利用天然绿色凝胶电泳分离菠菜类囊体蛋白复合物及通过时间相关单光子计数进行条带表征

摘要

本文介绍了一种通过天然绿色凝胶电泳分离可溶性类囊体复合物的实验方案。随后利用时间相关单光子计数法（TCSPC）对绿色凝胶条带进行表征，并提供了数据分析的基本步骤。

摘要

光合作用的光反应由类囊体膜上的一系列色素蛋白复合体执行。由于存在使光合作用适应不断变化的环境条件的调节机制，这些复合体的化学计量比和空间排布在长时间和短时间尺度上均具有高度动态性。即， 非光化学淬灭、状态转换以及长期响应）。历史上，这些过程主要通过叶绿素荧光的变化进行光谱学描述，光谱学至今仍是监测光合作用参数的重要方法。然而，可用于直观呈现潜在蛋白复合物动态变化的方法十分有限。本文介绍一种快速、简便的高分辨率分离与可视化类囊体复合物的方法——天然绿色凝胶电泳。该方法结合时间相关单光子计数技术，可对绿色凝胶中分离出的条带进行叶绿素荧光特性的详细表征。

引言

光合生物必须不断调整其生理状态以适应变化的环境条件，从而最大化其生产力并成功与邻近生物竞争¹这一点在负责光合作用光反应的机制中尤为突出，因为环境光强在阴影与全日照之间可能相差三个数量级。此外，干旱、低温或高温胁迫等环境因素会减少二氧化碳的可利用性，从而限制碳固定——而碳固定正是光反应产物的天然电子受体。因此，植物必须尽可能高效地捕获和利用太阳辐射，同时保留必要时耗散多余光能的能力。尽管如此，光氧化损伤在各种光照条件下仍会常规发生。^2,3，若无法有效管理吸收的激发能，则可能导致细胞发生灾难性损伤甚至死亡。已知存在多种适应性机制，可使光合作用装置既能响应环境条件的持续变化，也能应对短暂的波动。即， 在长时间尺度和短时间尺度上⁴这些包括长期响应（LTR）和非光化学淬灭（NPQ）。NPQ 本身被认为至少包含三种组分现象，即状态转换（qT）、快速诱导的能量淬灭（qE）和光抑制（qI）。⁵.

这些过程最初主要是根据光谱现象被观察和定义的[例如， NPQ 指观察到的叶绿素荧光下降（叶绿素荧光淬灭），这种下降并非由光化学反应速率的增加引起⁶术语 "状态转换" 同样指光系统I（PSI）和光系统II（PSII）荧光相对量的观测变化⁷尽管光谱技术（尤其是脉冲振幅调制（PAM）荧光光谱法）使得对这些现象的定量分析成为可能，并且仍是观测和解析光合作用过程的重要手段 体内，需要大量的生物化学研究来阐明这些光谱学观察结果背后的机制。例如，状态转换涉及LHCII蛋白在STN7激酶和TAP38/PPH1磷酸酶作用下的磷酸化/去磷酸化循环^8,9,10该循环通过将部分LHCII三聚体从PSII转移到PSI，调节LHCII天线在两个光系统之间的物理分布，从而改变光系统的吸收截面。^11,12NPQ 的 qE 组分通过紫黄质/玉米黄质环氧化/去环氧化循环以及 PsbS 蛋白的作用，迅速将过剩的激发能转化为热能。PsbS 蛋白在此过程中的确切作用目前尚未完全阐明¹³NPQ 的 qI 组分即光抑制，通常归因于 PSII 中 D1 蛋白的损伤。恢复完全的光合能力需要复杂的修复过程以修复受损的 PSII 光反应中心。PSII 修复循环包括 PSII 复合物从基粒类囊体堆栈中迁移出来、复合物的拆解、受损 D1 蛋白的替换、PSII 复合物的重新组装，以及将修复后的 PSII 复合物重新移回基粒类囊体堆栈¹⁴光抑制和PSII光损伤的确切性质仍是 intensely scrutinized 的研究课题¹⁵.

研究状态转换或PSII修复等现象的困难部分源于目前尚无一种简单的方法来直观展示复杂生化系统的机制。经典生化方法在理解某一过程时，通常首先将其组分分离，以便对各组分进行独立表征。天然凝胶电泳技术源于20世纪80年代成功采用较为制备性的方法（即蔗糖梯度离心和层析技术）从类囊体膜中分离并表征光系统复合物的努力¹⁶。为温和地将天然复合物从类囊体膜中溶解而开发的去垢剂体系很快被应用于电泳分离方法，其中尤以Allen和Staehelin¹⁷以及Peter和Thornber¹⁸的工作最为突出，由此发展出了天然绿色凝胶电泳技术。尽管天然PAGE只是实验工具箱中众多技术之一，但它具备多项优势特性，使其在光合作用研究中被广泛应用。天然PAGE相对快速且简便，对专用设备要求较低，同时能够实现大量类囊体复合物的高分辨率同步分离。这使得天然PAGE成为研究类囊体动态变化的便捷工具；当其与第二维的标准PAGE以及多种去垢剂和缓冲体系联用时，更成为一个可用于发现和表征新型类囊体复合物的多功能系统。

尽管如此，天然绿色凝胶电泳技术一直被认为是一种不可靠的方法，尤其是在经验不足的操作者手中，很容易产生条带少、模糊且弥散的凝胶结果。这一问题在一定程度上随着蓝天然PAGE（blue-native PAGE）的引入而得到解决¹⁹。BN缓冲体系中使用考马斯染料使得蛋白质分离更加稳定可靠。因此，对于相对新手而言，BN-PAGE通常更容易建立且更为可靠，能够实现类囊体复合物的高分辨率分离。基于这些原因，BN-PAGE已成为该领域大多数研究的首选方法。虽然BN-PAGE的运行速度通常比绿色凝胶电泳慢，但其主要缺点在于考马斯染料的染色会干扰微弱的含叶绿素条带的识别，同时也使后续的光谱学表征变得困难。

非变性凝胶电泳和二维SDS-PAGE所提供的生物化学信息若与光谱技术的数据相结合，可得到显著增强。无论采用何种系统，使用非变性凝胶鉴定复合物时存在一个核心问题，即鉴定结果始终可能受到质疑（即， 凝胶条带中的蛋白质可能始终代表共迁移的复合物或组分，而非单一具有生理真实性的复合物。光谱表征可提供绿色凝胶条带中色素的生物物理信息，用于推断其所含复合物的类型。在此方面，叶绿素荧光尤为有用，因为不同光合色素-蛋白复合物通常具有显著不同的荧光光谱和荧光寿命。尽管历史上简单的稳态77K荧光光谱在确认天然凝胶复合物身份方面具有价值，但现代的时间相关单光子计数（TCSPC）技术可提供更丰富的信息。TCSPC不仅能够基于荧光寿命对复合物进行表征，还可实现对复合物内各光谱组分间能量传递过程的详细描述。随着各类天然凝胶系统的广泛应用及新假定复合物的不断发现，此类表征正变得愈发必要，有助于更准确地鉴定蛋白质复合物，并提供有关这些复合物功能机制的新生物物理信息。

本文提供了一种方法，使那些对天然凝胶电泳缺乏或几乎没有经验的研究者也能够实现对天然类囊体复合物的高质量分离，从而用于研究光合作用光反应的机制。研究者可根据需要对该基本技术进行优化，以提升结果质量或将该方法拓展应用于其他物种。随后，我们描述了如何将天然绿色凝胶条带用于时间相关单光子计数（TCSPC）分析，并介绍了一些基本的数据分析与结果展示步骤。将天然凝胶电泳与TCSPC分析相结合，可通过对条带内蛋白质复合物的验证和生物物理表征，进一步拓展这些凝胶系统的应用价值。本文所述的绿色凝胶系统基于Allen和Staehelin¹⁷所开发的方法，并进行了部分改进，与Schwarz et al.²⁰中使用的方法相同。该系统是众多方法之一，但具有适用于本方法学的独特优势：其操作足够快速，可在一天内完成类囊体的分离、凝胶电泳及TCSPC分析，从而避免了样品储存和降解可能带来的问题。此外，我们发现该方法对经验不足的操作者也具有良好的稳健性，所得结果根据优化程度不同，可达到良好至优异的水平。

需要注意的是，天然凝胶上所观察到的复合物取决于所使用的去垢剂和缓冲体系，同时也与所研究生物体的生物学特性有关。不同的去垢剂和缓冲体系优先分离不同类型的复合物，而特定的光合生物体所含的复合物类型也与其他生物体不同，并且并非在所有条件下都会存在全部复合物。本文所述体系特别适用于如Schwarz et al.²⁰中描述的PSI巨型复合物的研究，但对于研究PSII巨型复合物的研究者而言，该体系则处于较易导致复合物解离的一端。如需全面了解用于类囊体蛋白天然凝胶电泳的各种去垢剂和缓冲体系，建议参考Järvi et al.²¹和Rantala et al.²²的研究。

方案

1. 制备天然绿色凝胶的储备溶液

1. 制备用于分离胶的4倍浓缩缓冲液，配方为40%甘油、200 mM 甘氨酸和100 mM Tris，调节pH至8.3。
2. 制备用于浓缩胶的4倍浓缩缓冲液，配方为40%甘油、200 mM 甘氨酸和100 mM Tris，调节pH至6.3。
3. 将这些缓冲液在4 °C保存，以防止霉菌生长。
   注意：缓冲液在4 °C下可稳定数月，建议一次性配制100–200 mL以供长期使用。
4. 配制1 L的10倍浓缩电泳缓冲液，含250 mM Tris HCl（pH 8.3）、1.92 M 甘氨酸和1% SDS。将10倍浓缩电泳缓冲液室温存放于实验台。

2. 类囊体分离与溶解用储备液的配制

1. 配制 100 mL 含有 50 mM Tris 缓冲液（pH 7）、10 mM MgCl₂ 和 10 mM KCl 的 TMK 匀浆缓冲液，并于 4 °C 保存。
   注意：该缓冲液是用于匀浆和处理类囊体样品的主要缓冲液。也可预先配制浓缩储备液，使用时按需稀释（Tris 缓冲液、MgCl₂ 和 KCl 均可作为 1 M 浓缩液在室温下长期保存）。
2. 通过将去垢剂 B-十二烷基麦芽糖苷（DM）和正辛基-β-D-葡萄糖苷（OG）分别溶于 TMK 缓冲液中，配制成 20% w/v 的去垢剂储备液。分装为 1 mL 每份，于 -20 °C 冻存。
3. 配制类囊体溶解缓冲液（SB），该缓冲液同时也用作样品上样缓冲液。
   1. 首先，将 7 mL TMK 缓冲液与 3 mL 甘油混合，制备 TMK-甘油缓冲液。
   2. 向 800 μL TMK-甘油缓冲液中加入 100 μL DM 储备液和 100 μL OG 储备液。将此含有 2% DM 和 2% OG 的 SB 工作液分装为 1 mL 每份，于 -20 °C 冻存。
      注意：每份溶液可根据需要反复冻融。

3. 制备绿色迷你凝胶以备后续使用

1. 在15 mL一次性试管中分别配制浓缩胶和分离胶溶液。
   注意：所提供的体积适用于使用1.5 mm板间距的一块小型凝胶。
   1. 配制浓缩胶溶液：将1.25 mL 4×浓缩胶缓冲液、0.5 mL 40%丙烯酰胺贮存液（39:1 C）和3.25 mL水混合，得到5 mL含4%丙烯酰胺的1×浓缩胶缓冲液。配制分离胶溶液：将1.875 mL 4×分离胶缓冲液、0.94 mL 40%丙烯酰胺贮存液（39:1 C）和4.7 mL水混合，得到7.5 mL含5%丙烯酰胺的1×分离胶缓冲液。
2. 灌注分离胶。
   1. 向分离胶溶液中加入50 μL 10%过硫酸铵（APS），再加入10 μL TEMED，盖上管盖，轻轻倒置数次混匀。立即把胶液注入玻璃板之间，使分离胶顶部与梳齿底部之间留出约1 cm的空间用于后续灌注浓缩胶。
   2. 用移液器小心地在分离胶上层覆盖一层100%乙醇，以平整胶面。
      注意：若胶在15分钟内未凝固，应重新配制新鲜的APS溶液和/或使用新的TEMED。
   3. 待胶完全聚合后（胶与乙醇之间的界面清晰可见，且倾斜凝胶时界面不移动），倾去乙醇，并用吸水纸吸干。
3. 灌注浓缩胶。
   1. 向浓缩胶溶液中加入25 μL 10% APS，再加入5 μL TEMED，盖上管盖，以与分离胶相同的方式轻轻倒置混匀。将胶液加至已聚合的分离胶上方，直至玻璃板间完全充满，然后插入10孔梳子。
      注意：使用前取出梳子，并用水冲洗加样孔，确保各孔直且无胶残留。凝胶可在插入梳子的条件下于4 °C保存至少数天。

4. 从菠菜叶片中分离粗制类囊体膜

注意：所有步骤均应在冰上进行，并使用预冷的仪器和缓冲液。建议在弱光条件下操作。根据实验者的判断以及所研究的生物学过程，可在匀浆前将蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂新鲜加入 TMK 缓冲液中。

1. 使用玻璃Dounce匀浆器在TMK缓冲液中将菠菜叶片彻底匀浆。
   注意：通常一片小的嫩菠菜叶使用1至2 mL缓冲液即足够。单片嫩菠菜叶一般可提供足够的材料，用于在1.5 mm微型凝胶上加载多个泳道。
2. 过滤粗制叶片匀浆液，以去除不溶性残渣。
   1. 为制作简易过滤装置，将一张精细擦拭纸剪成两半，并折叠成四分之一大小。将折叠好的擦拭纸塞入5 mL一次性注射器底部，并用TMK缓冲液预先润湿擦拭纸。
   2. 使用注射器活塞压出擦拭纸上多余的缓冲液，并确保移除活塞后，擦拭纸滤膜紧密贴附于注射器底部。
   3. 将叶片匀浆液用移液器加至擦拭纸滤膜中心，再用活塞推动匀浆液通过滤膜。将滤过的匀浆液收集至1.5 mL离心管中。
3. 在4°C条件下，以5,000 × g离心10分钟，使包括类囊体膜在内的不溶性物质沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL TMK缓冲液中。
4. 通过调整各重悬类囊体样品的体积，使各样品中叶绿素含量一致，具体方法如下所述。
   注意：这可确保各样品在相同体积的去垢剂中溶解，从而减少因沉淀体积差异导致的溶解效率变异。
   1. 为从每份重悬的类囊体膜样品中提取叶绿素，取50 μL等分试样至1.5 mL微量离心管中，加入950 μL甲醇。盖紧管盖，反复倒置混匀。
   2. 将甲醇/叶绿素提取液在10,000 × g离心10分钟，以沉淀蛋白质。
   3. 根据Porra et al.²³的方法测定含色素上清液的叶绿素浓度。使用分光光度计和1 cm比色皿，在652 nm和665 nm处测定吸光度。使用以下公式计算总叶绿素浓度：
      叶绿素a + b（μg/mL）= 22.12 ×（652 nm处吸光度）+ 2.71 ×（665 nm处吸光度）
   4. 以叶绿素浓度测定结果为依据，必要时从各管中移除并弃去部分体积，使每管中总叶绿素含量相等。
5. 再次在5,000 × g离心10分钟，使类囊体膜重新沉淀。弃去上清液，注意彻底去除上清液的同时避免吸走沉淀。

5. 用于上样至非变性凝胶的类囊体膜增溶

1. 解冻一份TMK 30%甘油去污剂溶液（SB），反复颠倒混匀数次，置于冰上保存。
2. 加入适量SB溶液重悬类囊体沉淀，使叶绿素浓度达到1 mg/mL。
   注意：该浓度是确定最佳溶解条件的起始点，需通过实验经验优化。为确保样本间可进行有效比较，叶绿素浓度必须保持一致。
3. 反复吹打混匀，注意避免产生气泡。将样品置于冰上，使类囊体充分溶解。
   注意：溶解时间至少10分钟。溶解时间应足够长，以尽量减少各样本间溶解时间的差异。
   示例：若所有样本需要3分钟完成溶解，则建议溶解时间设为约30分钟。
4. 将已溶解的类囊体在4 °C下以10,000 × g离心，沉淀不溶性物质。
   注意：溶解后的类囊体样品在冰上可稳定数小时，但应避免在-70 °C保存，因为冻融循环可能导致 mega复合物条带丢失。

6. 通过天然凝胶电泳分离溶解的类囊体蛋白

1. 将步骤 5.4 中制备的可溶性类囊体上清液直接上样至先前制备的天然凝胶中。对于 1.5 mm 厚的凝胶，每孔上样 15 μL 可溶性类囊体样品。
2. 使用 1× 电泳缓冲液，以与 SDS-PAGE 凝胶基本相同的方式运行天然绿色凝胶。以 100 V 电压电泳，并在整个电泳过程中将凝胶槽置于湿冰上，以减少凝胶的电阻发热。
   注意：电泳时间大约需要 2 小时，直至迁移前沿的游离色素到达凝胶底部（图 1）。

7. 从天然绿色凝胶中切取类囊体复合物条带

注意：必须从凝胶中切下目标条带，以便将其置于光路中，并防止附近复合物产生的杂散荧光被检测到。

1. 从电泳槽中取出凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶板上的电泳缓冲液。取下凝胶的上层玻璃板，并用蒸馏水冲洗凝胶。
2. 将凝胶保留在下层玻璃板上，将凝胶和玻璃板置于冰上。不使用时，应将凝胶置于暗处，并用塑料膜覆盖以防止其干燥。
3. 在凝胶仍保留在玻璃板上的情况下，待进行TCSPC分析时，切下每个目标条带。使用锋利的解剖刀或剃刀刀片干净地切下条带，并注意确保切下的条带不含有任何污染性条带物质。

8. 室温稳态荧光光谱的采集

1. 对于将通过时间相关单光子计数（TCSPC）分析的每个复合物，使用荧光光谱仪在600至800 nm范围内采集室温荧光光谱。
   注意：采集该光谱时所用的激发波长必须与TCSPC所用的波长一致。

9. 绿色凝胶条带的TCSPC分析

注意：TCSPC 装置的示意图参见图2。

1. 将凝胶切片夹在两块玻璃显微镜载玻片之间。在其中一块载玻片的两端贴上遮蔽胶带，并反复折叠数次，形成垫片，以便将两块载玻片牢固地固定在一起，同时避免挤压凝胶切片。
   注意：这将为激光束在显微镜载玻片之间穿过凝胶切片提供通路。
2. 在玻璃载玻片边缘处的凝胶切片上加入少量水，以形成平滑的界面，减少信号散射。
3. 将凝胶/载玻片夹心结构固定在光束路径中，使光束从载玻片组的开口边缘照射到凝胶切片上，荧光发射则从夹住凝胶的玻璃载玻片侧面射出，方向垂直于光束路径。
   注意：所用激发波长取决于具体实验。435 nm 的波长可同时激发叶绿素a和叶绿素b，而465 nm则优先激发叶绿素b。本实验中采用435 nm作为激发波长。
4. 对每个复合物，在荧光发射光谱范围内以固定间隔采集共计10,000个数据点。例如，从680 nm开始，每隔10 nm采集一次数据，直至750 nm结束。
   注意：为每个待研究的复合物准备多个凝胶条带，以便在发生光漂白而无法获得足够信号时可使用新鲜样品。

10. TCSPC（数据分析）

1. 对于给定的复合物，首先对收集到的所有波长的衰减曲线的峰高进行归一化处理。
   注意：此步骤对于DAS的构建并非必需，但可实现衰减曲线的叠加，以便在数据初步检查时进行直观比较。
2. 将每个衰减曲线的尾部与该复合物的稳态荧光光谱进行匹配，具体方法如下所述。
   1. 选择一个衰减信号已趋于平缓的时间点，通常在几纳秒之后。
   2. 对于每个波长，将衰减曲线归一化，使得所选时间点的信号强度等于该波长处稳态荧光光谱的数值。即， 在选定时间点，所有波长的数值总和将重建稳态荧光光谱。
3. 根据下文所述，从尾部匹配的衰减曲线构建衰减关联谱（DAS）。
   1. 利用尾部匹配的衰减曲线中的数据点，构建一系列荧光强度随波长变化的图表，时间间隔相等例如， 每10皮秒）。例如，50皮秒处的DAS是通过绘制每条衰减曲线在50皮秒时的数值随波长的变化而构建的。
   2. 将所有衰减相关光谱叠加，生成瀑布图，以显示荧光光谱随时间的衰减过程。

结果

绿色凝胶电泳的代表性结果如图所示 图1第1泳道展示了菠菜类囊体绿色凝胶电泳的理想结果示例，其中可见数量最多的清晰、锐利的绿色条带。这些结果在一定程度上较为特殊，部分原因是第1泳道中显示的某些条带通常不会在单个样品中全部出现。为了获得最佳结果，通常还需进行额外的样品纯化处理，例如在类囊体溶解前进行叶绿体分离，以及采用梯度凝胶电泳（4–7%丙烯酰胺）。第2和第3泳道展示了使用本方案结合5%非梯度凝胶所获得的更典型的结果。第4、5和6泳道则示例了因类囊体样品溶解不足程度逐渐增加而导致的较差结果。第7泳道提供了使用该方法获得的典型结果示例。 拟南芥 类囊体而非菠菜。请注意 拟南芥 与菠菜中的相比，凝胶顶部的 mega 复合物条带往往分辨较差。

用于采集天然绿色凝胶条带数据的TCSPC装置示意图如图所示 图2...

讨论

成功的类囊体溶解和天然凝胶电泳将在凝胶上呈现出多条清晰可辨的绿色条带，且条带无明显变形或拖尾现象。上样量过大、去垢剂浓度过高、样品pH值不正确、未溶解物质残留、电泳速度过快或温度过高，以及凝胶灌制不当等因素均可能导致类囊体复合物分辨率差。在优化凝胶自身条件（例如，丙烯酰胺梯度浓度）时，有助于最大限度地提高目标条带的分辨率。根据我们的经验，溶解条件以及样品材料本身的生物学特性是影响天然绿色凝胶上类囊体复合物分辨率和产量的最重要因素。需要牢记的是，并非所有复合物在所有生物学条件下都会存在。

天然绿色凝胶的制备方法与常规SDS-PAGE微型凝胶基本相同。凝胶可在上午制备，同一天晚些时候即可使用，也可在4 °C下保存数天，期间梳子可保留在凝胶中，性能无明显变化。浓缩胶和分离胶均可使用标准且易于获得的39:1 C丙烯酰胺溶液进行灌注。所谓 "大孔" 可以使用较高的丙烯酰胺：双丙烯酰胺比例制备凝胶（例如为了提高凝胶顶部大分子复合物的分离效果，可使用较高C比例（如100:1），但我们发现这往往会导致条带分辨率降低。根据我们的经验，使用较低的C比...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘氨酸	Sigma	G8898
Tris 碱	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
癸基麦芽糖苷	Sigma	D7658	n-癸基-β-D-麦芽吡喃糖苷，非十二烷基麦芽糖苷或α-癸基麦芽糖苷
辛基葡萄糖苷	Sigma	O8001
丙烯酰胺	BioRad	161-0148	37.5:1 C 40% 溶液
TEMED	BioRad	161-0800
过硫酸铵	BioRad	161-0700
氯化镁	Sigma	M2670
氯化钾	Sigma	P9333