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方法文章

利用Southern印迹与聚合酶链式反应鉴定小鼠胚胎干细胞中的同源重组事件

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DOI：

10.3791/58467

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2018年11月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用 Southern 印迹法和/或 PCR 鉴定小鼠胚胎干细胞中同源重组事件的详细实验方案。该方法以采用传统基于胚胎干细胞的同源重组介导靶向技术构建非肌肉肌球蛋白 II 基因替换小鼠模型为例进行说明。

摘要

相较于设计核酸酶在基因组编辑应用中存在脱靶效应以及难以插入较长DNA片段等问题，基于胚胎干细胞（ES细胞）的基因靶向技术不存在这些缺点，已被广泛用于从大片段缺失/插入到单核苷酸替换等多种类型的动物/小鼠基因组修饰。值得注意的是，鉴定获得目标ES克隆所必需的少数同源重组（HR）事件是关键步骤，需要准确且可靠的方法。Southern印迹和/或常规PCR常被用于此目的。本文详细描述了利用这两种方法鉴定小鼠ES细胞中发生的HR事件的操作流程，其中内源性Myh9基因将被编码其他非肌性肌球蛋白重链II（NMHC II）的cDNA打断并取代。Southern印迹的完整流程包括：构建靶向载体、电穿孔转染、药物筛选、ES细胞/克隆的扩增与保存、基因组DNA（gDNA）的制备、酶切与印迹、探针的杂交与洗脱，以及最终在X光胶片上进行放射自显影。PCR则可直接使用已制备并稀释的gDNA进行扩增。为了获得理想结果，Southern印迹所用的探针和限制性内切酶（RE）酶切位点，以及PCR所用的引物均需精心设计。尽管Southern印迹操作耗时且劳动强度大，而PCR结果可能存在假阳性，但Southern印迹结果准确可靠，PCR筛选快速高效，因此这两种方法可单独或联合使用，被大多数实验室广泛采用并参考，用于鉴定ES细胞及基因修饰动物的基因型。

引言

通过同源重组（HR）在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行基因靶向的技术，为解析特定基因突变所引起的细胞效应提供了强有力的工具1,2。该技术的重要性和意义体现在其荣获2007年诺贝尔生理学或医学奖3,4；同时，它也标志着现代基因工程时代的到来5。通过同源重组进行基因靶向，几乎可以对小鼠ES细胞基因组中的任何位点进行改造，范围涵盖从点突变到大规模染色体重排6,7。众所周知，在所谓的基因组编辑工具出现之前，构建基因敲除小鼠必须依赖ES细胞中的基因靶向技术8,9,10。在过去二十年中，已有超过5000种基因靶向小鼠通过该方法被成功构建，用于人类疾病建模或基因功能研究11。目前，已建立全基因组范围的基因敲除计划，向科学界分发基因靶向载体、靶向修饰的ES细胞克隆以及活体小鼠2,12,13,14,15。毫无疑问，基于ES细胞的同源重组介导的基因靶向技术极大地推动了我们对基因在生理或病理过程中所发挥作用的理解。

由于同源重组（HR）在哺乳动物细胞中是一种相对罕见的事件16,17，小鼠胚胎干细胞（ES细胞）基因打靶后的关键且必要的下一步是分析大量ES细胞克隆，以鉴定出少数由打靶载体通过同源重组产生的突变克隆18。鉴定同源重组事件的金标准方法包括Southern印迹法和PCR19,20。这些方法的优点在于，Southern印迹法能够识别正确打靶的ES克隆，并允许研究人员分析基因打靶事件的结构，例如验证载体是否为单拷贝插入；而基于PCR的策略则可实现对同源重组事件的快速筛选21,22。尽管这些方法存在耗时较长和可能出现假阳性等缺点，但联合使用这两种方法已被大多数实验室广泛接受并应用于鉴定同源重组事件，特别是在ES细胞中，用于制备基因修饰动物。

哺乳动物中存在三种非肌球蛋白II（NM II）异构体，每种均由两条相同的非肌球蛋白重链II（NMHC II）和两对轻链组成；其中重链分别由三个不同的基因（命名为 Myh9、Myh10 和 Myh14）编码，这三种异构体分别称为 NM II-A、II-B 和 II-C23已有研究表明，至少非肌肉肌球蛋白 II-A 和 II-B 的同工型对小鼠发育至关重要，因为 体内 这些亚型的缺失会导致胚胎致死24,25,26为解决这一问题并深入了解非肌肉肌球蛋白II-A和II-B亚型在小鼠发育后期的亚型特异性功能，采用基于胚胎干细胞的同源重组介导的基因靶向技术，通过基因替换策略构建了一系列小鼠模型27在筛选目标ES克隆的过程中，采用了Southern印迹法和PCR方法，这些方法被证明高效且可靠。27,28.

本文旨在详细描述Southern印迹和PCR技术，包括靶向载体、探针和引物的设计，实验操作步骤，以及通过鉴定胚胎干细胞中同源重组事件的发生来创建基因替换型NM II小鼠模型的代表性结果分析。本文所展示的这两种方法的实验方案也可用于鉴定基因修饰细胞或动物的基因型。

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方案

1. 靶向载体、Southern 印迹探针及 PCR 引物的设计

  1. 在本研究中应用的基因敲除/敲入实验中，选择 Myh9 基因的第一个编码外显子（外显子2）作为破坏或插入位点。
  2. 从 genome.ucsc.edu 网站获取 Myh9 外显子2上下游各5 kb的DNA序列。
  3. 使用 pDRAW 软件分析该10 kb区域内具有1–2个切割位点的限制性内切酶（REs）的酶切图谱，以确定适用于基因组DNA Southern印迹分析的合适限制性内切酶。
    注：Dra I 满足该条件，因此被选中用于此目的。
  4. 选择紧邻 Myh9 外显子2上游的4 kb片段作为左同源臂（LHA），下游紧接的1.7 kb片段作为右同源臂（RHA）；根据上述分析，选择位于LHA上游5'端1 kb处的片段作为Southern印迹用左探针（LP），以及位于RHA下游3'端1.2 kb处的片段作为右探针（RP）。
  5. 使用 Primer3 程序设计用于通过PCR扩增上述四个DNA片段的正向和反向引物。设计一对引物，其中正向引物位于筛选标记新霉素抗性基因（P1）的3'末端附近，反向引物位于RHA外侧（P2）。
    注：该引物对将用于通过PCR鉴定靶向的ES克隆29。
  6. 访问 bacpac.chori.org 网站查找覆盖小鼠 Myh9 基因位点的129Sv BAC克隆（注：优先选择同源背景的DNA）。使用适用于纯化大片段DNA的试剂盒，按照制造商提供的说明提取BAC DNA。
    注：纯化的BAC DNA将用作PCR扩增的模板。
  7. 绘制靶向载体、探针和引物的示意图，以汇总上述信息。

2. Southern印迹靶向构建体和探针的制备，以及PCR引物的设计与准备

  1. 订购上述PCR引物，并将其溶解至20 µM的浓度。
  2. 在PCR反应体系中扩增同源臂和探针，反应体系包括：1 µL正向引物、1 µL反向引物、1 µL BAC DNA（50 ng）作为模板、5 µL Pfu缓冲液、1 µL Pfu ultra DNA聚合酶，加H2O至终体积50 µL。在PCR仪中按以下条件进行扩增：95 °C预变性3 min；95 °C变性30 s；60 °C退火30 s；72 °C延伸（1 kb/min）；共30个循环；最后72 °C延伸10 min。
  3. 使用PCR产物纯化试剂盒，按照制造商提供的操作说明纯化PCR产物，并用40 µL H2O洗脱DNA片段。将纯化后的PCR产物在含有5 µL 10×限制性内切酶缓冲液、2.5 µL RE1和2.5 µL RE2以及洗脱所得DNA的反应体系中，于37 °C消化2小时。通过1% DNA琼脂糖凝胶电泳分离目标DNA条带，在紫外光下切下含有目标DNA的凝胶，使用DNA凝胶回收试剂盒按照制造商说明从凝胶中纯化目标DNA片段，并用40 µL H2O洗脱DNA片段。
  4. 按照已扩增并纯化的RHA、LHA及替换表达盒（或多个替换表达盒）从其他载体上释放出的顺序，将其克隆至mpNTKV-LoxP载体中，以获得最终的靶向构建体。将扩增并纯化的探针DNA片段克隆至T-easy载体中。
  5. 通过测序确认所有克隆DNA片段的核苷酸序列27,28。

3. 靶向载体的制备、胚胎干细胞的电穿孔及干细胞克隆的扩增

  1. 根据制造商提供的说明书，使用质粒大提试剂盒制备每种靶向构建体。通过在 400 µL 反应体系中用 Not I 酶切质粒来线性化每种构建体质粒，反应体系包括 40 µL Not I 10x 缓冲液、10 µL Not I 酶、100 µg DNA，并用 H2O 补足至 400 µL，于 37 °C 过夜孵育。
  2. 纯化线性化的靶向构建体。
    1. 用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）对酶切后的反应液进行一次抽提，并在 2,000 x g 离心 10 分钟。
    2. 将上清转移至新的 1.5 mL 离心管中，按体积比加入 2.5 倍体积乙醇和 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2）沉淀 DNA，并在 2,000 x g 离心 10 分钟。
    3. 弃去上清，用 1 mL 75% 乙醇洗涤 DNA 沉淀一次，并在 2,000 x g 离心 5 分钟。
    4. 弃去上清，将 DNA 沉淀在空气中干燥 5 分钟。
    5. 将线性化的 DNA 沉淀溶解于无菌 TE 缓冲液中，终浓度为 1 µg/µL。
  3. 将每种线性化的靶向构建体 50 µg 与 0.5 x 107 个 ES 细胞混合。在 320 V 和 250 µF 条件下进行电穿孔。将电穿孔后的 ES 细胞接种至含有新霉素抗性 MEF 饲养层的培养皿中。
  4. 24 小时后，更换为含 400 µg/mL G418 和 200 µM 更昔洛韦的 ES 细胞培养基，继续培养 4–5 天，每天更换培养基。将药物抗性 ES 克隆挑取至 48 孔板中。
    注：通常每种构建体使用四块 48 孔板。
  5. 对 48 孔板进行复制。
    注：其中一套用于冷冻保存，另一套用于基因组 DNA 制备。

4. 基因组DNA的制备及限制性内切酶消化

  1. 使用商业试剂盒（基因组DNA纯化试剂盒）并稍作修改，从ES细胞中制备基因组DNA（gDNA）。
    1. 移除ES细胞培养基，直接向孔中加入500 µL含RNaseA的细胞核裂解液，以裂解细胞。
      注意：细胞裂解物可于-80 °C保存，或立即进行处理。
    2. 反复吹打数次以充分裂解细胞，并将裂解物转移至洁净的1.5 mL离心管中。
    3. 向1.5 mL离心管中加入相当于样品体积三分之一的蛋白质沉淀液，剧烈涡旋振荡20秒，将样品置于冰上冷却5分钟，然后在2,000 × g 离心5分钟。将上清液转移至另一只含有等体积异丙醇的洁净1.5 mL离心管中，轻轻混匀溶液。（此时可见白色丝状沉淀。）在2,000 × g 离心1分钟，弃去上清液。
    4. 用1 mL室温的70%乙醇洗涤gDNA沉淀，在2,000 × g 离心1分钟，小心吸除上清液，然后将gDNA沉淀在空气中干燥3分钟。
    5. 用100 µL DNA重悬液溶解gDNA，随后在65 °C孵育1小时，或在4 °C过夜。
    6. 将gDNA储存于2–8 °C。
  2. 使用预先设计的限制性内切酶Dra I消化gDNA。按以下组分配制30 µL的酶切反应体系：3 µL 10× Dra I缓冲液、3 µL Dra I酶、10 µg gDNA/样品，用H2O补足至30 µL，于37 °C孵育过夜。
  3. 取5 µL酶切产物进行DNA凝胶电泳，检测酶切是否完全，随后加入3 µL 10× DNA上样缓冲液，用于下一步操作。

5. Southern 印迹与 PCR 鉴定

  1. Southern 印迹杂交筛选
    1. 通过电泳分离经消化的基因组 DNA，并将其转移至膜上。
      1. 制备含溴化乙锭（EB）的 1% 琼脂糖凝胶，加入第 4.3 步的样品及 1 kb DNA 标准分子量标记，在低电压（30–40 V）下过夜电泳。
      2. 取出凝胶，电泳后使用 DNA 凝胶成像系统拍照，检查经消化和分离的基因组 DNA 是否呈现弥散条带状图像。
      3. 将凝胶置于盛有 0.2 N HCl 溶液的托盘中，室温下轻轻振荡 20 分钟。
      4. 将凝胶转移至 DNA 变性液中，室温下轻轻振荡 20 分钟。
      5. 将凝胶转移至 DNA 中和液中，室温下轻轻振荡 20 分钟。
        注意：此步骤后凝胶易碎，必须小心操作。
      6. 使用快速向下转移系统将 DNA 从凝胶转移至膜上。按照制造商提供的说明组装 TurboBlotter 及印迹叠层。
        注意：使用 10x 或 20x 盐水-柠檬酸钠（SSC）溶液作为转移缓冲液。通常，3 小时的转移时间足以将 95% 的基因组 DNA 从凝胶转移至膜上；然而，延长转移时间无不良影响。
      7. 取出膜，用 2x SSC 溶液洗涤 1 分钟，用纸巾吸干液体，然后使用紫外交联仪将 DNA 与膜交联。
        注意：膜可在 4 °C 下保存一周。
    2. 用放射性标记 DNA 探针。
      1. 按照制造商提供的操作说明，使用质粒小量提取试剂盒纯化探针质粒。
      2. 在包含 5 µL EcoR I 缓冲液、2 µL EcoR I 酶、20 µg 质粒 DNA 和加 H2O 至 50 µL 的反应体系中，通过 EcoR I 消化从质粒载体中释放探针 DNA 片段，反应 2 小时。
      3. 运行 1% DNA 凝胶以分离探针 DNA 片段与载体，按照制造商提供的说明使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化探针 DNA 片段。
      4. 取 1 µL DNA 溶液，使用分光光度计在 260/280 nm 波长下测定探针 DNA 片段的浓度。
      5. 在 1.5 mL 离心管中加入 40 ng 探针 DNA 并用 45 µL TE 缓冲液稀释，煮沸 3 分钟，短暂离心，然后将离心管置于冰上 2 分钟。
      6. 将热变性的探针 DNA 加入含有即用型 DNA 标记微珠（-dCTP）的离心管中，用移液器吹打混匀，加入 5 µL [α32P]dCTP，37 °C 孵育 15 分钟。
      7. 按照制造商说明使用 G-50 微柱纯化标记后的探针，并使用液体闪烁计数器测定放射性活度（可选）。
    3. 用标记探针杂交膜。
      1. 预杂交膜。
        1. 将杂交液在 42 °C 预热 30 分钟。在 50 mL 离心管中，将 20 mL 预热的杂交液与 200 µg 煮沸的鲑精 DNA 混合。
        2. 将膜放入杂交管中，加入混合好的预杂交液，置于杂交炉中（设置为滚动且温度为 42 °C），预杂交 30 分钟。
      2. 用标记探针杂交膜。
        1. 取出杂交管，将预杂交液倒入 50 mL 离心管中；加入第 5.1.2.7 步中变性处理的探针（100 °C 加热 3 分钟），轻轻混匀。
          注意：尽量减少气泡产生。
        2. 将混合液重新倒回杂交管中，在 42 °C 下过夜进行杂交。
    4. 洗涤膜以去除未杂交的探针。
      1. 将膜放入盛有 1x SSC + 0.1% SDS 的托盘中，在 55–60 °C 下轻轻振荡 10 分钟。
      2. 将膜转移至盛有 0.5x SSC + 0.1% SDS 的另一托盘中，在 55–60 °C 下轻轻振荡 10 分钟。
      3. 使用便携式盖革计数器检测膜上的放射性，判断是否需要进行第三次洗涤。
    5. 将膜上的放射性信号曝光至 X 射线胶片。
      1. 去除洗涤后膜上的液体。
      2. 用塑料膜包裹膜，并固定于曝光盒中。
      3. 在暗室中将膜与两张 X 射线胶片接触曝光。
      4. 将曝光盒置于 -80 °C 过夜或更长时间。
    6. 显影胶片以观察结果。根据探针检测到的 DNA 条带大小，评估相应 ES 克隆是否为具有靶向重组的所需克隆。
    7. 在剥离已使用的探针后，可使用另一探针对同一膜重新杂交：取出已使用的膜，用洁净 H2O 洗涤一次，然后在剥离液（55% 甲酰胺，2% SSPE，1% SDS，H2O）中 65 °C 轻轻振荡孵育 1–2 小时。
  2. PCR 鉴定
    1. 在 50 µL 反应体系中进行所需 ES 克隆的 PCR 鉴定，体系包括：5 µL 10x PCR 缓冲液、2 µL 50 mM MgSO4、1 µL 10 mM dNTP、1 µL 20 µM 正向引物、1 µL 20 µM 反向引物、1 µL 高保真 Platinum Taq 酶、基因组 DNA（约 100 ng）以及加 H2O 至 50 µL。
    2. 采用以下 PCR 反应条件：94 °C 初始变性 3 分钟；30 个循环：94 °C 变性 30 秒，60 °C 退火 30 秒，68 °C 延伸 132 秒；最后 68 °C 延伸 10 分钟。
    3. 通过 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。
    4. 将具有预期大小的 PCR 片段克隆至 T-easy 载体中并测序，以确认是否存在靶向载体的部分序列。

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结果

本文详细描述了一种Southern印迹和PCR的实验方案，该方案用于鉴定在小鼠ES细胞中发生的同源重组（HR）事件，从而利用基于ES细胞的HR介导的靶向技术构建非肌肉肌球蛋白II（NM II）基因替换小鼠模型。尽管Southern印迹、PCR以及传统的基因靶向技术已广泛应用数十年，但其成功应用仍需精心设计。至少需要考虑以下几个方面：长臂和短臂的长度、探针的位置与长度、用于切割基因组DNA的合适限制性内切酶（REs），以及PCR引物的设计，如图1所示，这些因素均有助于后续分析。作为Southern印迹的重要步骤之一，制备并消化后的基因组DNA需在DNA凝胶上进行电泳分离，以便探针检测。由于基因组DNA被切割成大量不同长度的片段，在DNA凝胶上呈现弥散状条带，表明基因组DNA已被完全消化，如图2所示。在Southern印迹的最后一步中，放射性标记探针与目标DNA片段杂交所产生的信号会显现在X光胶片上，这些信号反映了ES克隆中是否发生了HR事件，从而判断某一E...

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讨论

目前，由于脱靶效应以及难以插入较长的DNA片段等问题，基因组编辑所用的定制核酸酶仍无法取代基于胚胎干细胞（ES细胞）的基因靶向技术30,31。作为鉴定小鼠ES细胞中同源重组（HR）事件的金标准方法，本报告为该领域提供了Southern印迹和PCR的详细实验方案。我们通过分析一系列载体靶向后的小鼠ES细胞单克隆，验证了这些方法的可靠性。利用这些方法筛选出的阳性ES细胞克隆已成功用于构建相应的小鼠模型27。

尽管已有其他技术用于靶向ES克隆的筛选19,32，但Southern印迹和PCR方法仍无法被后续建立的技术完全取代32，因为这些初始技术具有更长的应用历史，已被科学界广泛接受并验证，被大多数生物实验室常规使用，且是其他技术发展的基础。尤为重要的是，Sout...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了中国国家自然科学基金面上项目（批准号 31571432）、中国湖南省自然科学基金（批准号 2015JC3097）以及中国湖南省教育厅教育局科研基金（批准号 15K054）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BAC 克隆BACPAC资源中心（BPRC）bMQ-330E21
QIAGEN 大片段构建试剂盒QIAGEN12462
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒QIAGEN28704
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒QIAGEN27104
QIAGEN 质粒大提试剂盒QIAGEN12963
PfuUltra 高保真 DNA 聚合酶安捷伦600382
T-easy 载体PromegaA1360
细胞核裂解液PromegaA7941
蛋白质沉淀溶液PromegaA7951
DNA变性液VWR351-013-131
DNA中和溶液VWR351-014-131
Ready-To-Go DNA 标记微珠（-dCTP）VWR27-9240-01
UltraPure SSC，20×赛默飞世尔科技15557036
UltraPur 酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1, v/v)Thermo Fisher15593031
G418赛默飞世尔科技10131035
鲑鱼精子DNA溶液赛默飞世尔科技15632011
Platinu Taq DNA聚合酶 高保真赛默飞世尔科技11304029
非 I赛默飞世尔科技ER0592
Dra I赛默飞世尔科技ER0221
EcoR I赛默飞世尔科技ER0271
更昔洛韦SigmaG2536
Whatman TurboBlotter 转印系统，大型试剂盒Fisher Scientific09-301-188
[α32P]dCTPPerkinElmerNEG013H100UC
ProbeQuan G-50 微型纯化柱GE Healthcare28-9034-08
Hybrisol I 杂交溶液MilliporeS4040
柯达X射线胶片Z&Z 医疗844 5702

参考文献

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