯中提起并悬于上方，再次启动泵，以清除流动装置中的漂白剂。
6. 用过量的水代替漂白剂，重复步骤3.4和3.5两次，以冲洗流动系统。在此期间，仅用水清洗滤器，因为其他清洗剂会腐蚀或堵塞滤器。
   1. 将通常连接至0.2 µm培养基滤器（来自2 µm FB）的管路连同步骤3.6中的橡胶塞一起放入盛水的烧杯中。
   2. 断开连接至20 µm在线滤器入口端的管路，该连接通常可克服耳夹轻松拔开。
   3. 使用真空过滤瓶和一段较长的管路，穿过一个备用的三孔塞，构建一个可连接至流动装置的真空系统。
   4. 将该真空系统连接至20 µm滤器的入口端，启动真空泵；这将使水流反向通过滤器，从而清除残留的死亡细胞。
   5. 至少使200 mL水通过滤器，然后将管路从水中取出，排空滤器管路中的水。
   6. 断开真空系统与20 µm滤器的连接，并将滤器重新接回其正常管路。

4. 视频的量化分析

注意：所有文件均需转换为标签图像文件（TIF）格式才能使用。此外，如上所述，为在不同实验之间进行比较，关键是要使用相同的显微镜和成像参数获取所有图像。

1. 如果尚未安装，请下载并安装 ImageJ。
2. 下载补充的宏文件，并将其放置在 ImageJ\macros 文件夹中。
3. 调整提供的宏：
   1. 在 ImageJ 中打开先前实验中的图像序列，并选择一个含有细胞的时间点。
   2. 通过菜单选择 "Image | Type | 8-bit"。
   3. 通过菜单选择 "Image | Adjust | Threshold"。勾选 "Dark Background" 选项框。将右侧下拉菜单设置为 Red（红色）。
   4. 调整下限值，直到所有细胞均被红色覆盖，且多余噪声最小（允许存在少量非细胞颗粒，这些将在宏处理过程中被去除）。记录此下限值。
   5. 关闭 Threshold（阈值）窗口和已打开的图像。
   6. 通过菜单选择 "Plugins | Macros | Edit"。当提示打开文件时，“向上移动一个文件夹层级”，然后选择 macros 文件夹，并打开流式生物膜定量宏文件。
   7. 将所有 "setThreshold(15, 255);" 中的数值 15 替换为步骤 4.3.4 中确定的值。保存文件并关闭该窗口。
4. 通过菜单选择 "Plugins | Macros | Install"，然后选择流式生物膜定量文件。
5. 现在，在 "Plugins | Macros" 菜单下会出现六个用于不同视频定量分析的新选项。运行 Complete analysis，并在提示时选择附着和生长视频文件，以对获取的数据执行所有可用分析，并自动生成输出文件。

结果

野生型样本的正常过夜延时实验代表性图像 C. albicans 37 °C 下的细胞可见于 图2A 和 补充视频 1图像已进行对比度增强以提高可见性。对原始数据进行了定量分析，代表性图表如下所示。 图2B. 为生成这些图表，首先将数据归一化至成像区域（即，除以总成像面积），并进一步如上所述将脱落量归一化至生物量。此外，附着和脱落显示的是随时间累积的数值，而非由流动生物膜定量宏生成的单帧数值。当图表达到此阶段后，可通过回归分析进行统计比较。

讨论

使用上述流动系统可生成真菌生物膜生长与发育的定量延时视频。为便于实验间的比较，必须确保成像参数保持一致。这包括每次实验均需对显微镜进行科勒照明调节（该过程的详细指南可在线获取）。除成像参数外，在使用流动装置时还需注意一些关键步骤。首先，必须确保在流体流动期间气泡捕集器始终处于真空状态，否则将导致空气经由气泡捕集器被吸入系统。同样地，当气泡捕集器未处于真空状态时即运输流体装置时，入口和出口必须始终保持夹闭状态，否则空气会通过聚四氟乙烯（PTFE）膜渗入。此夹子在气泡捕集器再次置于真空环境之前无需移除。最后，必须密切监测流体装置是否存在潜在堵塞或泄漏。检查系统是否堵塞的最有效方法是观察连接瓶或培养瓶、透析装置（PD）和灌流瓶（FB）的入口处是否有培养基滴下。若系统运行正常，这些位置的培养基滴速应大致相近。若存在堵塞，通常可通过堵塞点上游的管路变得更为僵硬来判断其位置。

获得数据后，我们提供了多种 ImageJ 宏来定量分析视频。这些宏可确定生物膜生长和发育的多个参数，包括生物量的测量值，以及细胞附着到表面或生物膜以及从表面或生物膜脱离的速率。以下提供了所附宏的说明。<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
泵	Cole Parmer	07522-20	6
泵头	Cole Parmer	77200-60	6
管路	Cole Parmer	96410-14	N/A
气泡捕集器接头	Cole Parmer	30704-84	3
用于内径1/4”真空管路的气泡捕集器真空接头	Cole Parmer	31500-55	3
在线过滤器接头（需要4个）	Cole Parmer	31209-40	8,9
橙色端Y型接头	Cole Parmer	31209-55	7
绿色端Y型接头	ibidi	10827	2
* 芯片载玻片	ibidi	80196	4
* 芯片鲁尔接头	ibidi	10802	4
真空辅助气泡捕集器	Elveflow/Darwin microfluidics	KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit	3
培养基瓶	Corning	4980-500	1
0.2 µm 空气过滤器	Corning	431229	1
用于PD和滤瓶的螺纹玻璃瓶（需要2个）	Corning	1395-100	5,10
用于PD和滤瓶的带端口螺帽（需要2个）	Wheaton	1129750	5,10
螺帽式管路连接器	Wheaton	1129814	5,10
管路连接器斜面垫圈	Danco	88579	5,10
管路连接器平面垫圈	Danco	88569	5,10
用于在线过滤器和下游Y型接头的夹具（需要7个）	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	15100002-100	7,8,9
夹具工具	Oetiker/MSC Industrial Supply Company	14100386	N/A
20 μm 在线培养基过滤器	Analytical Scientific Instruments	850-1331	8
10 μm 在线培养基过滤器	Analytical Scientific Instruments	850-1333	9
2 μm 进口培养基过滤器	Supelco/Sigma-Aldrich	58267	10
* 0.22 µm 培养基过滤器	Millipore	SVGV010RS	11
* 0.22 µm 培养基过滤器 “接头”	BD Biosciences	329654	11
橡胶塞	Fisher Scientific	14-131E	1
带外接探头接口的加热磁力搅拌器	ThermoFisher Scientific	88880006	N/A
温度探头	ThermoFisher Scientific	88880147	N/A