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方法文章

一个 体外 平行板灌注系统模型用于研究细菌对移植物组织的黏附

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DOI：

10.3791/58476

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2019年1月7日

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1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

本文内容

摘要

我们描述了一种自行设计的 体外 流动腔模型，可用于研究细菌对移植物组织的黏附。

摘要

对于先天性心脏病患者，右心室流出道（RVOT）瓣膜置换术中会使用多种带瓣管道和支架瓣膜。然而，当使用人工材料时，这些移植物易发生细菌感染及多种宿主反应。

鉴定在微生物血管内定植过程中起关键作用的细菌和宿主因素，对于深入理解感染性心内膜炎（IE）等感染性疾病发病机制并制定预防策略具有重要意义。因此，建立能够在生理剪切力条件下研究细菌黏附的可靠模型十分必要。本文描述了一种新设计的 体外 基于平行板的灌注室，可研究细菌对移植物组织不同组分的黏附情况，例如暴露的细胞外基质、内皮细胞以及惰性区域。该方法结合菌落形成单位（CFU）计数，适用于在流动条件下评估移植物材料对细菌黏附的倾向性。此外，该流动腔系统还可用于探究在剪切力条件下血液成分在细菌黏附中的作用。我们利用自主设计的 体外 灌注模型

引言

金黄色葡萄球菌 (S. aureus利用多种毒力策略逃避宿主免疫防御系统，定植于植入人体循环系统的生物或非生物表面，从而导致严重的血管内感染，如败血症和感染性心内膜炎1,2,3,4,5人工心脏瓣膜植入术后，感染性心内膜炎（IE）仍是一种重要的治疗相关并发症，但导致IE发生的个体因素尚未完全明确。6,7在流动条件下，细菌会遇到剪切力，必须克服这些剪切力才能黏附于血管壁8允许在流动条件下研究细菌与假体瓣膜组织或内皮之间相互作用的模型具有重要意义，因为它们能够反映 体内 情况更加复杂。

多种特定机制促进细菌黏附于内皮细胞（ECs）以及暴露的内皮下基质（ECM），从而导致组织定植和赘生物成熟，这些是感染性心内膜炎（IE）早期的关键步骤9。已发现多种葡萄球菌表面蛋白或称为MSCRAMMs（识别黏附基质分子的微生物表面组分），可通过与纤连蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白以及血管性血友病因子（VWF）等分子相互作用，介导细菌对宿主细胞和ECM蛋白的黏附8,10,11。然而，鉴于某些毒力因子存在分子内折叠，且多数研究是在静态条件下进行的，这些相互作用在循环血液中的血管内感染环境下可能具有不同的生物学意义。

因此，我们介绍一种自主设计的 体外 平行板流动腔模型，可用于评估细菌在植入右心室流出道位置的组织移植物环境中对细胞外基质和内皮细胞不同组分的黏附情况。本研究所述方法的总体目的是在与体内相近的流动条件下，研究细菌与底层血管内组织之间的相互作用机制。 体内 血液系统病原体的环境，例如 S. aureus该新方法聚焦于移植物组织表面对抗细菌黏附的易感性，以识别感染性心内膜炎（IE）发生的潜在风险因素。

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方案

1. 准备移植组织用于 体外 研究

注意：使用了三种类型的组织：牛心包补片（BP）、冷冻保存同种异体移植物（CH）和牛颈静脉移植物（BJV）。对于BJV管道和CH（由欧洲同种异体库（EHB）处理并储存在液氮中待用的组织），均使用其管壁和瓣膜小叶。BP补片和BJV管道购自制造商。使用前，按照EHB的说明对CH进行解冻12。

  1. 使用前，用0.9% NaCl冲洗所有组织。
  2. 使用一次性皮肤活检打孔器制备组织活检样本，切割成圆形组织片（直径10 mm）。
  3. 使用一次性无菌手术刀将所有组织片修整至相同高度。
  4. 对于经戊二醛固定的组织（例如 BJV导管），将移植物片段在4 °C下与200 g/L人血清白蛋白共同孵育过夜，以中和固定剂。
  5. 在微量滴定板中用0.9% NaCl洗去戊二醛残留物。  重复3次，每次1分钟。

2. 灌注实验前细菌的准备

注意：使用了三种细菌分离株：S. aureus Cowan（ATCC 12598）、S. epidermidis ATCC 149900 和 S. sanguinis NCTC 7864。S. aureus 和 S. epidermidis 在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中于 37 °C 培养，S. sanguinis 在脑心浸液肉汤（BHI）中于 37 °C、5% CO2 条件下培养。

  1. 在固体血琼脂平板上制备细菌的过夜培养物。
    1. 使用无菌接种环刮取冻存的细菌，接种至Mueller-Hinton血琼脂平板上，在37 °C条件下过夜培养。
  2. 使用无菌接种环从过夜培养的血琼脂平板上挑取单个菌落，接种至14 mL试管中的10 mL TSB或BHI培养基中，在37 °C条件下过夜培养。
  3. 将过夜培养物离心（3000 × g，4 °C，10分钟），用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬菌体沉淀。将14 mL试管置于冰上。
  4. 配制3.7 mg/mL的5(6)-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯（CF）乙醇溶液，并于-20 °C保存。使用“超纯水”将CF储备液进一步稀释至150 µg/mL。
    注意：使用铝箔包裹试管以避光，并于-20 °C保存。
  5. 将细菌离心（3000 × g，4 °C，10分钟），用800 µL PBS重悬菌体沉淀，加入200 µL 150 µg/mL的CF溶液（灌注实验终浓度为30 µg/mL）。用铝箔包裹试管避光，于旋转摇床上孵育30分钟。
  6. 标记完成后，加入含2%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液进行封闭，离心（3000 × g，4 °C，10分钟）。随后用10 mL PBS洗涤一次，并通过离心（3000 × g，4 °C，10分钟）收集菌体沉淀。
  7. 用PBS稀释细菌，获得107菌落形成单位（CFU）/mL的菌液（通过在Mueller-Hinton血琼脂平板上进行CFU计数验证），其对应的OD600（光密度）为0.65。在进行灌注实验前，将试管置于冰上并避光保存。
    注意：需注意OD600测定值反映的是细菌数量的近似值。为准确确定接种剂量，还需通过连续稀释法对基于OD值估算的数量进行验证，具体步骤见第3.8节。

3. 体外 使用平行板流动腔的灌注实验

  1. 将直径为10 mm、厚度一致的组织活检样本（按步骤1.1–1.5制备）安装至流式腔室系统中，使组织内表面朝上，以接触细菌悬液。
    注意：不同移植物间保持相同的组织厚度，可确保通道内达到一致的组织高度，从而在所有条件下实现层流。灌注室的各个组成部分均已展示并描述于 图1.
    1. 首先，将圆形组织样本置于带有8 mm圆形穿孔的载玻片与橡胶垫圈之间。
      注意：显微镜载玻片具有超薄底部薄膜，以便形成8 mm的孔。与橡胶片共同作用，可固定组织，使样本与流动介质直接接触，并防止实验过程中活检组织发生移位。暴露于流动环境（直径较小）的受检组织表面不可用镊子触碰。
    2. 将带有组织的持样器插入腔室底部金属框架中嵌入的垫圈片内。 
    3. 将上部金属框架连同相应的垫片一起安装到已插入组织支架的腔室底部。随后用八颗螺钉和螺母将整个腔室固定。确保各移植物之间的腔室高度保持一致。
      注意：每次拧紧螺丝后均应确定腔室高度。使用卡尺或直尺进行测量。
  2. 将流室通过管路与蠕动泵和流体储液器连接。
  3. 用10的悬浮液灌注组织7 CFU/mL（通过CFU计数验证，并与OD相关）600 在 PBS 中以 3 dyne/cm 的剪切应力对荧光标记的细菌进行测量2 （达因每平方厘米压力单位）通过蠕动泵（流速 4 mL/min）使用 400 mL 细菌储液器持续灌注 1 小时（自主研发设计， 图1) 使用平板恒温器在 37 °C 条件下孵育材料表).
  4. 持续循环100 mL细菌悬液 使用相同的 收集储液槽
  5. 灌注后，拆卸灌流室以取出移植物，并将组织样本清洗两次 4 mL PBS 在12孔板中使用实验室轨道摇床振荡3分钟。随后使用较小直径的皮肤活检打孔器切割移植物的内部区域。
  6. 将每份组织活检样本分别放入一个 14 1 mL无菌0.9% NaCl的离心管，标记为#1。
  7. 使用超声波清洗仪将细菌从组织上分离，处理10分钟（振幅100%，频率45 kHz）。
    注意：应在TSB液体培养基中37 °C过夜孵育移植物后，通过OD评估细菌是否完全从组织移植物上脱离600 与使用无菌溶液处理的对照组样本相比的测量结果。
  8. 在 Mueller-Hinton 血琼脂平板上采用连续稀释法计数菌落形成单位（CFUs）。
    1. 制备一份14 mL无菌盐水试管中，制备成 超声处理后获得的细菌悬液进行连续稀释。将此试管标记为#2。
      注意：每次组织实验需准备一支含10 mL 0.9% NaCl的试管。
    2. 准备三个14 用于对步骤2.7中的初始细菌悬液进行系列稀释的10 mL无菌0.9% NaCl试管。将试管标记为#3、#4、#5。
      注意：此步骤对于确定用于灌注实验的细菌悬液中的实际菌落形成单位（CFU）数量是必要的。
    3. 涡旋振荡每支试管15秒。对含有组织活检样本以及初始样本的试管也进行涡旋振荡。 细菌悬液以进行连续稀释。
    4. 准备三个琼脂平板，其中两个用于组织实验（细菌灌注和PBS对照灌注），第三个用于灌注所用的初始细菌悬液。
    5. 每块培养板按以下方式标记三个区域用于组织实验：10-1, 10-3 和 10-4. 计数CFU数量的方法如下 细菌灌注液，标记 如下接种平板：10-1, 10-3, 10-5 和 10-7.
      注意：琼脂平板上的所有标记，例如 10-1, 10-3 以及后续操作均指第二天计算出的每毫升菌落形成单位（CFU/mL）的最终数值。对照平板无需分区。使用前，应将血琼脂平板置于超净工作台内，打开皿盖以去除多余水分。
    6. 继续准备 系列稀释，将100 µL的1号管液体转移至2号管，用涡旋振荡器充分混匀。
    7. 将试管#1和#2中的内容物各100 µL分别涂布于对应的区域10-1 和 10-3 琼脂平板的区域。同样，将10 µL的2号管液体涂布于10号区域-4，重复此步骤4次，从每10 µL体积中获得4个独立的菌落生长。
      注意：由于用于接种到第10区的体积较小-4建议制备多个液滴，以获得生长的菌落形成单位（CFUs）的平均数量。
    8. 制备初始样品的系列稀释液 培养：从步骤2.7中取100 µL细菌悬液转移至3号管，用涡旋振荡器充分混匀。取100 µL 3号管溶液加入4号管中，充分混匀，随后按同样操作依次对后续的5号管进行处理。
    9. 分别取100 µL第3、4、5号试管及调整浓度后的细菌悬液（步骤2.7）中的内容物，均匀涂布于分区10的各个区域-3, 10-5, 10-7 和 10-1 血琼脂平板的
    10. 将血琼脂平板置于超净工作台中晾干细菌涂布，通常为10分钟。随后将平板于37 °C过夜培养。
    11. 过夜培养后，计数细菌菌落以获得黏附于组织活检样本上的菌落形成单位（CFUs）数量，以及 灌流所用起始细菌悬液中的菌落形成单位浓度（CFU/mL）。结果以 CFU/cm 表示2.

4. 灌注后细菌黏附于移植物组织的荧光显微镜观察

  1. 灌流后，用 PBS（参见步骤 3.5）清洗组织块，并使用较小直径的打孔器切割移植物的内部部分。
  2. 准备一个 6 孔板，并在其中放置数滴封片介质（材料表）。
  3. 将每块组织的灌流面朝下放置于单滴封片介质上。
  4. 使用荧光扫描仪（材料表）读取平板。根据用于细菌标记的荧光染料设置激发和发射波长参数。

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结果

为了更好地理解其背后的机制 IE 发展过程中，该模型可用于评估与细菌和组织相关的各种因素 体内 感染发生的情况。

具体而言，这种新型的 体外 该方法通过在不同移植物组织上灌注荧光标记的细菌，并施加生理范围（3 - 10 dyne/cm）内的剪切应力，可在流动条件下定量测定细菌黏附情况。2 对于RVOT，本研究采用4 mL/min的流速，相当于3 dyne/cm。2考虑到所有组织片的通道高度均为0.3 mm，移植移植物与培养基入口之间的距离约为39 mm，灌注室（如图所示） 图1）可确保充分发展的层流（雷诺数 Re = 3.89，显著低于 2000；入口段长度 = 0.05 mm，显著小于入口-移植物距离，符合假设适当流动模式所需的参数）。

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讨论

近期临床观察特别关注肺动脉瓣置换术后患者发生感染性心内膜炎作为并发症的情况6,13植入瓣膜在感染性心内膜炎中的功能障碍是细菌与血管内移植物相互作用导致广泛炎症反应和促凝反应的结果1,14. 所介绍的新型 体外 该模型使我们能够探究组织结构和细菌因素的差异是否可能调节对感染的易感性 体内 使用的移植物15BJV 和 CH 移植物组织在流动条件下表现出相似的细菌招募倾向。因此，数据表明，总体而言，组织来源及其表面结构，以及特定的细菌黏附蛋白 本身 不是细菌初始黏附的主要决定因素。

通常，感染性血管内皮部位的炎症反应、组织损伤、血小板聚集和纤维蛋白沉积等通路由多种因素共同激活1,

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致谢

本研究由鲁汶大学研究基金（OT/14/097）资助，该基金授予RH。TRV是弗拉芒研究基金会-弗拉芒（比利时；资助编号 - 12K0916N）的博士后研究员，RH还获得鲁汶大学医院临床研究基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛心包（BP）补片，柔软型 Supple Peri-Guard 心包Synovis Surgical Innovations，美国PC-0404SN
牛颈静脉导管（BJV）Contegra 导管；Medtronic 公司，美国M333105D001
CH 冷冻保存同种异体移植物欧洲同种移植物库（EHB）-
Acu-Punch 打孔器Acuderm 公司，美国P850（8 mm）；P1050（10 mm）
人血清白蛋白Flexbumin；Baxter，比利时BE171464
批号：16G12C
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）Fluka，德国施泰因海姆22092-500G
心浸液肉汤（BHI）Fluka53286-500G
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190-094
5(6)-羧基荧光素 N-羟基琥珀酰亚胺酯（CF）Sigma-Aldrich，德国21878-100MG-F
蠕动泵（型号 ISM444B）Ismatec BVP-Z Standard；Cole Parmer，德国韦尔泰姆631942-2
超声波清洗机VWR 超声波清洗器；VWR，美国拉德诺142-6044230V/50 -60Hz 60VA；HF45kHz，30W
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Invitrogen by ThermoFisherP36930
InCell Analyzer 2000（荧光扫描仪）GE Healthcare Life Sciences，美国宾夕法尼亚州匹兹堡29027886
Arium Pro VF - 超纯水 - H2O MilliQMillipore87206462
显微载玻片 - 组织培养腔室（单孔）Sarstedt94.6140.102
Lumox 可拆卸单孔培养皿Sarstedt94.6150.101
不锈钢外科刀片Swann-Morton311
Tygon 硅胶管，1/8"ID × 1/4"ODCole-ParmerEW-95702-06温度范围：–80 至 200°C
灭菌方式：环氧乙烷、γ射线辐照或高压蒸汽灭菌（30 分钟，15 psi 压力）
PharMed BPT 管Saint-GobainAY242012可高压灭菌，121°C 下 30 分钟
Tygon LMT-55 管Saint Gobain Performance Plastics™15312022
恒温器BMG BIOMEDIZINTECHNIK300-0042230V，90VA，50Hz

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