本文介绍了一种细胞解离方案，可通过荧光激活细胞分选（FACS）高效分离果蝇视觉系统中低丰度存在的细胞。
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本文内容
摘要
摘要
下一代测序技术的灵敏度近期得到显著提升，使得转录组和基因组分析能够应用于少量细胞。利用该技术研究果蝇视觉系统发育，结合该系统丰富的细胞类型特异性遗传工具，为在精确的细胞分辨率下探究发育的分子基础提供了强大手段。要实现这一研究策略，关键在于能够可靠且高效地分离脑内稀有细胞。本文介绍了一种可在遗传嵌合实验中高效纯化单细胞克隆的方法。通过该方案，我们利用荧光激活细胞分选（FACS）纯化后 consistently 获得较高的细胞得率（约占所有标记细胞的25%），并成功对通过可抑制细胞标记嵌合分析（MARCM）产生的单细胞克隆进行了转录组学分析。该方案适用于在发育的不同阶段以及不同遗传操作背景下，对视觉系统中的特定细胞类型进行转录组和基因组分析。
引言
果蝇视觉系统是研究发育和行为遗传基础的杰出模型。该系统具有高度保守的细胞结构1，并拥有可操控特定细胞类型的先进遗传工具包2,3。该系统的一个主要优势在于，能够利用遗传嵌合体方法，在单细胞分辨率下自主探究目标细胞类型中基因的功能4,5。我们旨在将这些遗传工具与新一代测序技术的最新进展相结合，以在遗传嵌合体实验中的单细胞克隆内开展细胞类型特异性的转录组和基因组分析。
为此，必须建立一种稳健且高效的方法，以选择性分离大脑中丰度较低的细胞群体。此前，我们已建立了一种通过流式细胞术（FACS）在蛹期发育过程中分离视觉系统中特定细胞类型的实验方案，并结合RNA测序技术测定其转录组。6在这些实验中，某一特定类型的绝大多数细胞（例如 R7 光感受器）被荧光标记。利用该方法，在遗传嵌合体实验中（仅同一类型的细胞中的一部分被标记），我们未能分离出足够数量的细胞以获得高质量的测序数据。为解决这一问题，我们尝试通过优化细胞解离方案来提高细胞得率。
我们的方法是缩短整个实验流程的总时长，以最大限度地维持....
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方案
1. 实验前的规划
- 在开始实验之前，先进行小规模的预实验，以确认遗传标记是否按预期工作，能够特异性地标记目标细胞。
- 初步可通过免疫组织化学染色和光学显微镜观察，判断是否有非目标细胞被标记。理想情况下，遗传标记在视网膜和视叶中具有特异性（图3）。由于仅使用视叶进行细胞解离，因此中央脑区的标记不会造成影响。同时，确定每只果蝇大脑中标记的目标细胞数量。
- 若遗传标记具有理想的特异性，可进一步开展预实验性质的流式细胞分选（FACS）实验（图4），以评估是否能够稳定地分离出纯度较高的目标细胞群体，并估算每只大脑可分离出的目标细胞数量。如有需要，可通过定量PCR检测分离细胞的纯度，评估特定基因的富集或去富集情况。
- 确定为获得实验所需材料量而需设置的杂交组合数量。
注意：根据实验经验，使用本方案通常可稳定分离出约17–25%的荧光标记细胞，且仅需1,000个经FACS纯化的细胞即可获得高质量的RNA测序数据（更少的细胞数也可能足够）。- 若需获得1,000个用于RNA-seq分析的细胞，应确保每只大脑中至少有40个目标细胞被荧光标记（每个视叶约20个）。每只大脑平均可纯化约10个目标细胞，因此需解剖100只果蝇....
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结果
总体方案
协议的总体方案如图1所示。该协议分为三个主要部分：果蝇操作、样品制备、测序与数据分析。为简化起见，总体方案中未包含“实验前的规划”部分。
时间线
果蝇实验和样品制备等主要实验步骤的时间安排见图2。
通过共聚焦显微镜验证细胞特异性标记
在一项代表性实验中，L3 胶原单极神经元（L3）被荧光标记。L3 神经元是五种同源胶原神经元（L1-L5）之一，接收来自广泛调谐的感光细胞 R1-R6 的输入，并通过与髓质中靶向神经元形成突触，将信息传递至高级中枢。在 MARCM 实验中，通过有丝分.......
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讨论
本方案操作简单，技术难度不高，但若忽略若干关键步骤，将显著降低细胞得率。（步骤 2.3.2）确保杂交果蝇健康且培养基不干涸至关重要。定期为杂交果蝇加水是获得足量、基因型正确且发育阶段合适的果蝇用于解剖的关键。加水频率需根据所用培养基及果蝇饲养条件而定。为防止培养基干涸，应每天检查两次试管，并根据需要添加水分。（步骤 3.3）此外，应将所有解剖获得的脑组织汇集至同一个微量离心管中用于后续解离，而不是每位操作者各自使用单独的离心管再合并样本。此做法可避免因转移过程中造成的脑组织丢失，此类损失可能相当显著。（步骤 3.4.9）在通过移液器反复吹打以机械破坏组织时，必须持续操作直至肉眼观察不到悬浮液中有任何组织残余。组织解离不完全将减少可通过流式细胞分选（FACS）获得的单细胞数量，从而降低细胞得率。
细胞得率的主要限制因素是起始材料的量。在这方面，解剖步骤成为限制性因素的原因有多个：（1）组织解离方案要求将视叶从头部解剖出来，并与中央脑部分离；（2）为了在发育过程中精确的时间点获取组织，解剖操作的时间窗口必须受到限制；（3）解剖与流式细胞分选（FACS）之间的时间越长，细胞活力下降以及基.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）资助，资助编号为 K01NS094545，以及来自神经退行性疾病研究勒弗勒中心的资助。我们感谢Liming Tan和Jason McEwan提出的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | 蛋白酶混合物 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G0350500 | |
| L-谷胱甘肽 | Sigma-Aldrich | G6013 | |
| 热灭活牛血清 | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 胰岛素溶液 | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Schneider's 培养基 | Gibco | 21720024 | |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington | LK003178 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| RNeasy 微量试剂盒 | Qiagen | 74004 | RNA纯化试剂盒 |
| 无RNase的DNase | Qiagen | 79254 | |
| SuperScript II 逆转录酶 | Life Technologies | 18064-014 | |
| dNTP混合液 | Life Technologies | R0191 | |
| MgCl2 溶液 | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 甜菜碱溶液 | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| RNaseOUT | Life Technologies | 10777-019 | |
| Q5 高保真 2x 预混液 | New England Biolabs | M0492S | |
| MinElute PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28004 | |
| Nextera XT DNA 文库制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index 试剂盒 | Illumina | FC-131-1001 | |
| 带细胞筛旋盖的试管 | Falcon | 352235 | |
| 瓶顶真空过滤系统 | Corning | CLS431153 | |
| ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| FACSAria 流式细胞仪 | BD Biosciences | 656700 | |
| HiSeq 2500 测序系统 | Illumina | SY–401–2501 |
参考文献
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stat....
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重印与许可
