通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常

摘要

本文介绍了两种可单独或联合使用的方法，用于分析β-淀粉样蛋白对纤维蛋白凝块结构的影响。其中包括一种制备凝块的方案 体外 纤维蛋白凝块，随后进行凝块浊度测定和扫描电子显微镜分析。

摘要

本文介绍了生成方法 在 体外纤维蛋白凝块的制备及通过光谱法和扫描电子显微镜（SEM）分析β-淀粉样蛋白（Aβ）对凝块形成与结构的影响。在阿尔茨海默病（AD）中形成神经毒性淀粉样蛋白聚集体的Aβ已被证实可与纤维蛋白原相互作用。这种Aβ-纤维蛋白原相互作用导致纤维蛋白凝块结构异常，并对纤溶作用产生抵抗。Aβ诱导的纤维蛋白凝固异常还可能促进AD病理中的脑血管病变，如微梗死、炎症以及脑淀粉样血管病（CAA）。鉴于神经血管功能障碍在AD病理中可能具有的关键作用，开发能够抑制或减弱Aβ-纤维蛋白原相互作用的化合物具有良好的治疗前景。 体外 可用于简便、系统地评估纤维蛋白凝块形成的方法，对于开发治疗性化合物具有潜在应用价值。本文展示了一种优化的实验方案 体外 纤维蛋白凝块的生成，以及对 Aβ 和 Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂效应的分析。凝块浊度检测法快速、高度可重复，可同时检测多种条件，适用于大规模筛选 Aβ-纤维蛋白原抑制剂。筛选获得的阳性化合物可进一步通过扫描电镜（SEM）评估其改善 Aβ 诱导的纤维蛋白凝块结构异常的能力。本文以近期发现的 Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂 TDI-2760 为例，验证了这些优化方案的有效性。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种导致老年患者认知功能下降的神经退行性疾病，主要由异常的β-淀粉样蛋白（Aβ）表达、聚集以及清除障碍引发，最终导致神经毒性^1,2尽管Aβ聚集体与AD之间的关联已有充分表征³，但该疾病病理背后的精确机制尚未被充分阐明⁴越来越多的证据表明，神经血管功能障碍在阿尔茨海默病（AD）的进展和严重程度中起着重要作用。⁵，因为Aβ直接与循环系统的组分相互作用⁶Aβ 与纤维蛋白原具有高亲和力相互作用^7,8，该物质在阿尔茨海默病患者和小鼠模型的 Aβ 沉积中均有定位^9,10,11此外，Aβ与纤维蛋白原的相互作用会诱导异常的纤维蛋白凝块形成与结构改变，并导致对纤维蛋白溶解的抵抗性。^9,12一种治疗阿尔茨海默病的策略是通过抑制Aβ与纤维蛋白原之间的相互作用来改善循环系统缺陷^13,14因此，我们采用高通量筛选和药物化学方法，鉴定出若干可抑制Aβ与纤维蛋白原相互作用的小分子化合物。^13,14. 为检验 Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂的有效性，我们优化了两种用于分析的方案 体外 纤维蛋白凝块形成：凝块浊度检测与扫描电子显微镜（SEM）¹⁴.

凝块浊度检测是一种利用紫外-可见光谱法监测纤维蛋白凝块形成的简单且快速的方法。随着纤维蛋白凝块的形成，光散射逐渐增强，溶液的浊度也随之增加。相反，当存在Aβ时，纤维蛋白凝块的结构发生改变，混合物的浊度降低（图1）。可通过该方法评估抑制性化合物是否具有恢复Aβ引起的浊度异常的潜力。尽管浊度检测能够快速分析多种条件，但其对凝块的形态和结构提供的信息有限。扫描电子显微镜（SEM）利用电子束探测固体表面的形貌，可用于分析凝块的三维结构^15,16,17,18，并评估Aβ和/或抑制性化合物的存在如何改变该结构^9,14。光谱法和SEM均为经典实验室技术，已被用于多种用途，例如，分光光度法可用于监测淀粉样蛋白的聚集过程^19,20。同样，SEM也用于分析来自阿尔茨海默病、帕金森病和血栓栓塞性中风患者血浆所形成的纤维蛋白凝块^21,22,23。本文所展示的实验方案经过优化，可重复且快速地评估纤维蛋白凝块的形成。

以下方案提供了制备一种 体外 纤维蛋白凝块（含Aβ与不含Aβ）的制备，并详细说明分析Aβ对纤维蛋白凝块形成及结构影响的方法。通过小分子抑制剂化合物TDI-2760，验证了这两种用于检测Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制效果的方法的有效性。¹⁴这些方法无论单独使用还是联合使用，均可实现对目标对象的快速且简便的分析 体外 纤维蛋白凝块形成。

方案

1. Aβ42 和纤维蛋白原分析前的准备

1. 从冻干粉制备单体Aβ42
   1. 将 Aβ42 粉末恢复至室温，然后在 1,500 x g 条件下离心 30 秒。
   2. 每0.5 mg Aβ42粉末加入100 µL预冷的六氟异丙醇（HFIP），冰上孵育30分钟。
      警告：操作 HFIP 时需小心，并在通风橱中进行所有步骤。
   3. 制备20 µL分装液，在化学通风橱中风干2-3小时。薄膜可在-20 °C保存。
   4. 将单体Aβ42薄膜用10 µL新鲜二甲基亚砜（DMSO）重悬，于室温下在水浴超声仪中振荡10分钟。
   5. 加入190 µL 50 mM 三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH 7.4），轻轻吹打混匀。
   6. 在 4 °C 条件下以 20,817 × g 离心 20 分钟，去除蛋白质聚集体。
   7. 4 °C 下孵育上清液过夜，次日于 4 °C 以 20,817 x g 离心 20 分钟，弃去可能存在的蛋白质聚集体。
   8. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定Aβ42浓度。将纯化的牛血清白蛋白（BSA）从1 mg/mL连续倍比稀释至0.0625 mg/mL，制备蛋白标准品，每种标准品取10 µL，设三个复孔加入多孔板中。将Aβ样品按1:4稀释后，取10 µL加入多孔板中，设三个复孔。混合BCA溶液A与溶液B，每孔加入200 µL。于37 °C孵育30分钟，在酶标仪上以562 nm波长读数。将剩余的Aβ溶液置于冰上保存，用于后续浊度测定和扫描电镜（SEM）分析。
2. 制备纤维蛋白原溶液
   1. 将20 mg冻干纤维蛋白原粉末加入15 mL离心管中，用预热的2 mL 20 mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液（pH 7.4）重悬。
   2. 在37 °C水浴中孵育10分钟。
   3. 将溶液经0.2 µm注射器滤器过滤，4 °C保存30 min。从4 °C取出溶液，再经0.1 µm注射器滤器过滤，以去除纤维蛋白原聚集体或预先存在的纤维蛋白。
   4. 使用BCA法测定纤维蛋白原浓度。按照步骤1.1.8的说明进行操作。将剩余的纤维蛋白原溶液保存于4 °C，用于后续浊度测定和扫描电镜（SEM）实验。

2. 血块浊度测定

1. 向96孔板的每个实验孔中加入20 µL来自步骤1.1.8的30 µM Aβ42溶液，使Aβ42在200 µL缓冲液中的终浓度为3.0 µM。向96孔板中的缓冲液对照孔加入等体积的含5% DMSO的50 mM Tris缓冲液（pH 7.4）。
   注意：此步骤中 Aβ42 的确切体积并不重要。对于低浓度制备，可使用较大体积，并相应调整凝块形成缓冲液的体积，最终总体积应保持为 200 µL。
2. 若测试抑制性化合物，将化合物用DMSO稀释至工作浓度。向含Aβ42的孔中加入化合物或仅加入DMSO作为对照，并充分混匀。
   注意：Aβ42 溶液应在孔底部形成一个独立的液滴，化合物或 DMSO 应直接移取至液滴中心。
3. 将第1.2.4步中的纤维蛋白原储备液用凝块形成缓冲液（20 mM HEPES缓冲液（pH 7.4），5 mM CaCl₂）稀释₂，以及137 mM NaCl），加入至96孔板中含Aβ42的孔和对照孔。调节纤维蛋白原溶液的体积，使其在总体积为200 µL的反应体系中终浓度为1.5 µM。用移液器缓慢加入溶液，避免产生气泡。将96孔板置于旋转平台上，室温孵育30分钟，并持续振荡。
   注意：纤维蛋白原溶液的体积可能因其储存浓度不同而有所变化，但孵育时每孔的总体积应为 170 µL。
4. 将市售的纯化凝血酶粉末溶于ddH₂O中，配制凝血酶溶液₂O 配制 50 U/mL 的储备液。使用前用 20 mM HEPES 缓冲液（pH 7.4）稀释成 5 U/mL 的工作液。
5. 孵育30分钟后，使用多通道移液器将30 µL凝血酶溶液（5 U/mL）同时加入2.3步骤中96孔板的纤维蛋白原溶液中。凝血酶的加入会立即启动凝块形成，因此需小心地将凝血酶直接加入纤维蛋白原溶液的中心，避免产生气泡。
   注意：凝血酶的活性可能因实验条件以及不同批次的凝血酶而异。能够有效形成凝块所需的准确浓度需通过实验确定。
6. 读取吸光度 体外 在加入凝血酶后立即使用酶标仪检测血凝块。在10分钟内每30-60秒于350 nm处测定一次吸光度。整个实验在室温下进行。
   注意：某些抑制剂化合物可能会改变溶液在350 nm处的吸光度，此时可在405 nm处测定浊度。

3. 扫描电子显微镜

1. 凝块制备、固定与洗涤
   1. 使用镊子将洁净的硅化玻璃盖玻片（12 mm）放入12孔板或24孔板中。
   2. 在凝块形成缓冲液中配制纤维蛋白原。具体操作详见步骤1.2。
   3. 为评估Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂对纤维蛋白凝块结构的影响，请按照浊度测定法（步骤2）所述的孵育说明进行操作。务必设置对照孔，其中仅含纤维蛋白原，不含Aβ和抑制剂。
   4. 用移液器将80 µL步骤3.1.3中的纤维蛋白原混合液滴加到盖玻片上。轻轻铺展溶液，使其均匀分布在盖玻片表面。
   5. 将凝血酶储备液（50 U/mL）用20 mM HEPES缓冲盐水稀释至终浓度2.5 U/mL，并取20 µL直接加入纤维蛋白原溶液中心，不进行混合。
      注：如有需要，可使用较高工作浓度的凝血酶（5 U/mL）。
   6. 用塑料盖盖好12孔板，在室温下静置30–60分钟。
   7. 在凝血反应进行的同时，准备脱水和固定溶液。配制0.1 M、pH 7.4的二甲胂酸钠缓冲液。将10%戊二醛储备液用0.1 M、pH 7.4的二甲胂酸钠缓冲液稀释，配成2%的戊二醛工作液。所有溶液均需置于冰上。新稀释的2%戊二醛溶液若在4 °C冰箱中妥善保存，应在一周内使用。
   8. 用双蒸水将无水乙醇（100%）稀释成80%、50%和20%的乙醇溶液。将这些乙醇溶液及无水乙醇（100%）均置于冰上保存。
      ​注意：操作二甲胂酸钠和戊二醛时需小心，应在化学通风橱内进行上述操作。
   9. 30分钟后，用冰浴的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液轻轻洗涤凝块两次。每孔加入2 mL缓冲液，确保凝块完全浸没。盖上盖子，在室温下静置2分钟。2分钟后，用1 mL移液器或细口移液滴管小心吸除缓冲液。重复一次。
   10. 用冰浴的2%戊二醛固定凝块。将孔板置于冰上，每孔加入约2–3 mL 2%戊二醛，确保凝块完全浸没。盖好后在冰上固定30分钟。
   11. 30分钟后，小心吸除各孔中的戊二醛，并按照上述方法（每次2分钟，共两次）用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液洗涤凝块。洗涤过程中保持孔板置于冰上。
2. 凝块的梯度脱水与临界点干燥
   1. 使用步骤3.1.8中配制的冰浴乙醇溶液（20%、50%、80%、100%及再次100%）对凝块进行梯度脱水，每级5分钟。每级脱水时加入2–3 mL乙醇，确保凝块完全浸没。盖好后在冰上孵育。
   2. 每级乙醇处理后，用1 mL移液器或一次性滴管小心吸除乙醇溶液，但不要完全吸干，确保凝块表面不暴露于空气中。
      注：无水乙醇（100%）脱水应进行两次。
   3. 在保持样品始终浸没于最后一次100%乙醇中的条件下，将其转移至临界点干燥仪（CPD）。使用CPD样品架或带垫圈的盖玻片架将玻片转移至CPD腔室，每片玻片之间至少放置一个垫圈。
   4. 从CPD腔室中取出盖玻片，用导电碳胶将其固定在扫描电镜（SEM）样品台上。
3. 溅射镀膜与成像
   1. 将所有带样品的SEM样品台转移至溅射镀膜室。
   2. 使用真空溅射镀膜仪，对样品进行金/钯或其他导电材料（如碳）的溅射镀膜，镀层厚度小于20 nm。
      注：本实验采用18 nm金/钯镀层，溅射时间为45秒，镀速为4 Å/s。若妥善保存于干燥室温环境中，溅射镀膜后的样品可稳定数周，可随时进行SEM分析。
   3. 使用配备SE2探测器的扫描电镜在4 kV条件下获取图像。
      注：本组图像的像素尺寸范围为13 nm至31 nm。

结果

在 体外 凝血（浊度）试验中，酶凝血酶切割纤维蛋白原，导致纤维蛋白网络的形成²⁴。这种纤维蛋白凝块的形成会导致光线通过溶液时发生散射，从而引起浊度升高（图1），在阅读期结束前趋于平稳（图2，绿色）。当纤维蛋白原在 Aβ42 存在下孵育时，溶液浊度降低，其曲线最大高度约为仅含纤维蛋白原时的一半图 2A，蓝色）。在最近的一项研究中，合成了一系列Aβ聚集抑制剂，并评估了它们抑制Aβ与纤维蛋白原相互作用的能力，鉴定出化合物TDI-2760¹⁴我们已在研究中使用TDI-2760来阻断Aβ与纤维蛋白原的相互作用。如先前报道，在TDI-2760存在的情况下，Aβ的作用得到缓解，表现为浊度高于仅含Aβ的条件图2A，红色）。TDI-2760 ...

讨论

本文所述方法可提供一种可重复且快速的纤维蛋白凝块形成评估手段 体外此外，该系统的简便性使得解读Aβ如何影响纤维蛋白凝块的形成和结构变得相对直接。在本实验室此前的发表文章中，已证明这些检测方法可用于测试化合物抑制Aβ-纤维蛋白原相互作用的能力。^13,14利用这两种检测方法，对一系列合成化合物抑制 Aβ-纤维蛋白原相互作用的能力进行了分析。实际上，凝块浊度检测可用于筛选出具有治疗潜力的化合物，因为并非所有能够抑制 Aβ-纤维蛋白原相互作用的化合物都能恢复纤维蛋白凝块的形成。

浊度检测方法存在一些可能需要排查的问题或限制其应用的方面。主要限制在于不同实验之间可能存在某些变异，从而增加结果解释的难度。其中部分变异可能源于凝血酶活性。为排查凝血酶活性问题，使用者可在开始进行Aβ和测试化合物的实验之前，预先检测多种浓度凝血酶的凝块形成活性。在本实验条件下，若无纤维蛋白原存在，Aβ不会使溶液浊度高于背景水平，表明所观察到的浊度曲线是由纤维蛋白聚合所致。然而，Aβ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤维蛋白原，血浆素原耗竭型血浆	EMD Millipore	341578	保持瓶盖用Parafilm密封，避免接触湿气
β-淀粉样蛋白（1-42），人源	Anaspec	AS-20276
人血浆凝血酶	Sigma-Aldrich	T7009
1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇，纯度大于等于99%	Sigma-Aldrich	105228
二甲基亚砜（DMSO），无菌过滤	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific	23225
Tris碱	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl2	Fischer Scientific	C70
滤膜注射器，0.2µm，25 mm	Pall	4612
Millex无菌注射式滤器，0.1 µm，PVDF，直径33 mm	Millipore	SLVV033RS
高结合力96孔板，平底，经认证	Fischer Scientific	21377203
Spectramax Plus384	Molecular Devices	89212-396
离心机，5417R	Eppendorf	5417R
Branson 200超声波清洗仪	Fischer Scientific	15-337-22
实验室旋转仪	Thermo Scientific	2314-1CEQ
盖玻片支架备用垫圈	Tousimis	8766-01
窄颈移液管 - Sedi-Pet	电子显微镜科学公司（EMS）	70967-13
临界点干燥仪样品支架（盖玻片支架）	Tousimis	8766
针式样品台支架盒	电子显微镜科学公司（EMS）	76610
圆形玻璃盖玻片（12 mm）	Hampton Research	HR3-277
10% 戊二醛	电子显微镜科学公司（EMS）	16120
乙醇	Decon Labs	11652
24孔板	Falcon	3047
Na Cacodylate	电子显微镜科学公司（EMS）	11652
SEM样品台，锥形末端针	电子显微镜科学公司（EMS）	75192
PELCO导电碳胶片，外径12 mm	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 临界点干燥仪	Tousimis
Denton Desk IV 镀膜仪，配备金/钯靶材	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEM 软件	Carl Zeiss