利用天然绿色凝胶电泳分离菠菜类囊体蛋白复合物及通过时间相关单光子计数进行条带表征

摘要

本文介绍了一种通过天然绿色凝胶电泳分离可溶性类囊体复合物的实验方案。随后利用时间相关单光子计数法（TCSPC）对绿色凝胶条带进行表征，并提供了数据分析的基本步骤。

摘要

光合作用的光反应由类囊体膜上的一系列色素蛋白复合体执行。由于存在使光合作用适应不断变化的环境条件的调节机制，这些复合体的化学计量比和空间排布在长时间和短时间尺度上均具有高度动态性。即， 非光化学淬灭、状态转换以及长期响应）。历史上，这些过程主要通过叶绿素荧光的变化进行光谱学描述，光谱学至今仍是监测光合作用参数的重要方法。然而，可用于直观呈现潜在蛋白复合物动态变化的方法十分有限。本文介绍一种快速、简便的高分辨率分离与可视化类囊体复合物的方法——天然绿色凝胶电泳。该方法结合时间相关单光子计数技术，可对绿色凝胶中分离出的条带进行叶绿素荧光特性的详细表征。

引言

光合生物必须不断调整其生理状态以适应变化的环境条件，从而最大化其生产力并成功与邻近生物竞争¹这一点在负责光合作用光反应的机制中尤为突出，因为环境光强在阴影与全日照之间可能相差三个数量级。此外，干旱、低温或高温胁迫等环境因素会减少二氧化碳的可利用性，从而限制碳固定——而碳固定正是光反应产物的天然电子受体。因此，植物必须尽可能高效地捕获和利用太阳辐射，同时保留必要时耗散多余光能的能力。尽管如此，光氧化损伤在各种光照条件下仍会常规发生。^2,3，若无法有效管理吸收的激发能，则可能导致细胞发生灾难性损伤甚至死亡。已知存在多种适应性机制，可使光合作用装置既能响应环境条件的持续变化，也能应对短暂的波动。即， 在长时间尺度和短时间尺度上⁴这些包括长期响应（LTR）和非光化学淬灭（NPQ）。NPQ 本身被认为至少包含三种组分现象，即状态转换（qT）、快速诱导的能量淬灭（qE）和光抑制（qI）。⁵.

这些过程最初主要是根据光谱现象被观察和定义的[例如， NPQ 指观察到的叶绿素荧光下降（叶绿素荧光淬灭），这种下降并非由光化学反应速率的增加引起⁶术语 ....

方案

1. 制备天然绿色凝胶的储备溶液

1. 制备用于分离胶的4倍浓缩缓冲液，配方为40%甘油、200 mM 甘氨酸和100 mM Tris，调节pH至8.3。
2. 制备用于浓缩胶的4倍浓缩缓冲液，配方为40%甘油、200 mM 甘氨酸和100 mM Tris，调节pH至6.3。
3. 将这些缓冲液在4 °C保存，以防止霉菌生长。
   注意：缓冲液在4 °C下可稳定数月，建议一次性配制100–200 mL以供长期使用。
4. 配制1 L的10倍浓缩电泳缓冲液，含250 mM Tris HCl（pH 8.3）、1.92 M 甘氨酸和1% SDS。将10倍浓缩电泳缓冲液室温存放于实验台。

2. 类囊体分离与溶解用储备液的配制

1. 配制 100 mL 含有 50 mM Tris 缓冲液（pH 7）、10 mM MgCl₂ 和 10 mM KCl 的 TMK 匀浆缓冲液，并于 4 °C 保存。
   注意：该缓冲液是用于匀浆和处理类囊体样品的主要缓冲液。也可预先配制浓缩储备液，使用时按需稀释（Tris 缓冲液、MgCl₂ 和 KCl 均可作为 1 M 浓缩液在室温下长期保存）。
2. 通过将去垢剂 B-十二烷基麦芽糖苷（DM）和正辛基-β-D-葡萄糖苷（OG）分别溶于 TMK 缓冲液中，配制成 20% w/v 的去垢剂储....

结果

绿色凝胶电泳的代表性结果如图所示 图1第1泳道展示了菠菜类囊体绿色凝胶电泳的理想结果示例，其中可见数量最多的清晰、锐利的绿色条带。这些结果在一定程度上较为特殊，部分原因是第1泳道中显示的某些条带通常不会在单个样品中全部出现。为了获得最佳结果，通常还需进行额外的样品纯化处理，例如在类囊体溶解前进行叶绿体分离，以及采用梯度凝胶电泳（4–7%丙烯酰胺）。第2和第3泳道展示了使用本方案结合5%非梯度凝胶所获得的更典型的结果。第4、5和6泳道则示例了因类囊体样品溶解不足程度逐渐增加而导致的较差结果。第7泳道提供了使用该方法获得的典型结果示例。 拟南芥 类囊体而非菠菜。请注意 拟南芥 与菠菜中的相比，凝胶顶部的 mega 复合物条带往往分辨较差。

用于采集天然绿色凝胶条带数据的TCSPC装置示意图如图所示 图2.......

讨论

成功的类囊体溶解和天然凝胶电泳将在凝胶上呈现出多条清晰可辨的绿色条带，且条带无明显变形或拖尾现象。上样量过大、去垢剂浓度过高、样品pH值不正确、未溶解物质残留、电泳速度过快或温度过高，以及凝胶灌制不当等因素均可能导致类囊体复合物分辨率差。在优化凝胶自身条件（例如，丙烯酰胺梯度浓度）时，有助于最大限度地提高目标条带的分辨率。根据我们的经验，溶解条件以及样品材料本身的生物学特性是影响天然绿色凝胶上类囊体复合物分辨率和产量的最重要因素。需要牢记的是，并非所有复合物在所有生物学条件下都会存在。

天然绿色凝胶的制备方法与常规SDS-PAGE微型凝胶基本相同。凝胶可在上午制备，同一天晚些时候即可使用，也可在4 °C下保存数天，期间梳子可保留在凝胶中，性能无明显变化。浓缩胶和分离胶均可使用标准且易于获得的39:1 C丙烯酰胺溶液进行灌注。所谓 "大孔" 可以使用较高的丙烯酰胺：双丙烯酰胺比例制备凝胶（例如为了提高凝胶顶部大分子复合物的分离效果，可使用较高C比例（如100:1），但我们发现这往往会导致条带分辨率降低。根据我们的经验，使用较低的C比.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘氨酸	Sigma	G8898
Tris 碱	Sigma	#648310
SDS	Sigma	L3771
癸基麦芽糖苷	Sigma	D7658	n-癸基-β-D-麦芽吡喃糖苷，非十二烷基麦芽糖苷或α-癸基麦芽糖苷
辛基葡萄糖苷	Sigma	O8001
丙烯酰胺	BioRad	161-0148	37.5:1 C 40% 溶液
TEMED	BioRad	161-0800
过硫酸铵	BioRad	161-0700
氯化镁	Sigma	M2670
氯化钾	Sigma	P9333