方法文章

平行板灌注系统的体外模型研究了细菌对移植组织的粘附性

DOI：

10.3791/58476

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2019年1月7日

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1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

本文内容

摘要

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我们描述了一个内部设计的体外流室模型, 它允许研究细菌对移植组织的粘附。

摘要

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各种瓣膜导管和支架安装的瓣膜用于先天性心脏病患者的右心室流出道 (rvot) 瓣膜置换术。然而, 当使用假肢材料时, 这些移植物容易受到细菌感染和各种宿主反应。

识别在微生物血管内粘连中发挥重要作用的细菌和宿主因素对于更好地了解感染性心内膜炎 (ie) 等感染的病理生理学和开展预防工作具有重要意义策略。因此, 有必要建立有效的模型来研究细菌在生理剪切条件下的粘附情况。在这里, 我们描述了一个新设计的基于平行板的体外灌注室的使用情况, 该室允许研究细菌对不同器官移植组织的粘附性, 如暴露的细胞外基质、内皮细胞和惰性区域.该方法结合成菌区量值, 可用于评价移植物材料在流动条件下对细菌粘附的倾向。此外, 流室系统还可用于研究血液成分在剪切条件下细菌粘附中的作用。我们证明, 组织的来源, 其表面形态和细菌物种特异性不是主要的决定细菌坚持到移植组织的因素, 使用我们的内部设计的体外灌注模型。

引言

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金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌) 采用了各种毒力策略来规避宿主免疫防御系统, 使植入人体循环的生物或非生物表面殖民, 从而导致严重的血管内感染, 如败血症和ie1,2,3,4,5。ie 仍然是一个重要的治疗相关并发症的患者植入假体心脏瓣膜后, 而个别因素的原因, 导致 ie7 的发病还没有完全了解 6,7。在流动条件下, 细菌会遇到剪切力, 为了粘附在容器壁8 上, 它们需要克服剪切力。模型可以研究细菌和假体瓣膜组织或内皮在流动中的相互作用, 因为它们更多地反映了体内的情况。

几种特殊的机制促进细菌粘附到内皮细胞 (ecs) 和暴露的内皮细胞下基质 (ecm), 导致组织定植和植物成熟, 是 ie9中必不可少的早期步骤。各种葡萄球菌表面蛋白或 mscram (识别粘附基质分子的微生物表面成分....

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方案

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1. 为体外研究准备移植组织

注: 使用了三种类型的组织: 牛心包贴片 (bp)、冷冻保留同种异体移植 (ch) 和牛颈静脉移植 (bjv)。在 bjv 导管和 ch (由欧洲同种异体移植银行 (ehb) 处理并在使用前储存在液氮中的组织) 的情况下, 使用壁面和瓣膜小叶。从制造商处购买了 bp 贴片和 bjv 管道。使用前, 按照 ehb 指令12 解冻 ch。

  1. 使用前使用0.9% 的氯化钠冲洗所有组织。
  2. 准备组织活检使用一次性皮肤活检冲床, 以削减圆形组织块 (直径10毫米)。
  3. 使用一次性无菌手术刀将所有组织贴片切割到相同的高度。
  4. 对于用戊二醛固定的组织 (例如bjv 导管), 用 200 gl 的人白蛋白在4°c 孵育移植件过夜, 以中和固定剂。
  5. 用0.9% 的氯化钠在微滴板中清洗戊二醛残留物。 重复 3次, 1分钟。

2. 为灌注实验准备细菌

注: 使用了三种细菌分离物:金黄色葡萄球菌科文 (atcc 12598)、 s. 表皮虫atcc 149900 和s. sanguinis nctc 7864。在37°c 的色....

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结果

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为了更好地了解 ie 发育背后的机制, 该模型能够评估感染发病体内存在的细菌和组织相关因素。

在详细的, 新的体外方法允许量化细菌在流动条件下对不同的移植组织的粘附, 在施加剪切应力的组织上灌注荧光标记的细菌, 在3-10 的生理范围内施加剪切应力/cm2为 rvot。在这项工作中, 我们使用了 4 mL/min 的流速, 对应于 3 dyne/cm 2.考虑到所有组织补丁的通道高度为 0.3 mm、安装的移植物与介质入口之间的距离约为 39 mm, 灌注室 (如图 1所示) 保证了完全发育的层流 (re = 3.89 是明显低于 2000年;入口长度 = 0.05 mm 明显小于距离 "内移接", 这些参数是假设适当的流动模式所必需的)。

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讨论

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最近的临床观察使 ie 作为一种并发症的患者接受瓣膜置换术 rvot6,13。ie 中植入瓣膜功能障碍是细菌与血管内移植物相互作用的结果, 导致广泛的炎症和凝血反应1,14。提出的新的体外模型使我们能够研究组织结构和细菌因素的差异是否可能调节体内使用的移植物15对感染的易感性.bjv 和 ch 移植组织在流动条件下对细菌招募表现出相似的倾向。因此, 数据表明, 一般来说, 组织的来源及其表面结构以及特定的细菌粘合剂蛋白质本身并不是最初细菌粘附的主要决定因素。

一般来说, 在受感染的血管内部位引起炎症、组织损伤、血小板和纤维蛋白沉积的途径是由多个参与者1,

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致谢

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这项研究是由向生殖健康提供的研究基金 ku leuven (ot/14/197) 的赠款赞助的。trv 是佛兰德研究基金会的博士后研究员 (比利时;grant 编号-12k0916n) 和 rh 由 uz leuven 的临床研究基金提供支助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛心包膜 （BP） 贴剂，柔软的 Peri-Guard 心包Synovis Surgical Innovations，美国PC-0404SN
牛颈静脉导管 （BJV）Contegra 导管;美国美敦力公司M333105D001
CH 冻存同型移植物欧洲同型移植物库 （EHB）-
Acu-PunchAcuderm Inc，美国P850 （8 毫米）;P1050 （10 mm）
人白蛋白Flexbumin;Baxter， 比利时BE171464
LOT：16G12C
胰蛋白酶大豆汤 （TSB）Fluka， Steinheim， Germany22092-500G
心脏输液汤 （BHI）Fluka53286-500G
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。Gibco14190-094
5（6）-羧基荧光素 N-羟基琥珀酰亚胺酯 （CF）Sigma-Aldrich，德国21878-100MG-F
蠕动泵（型号 ISM444B）Ismatec BVP-Z 标准品;Cole Parmer， Wertheim， Germany631942-2
超声浴VWR 超声波清洗机;VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州142-6044230V/50 -60Hz 60VA;HF45kHz，30W
ProLong Gold 抗淬灭封片剂Invitrogen by ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000（荧光扫描仪）GE Healthcare Life Sciences，宾夕法尼亚州匹兹堡29027886
Arium Pro VF - 超纯水 - H2O MilliQMillipore87206462
显微载玻片 - 组织培养室（1 孔）Sarstedt94.6140.102
1 孔 Lumox 可拆卸Sarstedt94.6150.101
不锈钢 - 手术刀片Swann-Morton311
Tygon 硅胶管，1/8 英寸内径 x 1/4 英寸外径Cole-ParmerEW-95702-06温度范围：–80 至 200°C
灭菌：用环氧乙烷、γ 辐照或高压灭菌器 30 分钟，15 psi 压力
PharMed BPT 管Saint-GobainAY242012在 30&121&de 下可高压灭菌 121 分钟;C
Tygon LMT-55 管材Saint Gobain Performance Plastics™
温控器BMG BIOMEDIZINTECHNIK300-0042230V， 90VA， 50Hz
15312022

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
  2. Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).<....

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