需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用多个平行板流动腔对暴露于剪切应力下的内皮细胞进行基因表达分析

8.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58478

⸱

2018年10月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

本文内容

摘要

本文介绍了一种在流体剪切应力条件下培养内皮细胞并进行基因表达分析的工作流程。该流程包括一种物理装置，可在受控环境中同时容纳和监测多个流动腔室，并采用外源性参照RNA进行定量PCR分析。

摘要

我们描述了一种利用多个监测式平行板流动腔分析经稳态层流作用的内皮细胞基因表达的工作流程。内皮细胞构成血管的内层细胞衬里，长期暴露于血液流动所产生的摩擦力，即剪切应力。在生理条件下，内皮细胞在多种剪切应力环境中发挥功能。因此，在体外实验中施加剪切应力条件对于研究内皮细胞的生物学行为至关重要。 体外 模型可更深入地揭示内皮细胞的反应 体内Lane先前发表的平行板流动腔 等9 适用于研究稳态（非脉动）层流存在与缺失条件下内皮细胞基因表达的调控。本文所述层流实验装置的关键改进包括：设有专门的大空间环境以容纳多个并行的流体回路，实时监测流速，以及在定量实时PCR数据分析中引入外源性参照RNA进行归一化处理。为在施加剪切应力的同时评估多种处理/条件，我们在同一温控恒湿培养箱内同步运行多个流体回路和泵。每个流体回路的流速均被连续实时测量，以确保整个实验过程中剪切应力条件的一致性。由于此类实验涉及多个实验条件，我们还使用一种外源性参照RNA，在RNA提取时加入，用于校正RNA提取效率及第一链cDNA合成效率的差异。这些措施可显著降低样本间的变异。该策略已整合至我们基于平行板流动腔开展剪切应力实验的基因表达分析流程中；但其中部分策略（如外源性参照RNA加标）亦可简便、经济地应用于其他研究场景。

引言

血管内皮细胞构成高等物种封闭心血管系统中血管的内层细胞衬里。它们形成血液与组织之间的界面，并具有管腔面和管腔外表面。内皮组织是一个多样化、活跃且具有适应性的系统，可调节血流、营养物质运输、免疫反应以及新生血管的形成1。在体内，内皮细胞通常存在于受到循环摩擦力——即剪切应力——作用的环境中2。剪切应力是调控内皮细胞基因表达的重要因素3，内皮细胞会努力将剪切应力维持在一定范围内2,4。在缺乏剪切应力的情况下，内皮细胞会表现出促血管生成的模式5，从而改善组织灌注。局部区域的紊乱血流和异常剪切应力与炎症相关基因的表达6以及动脉粥样硬化的发生发展密切相关7,8。因此，包含剪切应力的模型对于理解内皮细胞基因调控机制至关重要。

我们描述了一种在剪切应力条件下研究血管内皮细胞基因调控的方法。该系统采用非脉动流动，模拟动脉内皮细胞所处环境中的流体剪切应力水平和氧浓度。本方案包括利用RNA干扰（RNAi）进行基因敲低的方法、使用平行板流动装置施加剪切应力的设置，以及在进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析前加入外源性参照RNA的技术。该流程可用于研究层流剪切应力存在或缺失条件下内皮细胞的基因调控，并对Lane et al.9所述的平行板流动装置进行了改进。该特定装置设计用于同时评估多种实验条件，从而实现对不同剪切应力条件的直接比较以及RNA分析的标准化。系统配备一个大型恒温恒湿培养单元，可同时运行多个独立的流动腔室和泵，并实时监测每个流动腔组件的流速。本装置主要用于在层流/剪切应力条件下利用RNAi进行基因敲低研究，但该方案中的部分技术也可适用于任何RNA表达水平的检测。

用于内皮细胞施加剪切应力的常用方法包括微流控系统10、锥板式黏度计11和平行板流动腔12。来自不同制造商的微流控系统已被广泛应用于多种细胞和组织类型以及各种生物物理刺激下的力学生物学和力传导研究。对于内皮细胞，这些系统已被用于研究内皮细胞本身，以及内皮细胞与免疫细胞或肿瘤细胞迁移之间的相互作用10。然而，这些系统在获取大量细胞方面适用性较差9。锥板式黏度计和平行板流动腔均允许从融合的单层细胞中回收大量细胞12。这些系统能够产生多种剪切力和流动模式12。平行板流动腔装置9的优势在于，可通过玻璃窗口进行实时成像，以在任意时间点评估细胞形态。此外，灌注液可在无菌条件下收集。对于本文所介绍的系统，还可实现多腔室设置下的实时流动监测，有助于维持各腔室之间的剪切条件一致性。

在代表性实验中，采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），该细胞代表大血管内皮细胞类型，所使用的剪切应力条件（1 Pa）反映了动脉环境（0.1 - 0.7 Pa）。然而，本方案也可适用于其他类型的内皮细胞，并可根据具体实验需求调整剪切应力条件。例如，在模拟静脉循环条件下研究人内皮细胞时，需使用较低的剪切应力水平（1 - 6 Pa）；而在模拟微血管循环的研究中，通常采用的剪切应力范围为 0.4 - 1.2 Pa13,14。此外，即使在同一血管内的内皮细胞之间，剪切应力也可能存在差异6。在当前的系统设置中，使用一个监测系统可同时监控四个独立的流体回路。对于需要更多流体回路的实验室，专用环境中仍留有空间以增加额外的监测系统。

RT-qPCR 用于在剪切应力条件下对基因表达进行绝对定量。目标基因的相对表达水平常用于比较不同条件下的 RNA 表达。某些 RNA 分子可能以极低的量存在或完全缺失，从而增加相对测量的复杂性。例如，内皮细胞中的长链非编码 RNA 可在每细胞相对较低的拷贝数下发挥显著作用5此外，引物效率的差异可能导致采用delta-delta循环阈值（Ct）法分析数据时产生不准确的解释。为解决这一问题，我们通过使用已知量的质粒DNA生成标准曲线，进行绝对定量。此外，互补DNA（cDNA）合成是一个效率较低的过程，cDNA合成效率的差异可能导致不同实验条件或不同样本间RNA表达水平的差异15剪切应力和/或转染试剂的应用可能影响细胞增殖、凋亡和活力，或引入可能干扰RNA提取和/或cDNA合成的成分。为校正RNA提取和cDNA合成过程中可能产生的偏差，我们使用在实验室中合成的外参RNA对照，在RNA提取时加入，并在每次cDNA合成中进行检测。 通过 RT-qPCR。这不仅可以校正RNA提取和cDNA合成过程中的技术差异，而且在已知细胞数量时，还可用于计算每个细胞中目标分子的绝对数量。

该系统采用额外的步骤来维持不同条件之间的相似性，或弥补技术上的差异。我们特别强调这些步骤，因为这些实验具有复杂的性质，涉及多种物理装置和实验条件，可能导致实验结果的变异性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 外源性参照RNA的制备

注意：选择一种在目标物种或模型中不存在的外源性参照 RNA。对于哺乳动物系统，可使用萤火虫荧光素酶 RNA。

  1. 外源性参考RNA质粒的线性化
    1. 至少在预计进行RNA提取前48小时制备外源性参照RNA。获取或构建所选外源性参照RNA的cDNA克隆，例如萤火虫荧光素酶cDNA克隆，并将其插入适合的质粒载体中 体外 转录（参见 材料清单).
    2. 进行限制性内切酶（RE）消化 1 µg 全长质粒（萤火虫荧光素酶质粒为 pSP-luc+，含 4100 bp）使用单一切点限制性内切酶（RE）进行消化XhoI在1.5 mL离心管中进行。选择一种在异源参考RNA序列3’端仅切割一次（即质粒中单一切点）并产生5’突出端或平末端的限制性内切酶（RE）。对于常规制备，需平行进行七组质粒线性化反应（步骤1.1.4–1.1.7），以获得足够浓度和数量的RNA，用于完成一组实验或一个项目。
      1. 使用分光光度法或荧光分光光度法测定质粒浓度。
      2. 在每支试管中配制限制性内切酶（RE）混合液：加入 4 µL 的 XhoI (20,000 单位/mL) 8 µL x 微升 RE 缓冲液 µL 质粒的1 µg），以及充足的 H2O 以达到总体溶液的体积 80 µL.
      3. 将限制性内切酶反应混合物在37 °C下孵育2小时 37 °C. 按照生产商的说明书使用限制性内切酶（RE），任何修改都可能导致星号活性增加或对靶DNA的非特异性切割。将反应混合物在 65 °C.
      4. 通过乙醇沉淀法终止每个管中的限制性内切酶消化反应。向限制性内切酶反应混合物中直接加入 4 µL 0.5 M EDTA，pH 8.0 8 µL 3 M 醋酸钠 pH 5.2 的 184 µL 100% 乙醇。充分混匀，并将混合物于 -20 °C 30 分钟
      5. 离心混合物 4 °C 20 分钟，相对离心力（RCF）为 16,100 x g.
      6. 用细尖吸头移除上清液，切勿触碰沉淀。将沉淀在空气中干燥 5 分钟，然后重悬于 6 µL H的2O（加热至 37 °C通过上下吹打5至10次。
      7. 通过在含有溴化乙锭（EtBr）的2%琼脂糖凝胶上电泳检测消化产物，并同时加入1 kb+ DNA标记、超螺旋标记以及已切割和未切割的质粒，以确认荧光素酶质粒的线性化。观察凝胶结果后，继续进行下一步操作 体外 转录，如果切开的质粒条带在约 4 kb 处显示单一条带（未切开的质粒将显示三条条带）； 图1).
        注意：溴化乙锭（EtBr）具有致癌性。应在化学通风橱中操作。
  2. 在 体外 外源性参照RNA质粒的转录
    1. 对每管消化后的质粒产物，进行以下操作 体外 转录使用一个 体外 转录方法（参见 材料清单）。遵循制造商的说明，并使用适当的噬菌体RNA聚合酶。如果cDNA合成方法需要poly(A)尾，或其他应用需要poly(A)尾，则选择一种合适的方法 体外 转录，包括添加 poly(A) 尾巴（参见 材料表).
    2. 合并全部 体外 将转录产物收集至一个1.5 mL聚丙烯管中，再进行纯化。
  3. 纯化从RNA的分离 体外 转录反应
    1. 纯化 体外 转录产物，带有 体外 转录纯化试剂盒（参见 材料列表）。请遵循制造商的说明书。
    2. 使用分光光度法通过测量260 nm处的吸光度评估RNA浓度。
      注意：RNA 浓度通过比尔-朗伯定律计算。该定律指出，核酸在 260 nm 处具有强吸收峰，其吸光度与浓度成正比。吸光度 1.0 相当于 40 µg/mL 单链RNA
  4. 将储备RNA分装至PCR管中以供实验使用
    1. 确保RNA浓度为 1 µg/µL.
      1. 如果RNA浓度为 > 1 µg/µL，将原液稀释至 1 µg/µL分装 1 µL 放入PCR管中，并于-80 °C.
      2. 如果RNA浓度是 < 1 µg/µL，可根据试剂盒制造商的说明书，使用试剂盒中提供的 5 M 醋酸铵进行额外沉淀。如果 RNA 浓度仍然 < 1 µg/µL，继续进行分装 1 µL 加入PCR管中。

2. 载玻片包被

注意：步骤 2.1 - 2.10 应在预计接种细胞前 24 - 48 小时进行。

  1. 将烤箱预热至 250 °C。
  2. 戴上无菌手套，用铝箔将每张玻片包裹两层。避免直接接触玻片表面。
  3. 将玻片放入烤箱中，在 250 °C 下烘烤 1 小时，然后让玻片冷却至室温。
    注意：此步骤对于消除任何污染性内毒素至关重要。
  4. 在玻片冷却期间，用蒸馏水配制 1 mg/mL 的纤连蛋白储存液，并在 37 °C 下孵育 30 分钟以充分溶解。分装成 100-µL 每份。将用于即时实验的分装样品留出，其余分装样品冷冻保存以备后续使用。
  5. 在将玻片放入生物安全柜前，先移除外层铝箔。步骤 2.6 - 2.7 和 2.9 应在生物安全柜内进行。
  6. 将玻片放入无菌的矩形 4 孔细胞培养板中。
  7. 用蒸馏水将纤连蛋白储存液按 1:100 比例稀释。使用移液器逐滴加入 1 mL 稀释后的纤连蛋白溶液覆盖每张玻片，确保整个玻片表面均被覆盖。
  8. 将玻片置于 37 °C 细胞培养箱中孵育 24 - 48 小时。
  9. 孵育结束后，通过倾斜 4 孔细胞培养板的方式吸除纤连蛋白溶液。避免使用移液器直接接触玻片表面。

3. 将细胞接种到玻璃载片上

  1. 计数早期传代（第2至5代）的人内皮细胞，并将约1.0 × 106个细胞接种到每个经纤维连接蛋白包被的玻璃载片上，使用1 mL培养基（即细胞密度为1.0 × 106个细胞/mL培养基）。若无其他处理步骤，应在预计施加层流前24小时接种细胞。
    注：这些数值适用于进行24小时流体刺激的实验，可作为参考。
    1. 调整接种密度，以确保在细胞收获和RNA提取时形成融合的单层细胞。
  2. 将细胞在37 °C下静置15分钟，使其贴附于载片表面。
  3. 在细胞培养皿的每个孔中加入3 mL培养基，完全覆盖载片，并在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。

4. 小干扰RNA（siRNA）转染

  1. 用于 siRNA 转染和流式实验的玻片细胞准备
    1. 按照步骤 2（玻片包被）和步骤 3（细胞接种至玻片）中的方案进行流式实验所需的玻片准备与包被。
    2. 在 siRNA 处理前 24 小时接种细胞（即在施加层流前 48 小时）。
    3. 在无抗生素培养基中接种人源内皮细胞，每张玻片接种量为 750,000 至 1 × 106 个细胞，以确保次日细胞融合度达到 85%–95%。
      注：本方案使用 HUVEC 细胞。
  2. siRNA-脂质转染试剂复合物的制备（每张玻片）
    1. 设计定制 siRNA 或订购预合成的靶基因 siRNA。
      注：以下步骤均需在生物安全柜中操作。
    2. 取 6 µL siRNA（20 µM 储存液）加入 414 µL 低血清培养基中（参见材料表），用移液器轻轻混匀。
    3. 将 49.5 µL 已轻柔混匀的脂质转染试剂（参见材料表）稀释于 130.5 µL 低血清培养基中。
    4. 轻柔混匀后，室温孵育 5 分钟。
    5. 将稀释后的 siRNA 与脂质转染试剂混合，轻柔混匀，室温孵育 15 分钟。操作过程中应轻柔混合，避免破坏脂质转染试剂复合物。
      注：复合物形成过程中溶液可能呈现浑浊。
    6. 在复合物形成期间，吸除细胞培养液，并用低血清培养基洗涤细胞 1 次。
    7. 向每张玻片加入 2.4 mL 低血清培养基。
    8. 向每张玻片加入 600 µL 轻柔混匀的 siRNA-脂质转染试剂复合物，前后轻摇玻片使混合均匀。确保 siRNA 的终浓度为 40 nM，并确保玻片表面完全被覆盖。
    9. 将细胞在 37 °C 下孵育 4 小时。
    10. 不移除转染混合物，直接加入 1 mL 无抗生素的内皮细胞生长培养基，其中胎牛血清（FBS）浓度为常规浓度的 3 倍。
    11. 将细胞在 37 °C 下继续孵育，直至后续实验使用。

5. 基于目标剪切应力计算流速9

  1. 根据以下公式，依据期望的剪切应力计算流速：
    流体动力学公式 Q=τwh²/6μ，用于流速计算的方程表示。
    其中，
    Q 表示流速，单位为 mL/min；
    τ 表示期望的剪切应力，单位为 dynes/cm2（1 Pa = 10 dynes/cm2）；
    w 表示平行板流动腔室的宽度，单位为 cm；
    h 表示平行板流动腔室的高度，单位为 cm；
    µ 表示培养基的黏度，单位为 cP（g/cm·s）。
    注意：本工作流程中典型的层流剪切应力实验（非脉动）在 τ = 1 Pa（10 dynes/cm2）条件下进行。µ 可使用黏度计（如锥板黏度计）测量，其数值会因培养基成分（包括血清和额外添加的右旋糖酐）而变化9。
  2. 为达到特定的 τ（剪切应力），可调节流速和/或黏度。在较高流速下，贴壁细胞可能从载玻片上脱落。典型流动腔室的示例流速见表 1。

6. 监测系统与多个平行板流动腔专用环境的设置（图2）

  1. 使用一个大型加热单元/培养箱，其配备多层搁架、内部电源接口和玻璃门——该装置被称为BEACH（可调节CO₂的内置环境）。2 以及热处理）——用于同时容纳多个流体室，适用于需要剪切应力以及两种或以上处理方式或输出结果之间直接比较的实验（即，DNA、RNA 和蛋白质。
    注：BEACH 可实现对流路（包括流速）的频繁监测，而无需频繁干扰环境。
  2. 确保充足的 CO₂2 可用于本实验，且 CO2 监测器功能正常。确保水槽中加有适量水，以产生加湿空气。

7. 平行板流动装置的设置

注意：关于平行板的制造，请参见 Lane et al.9。

  1. 对每套平行板流动腔装置所需的流动腔板、储液器、减震器、管路和鲁尔接头进行高压灭菌，具体操作如……所示 表2.
  2. 流路循环装置的组装（图3）。
    1. 将无菌毛巾放入生物安全柜中。在生物安全柜内组装流环系统，最初不连接平行板流动腔。
    2. 连接储液罐的管路组件：
      1. 将一根#14硬管插入流体储液槽盖子的一个孔中，再将两根#14软管插入另外两个孔中。确保其中一根软管触及储液槽底部 流出 管路
      2. 在14号硬管末端安装一个1/16英寸雄性鲁尔接头，并连接一个无菌滤器作为通气口。
      3. 在#14软管末端安装一个1/16英寸的雌性鲁尔接头 流入 来自储液器的管子，连接一个四通旋塞阀。
        注意：对于无需收集灌流液的基因表达分析或其他研究，本方案中可使用双向停流阀代替四向停流阀。
      4. 在来自储液罐的#14号软质流出管末端安装一个1/16英寸的公型鲁尔接头。
    3. 将储液器出流管路与泵管路连接：取一段#13硬管（泵管），在其两端各安装一个1/16英寸雌性鲁尔接头。通过将1/16英寸雄性与雌性鲁尔接头对接，将储液器的#14软出流管连接至#13硬管。
    4. 将泵管与“减震桥”管连接：取一段#16软管，两端分别安装1/8英寸公鲁尔接头和1/8英寸母鲁尔接头。将#13硬管（位于泵管出口端）的1/16英寸母鲁尔接头与#16软管的1/8英寸公鲁尔接头相连。
    5. 组装流动阻尼器管路：将一个3/16”公制鲁尔接头安装至#25软管的一端，并在流动阻尼器的另一侧重复此操作。将#25软管的自由端分别连接至流动阻尼器的两侧。
    6. 将“阻尼桥”管路与流量阻尼器的管路连接：使用 #16 “阻尼桥”侧的 1/8” 母鲁尔接头和 #25 阻尼器软管侧已安装的 3/16” 公鲁尔接头，将流量阻尼器的 #25 软管与“阻尼桥”的 #16 软管相连。
    7. 组装“腔室连接桥”管路：
      1. 在 #16 软管（“腔室连接”管）的两端分别安装一个 1/8” 女式鲁尔接头和一个 1/8” 男式鲁尔接头。
      2. 将“腔室桥”的1/8英寸雌性鲁尔接头与减流器自由端的#25软管上的3/16英寸雄性鲁尔接头连接。
      3. 在“腔室连接管”的1/8英寸雄性鲁尔接头（自由端）上安装一个四通旋塞阀。
    8. 将“腔室桥”自由端的四通旋塞连接到储液器流入软管的四通旋塞（来自步骤 7.2.2.3）。关闭旋塞。
    9. 向储液槽和缓冲槽中加入培养基。对于48小时的剪切应力暴露，向储液槽中加入35 mL培养基，向缓冲槽中加入25 mL。根据流动实验的持续时间及接种细胞的数量调整培养基的体积。
    10. 将组装好的流动回路系统移至 BEACH 中的泵处。将 #13 硬管（泵管）放入泵头内并固定。打开活塞。
    11. 打开泵并缓慢提高泵速。让培养基在循环系统中流通。检查是否存在任何泄漏或堵塞现象。例如，压力积聚）。确保培养基回流至储液槽。
  3. 流室组件的安装
    1. 在 #16 软管的一端安装一个 1/8 英寸的雌性鲁尔接头，并连接一个四通旋塞阀。将管子的另一端自由端连接到 右侧 顶板的一侧（流入 侧
    2. 在一根#16软管的一端安装一个1/8英寸雄性鲁尔接头，并连接一个四通旋塞阀。将管子的另一端自由端连接至 左侧 顶板的一侧（流出 侧
    3. 在 #16 软管（气泡捕集管）的两端分别安装一个 1/8” 阳鲁尔接头和一个 1/8” 阴鲁尔接头。将该管路连接至气泡捕集器 通过 1/8英寸公鲁尔接头。将一个四通旋塞阀连接到管路的另一端 通过 1/8英寸雌性鲁尔接头
    4. 使用无菌镊子将接种有细胞的玻片从4孔细胞培养板转移至底板的凹槽内，确保接种有细胞的一面朝上。
    5. 使用10 mL注射器，将10 mL预热的培养基加入培养板红色垫圈线范围内的底部区域。使培养基流经载片并覆盖细胞，避免直接将培养基滴加在载片上。
    6. 将上层板轻轻放置在底层板上，从一侧向另一侧对齐，避免引入气泡。将两板紧密拧紧。
    7. 通过打开平板右侧（流入侧）的旋塞，用30 mL注射器缓慢冲洗20 mL温热培养基，以去除气泡捕集阱中的气泡。确保平板左侧（流出侧）的旋塞处于关闭状态，并且培养基流经气泡捕集阱的旋塞（保持开启）。弃去冲洗用过的培养基。
    8. 关闭气泡捕集器上的活塞，打开腔室左侧（流出侧）的活塞。将腔室左侧（流出侧）抬高至 45° 从室的右侧（流入侧）使用30 mL注射器缓慢注入20 mL预热培养基，以排出室内的气泡。可通过观察窗观察气泡。弃去冲洗后的培养基。
    9. 关闭腔室两侧的旋塞并加盖。通过显微镜观察细胞。
    10. 将培养室连同先前组装好的循环系统一起运送到海滩。
    11. 缓慢降低泵速并暂停泵的运行。关闭流路系统中的旋塞，以防止泄漏。
    12. 将腔室与循环系统连接在一起 通过 旋塞。打开所有的旋塞。
    13. 缓慢增加泵速，检查装置是否存在任何泄漏或堵塞。确保培养基沿单一方向循环并流回储液槽。
    14. 将流量传感器放置在腔室流入端的“腔室桥”管路上。确保传感器的方向与流动方向一致。
    15. 调节泵速，以获得根据目标剪切应力先前计算出的流速。
      注意：流速可能因每个腔室的高度和宽度以及培养基的黏度而异。
    16. 打开 CO₂ 培养箱2 罐中以达到5% CO2 并在 BEACH 内放置一个水盘。

8. 收集细胞并从流室中提取RNA

  1. 当完成所需的流动时间后，缓慢将蠕动泵的转速调至0，并关闭电源。迅速关闭所有打开的旋塞阀，取下腔室及两端带有旋塞阀的连接管路。
  2. 将腔室转移至洁净的实验台，轻轻拧下所有螺丝以取下顶板。使用尖头镊子从底板上取出玻璃载片，并将其放入一个直径为100 mm的细胞培养皿中。
  3. 用10 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（无钙、无镁，PBS -/-）清洗载片，并在显微镜下检查细胞，以确认细胞沿流动方向贴附并排列整齐。
  4. 吸除培养皿中的PBS，将载片转移至另一个洁净的直径100 mm的培养皿中。向载片上加入350 µL RNA提取试剂盒中的裂解缓冲液（参见材料表），其中需添加1/100体积的β-巯基乙醇。
    注意：β-巯基乙醇应在化学通风橱中添加。
  5. 使用聚乙烯刮片将细胞从载片上刮下。倾斜细胞培养皿，使液体聚集于底部，然后用镊子取出玻璃载片。将细胞裂解液用移液器转移至1.5 mL离心管中，并置于冰上保存。
  6. 在将外源性参照RNA（荧光素酶RNA）加入样品前，通过逐级稀释将其原液稀释至0.0025 ng/µL。例如，若原液浓度为1 µg/µL，则需进行1/400,000倍稀释以达到0.0025 ng/µL。向每份细胞裂解液样品中加入10 µL稀释后的荧光素酶RNA，用于后续的RNA分离与分析。
  7. 按照试剂盒制造商提供的说明进行RNA提取操作，或将裂解液在-80 °C下冷冻保存，待后续进行提取。

9. RNA 提取与 cDNA 合成效率的计算

注意：通过比较理论产量与实验产量，在 RT-qPCR 后计算荧光素酶效率。

  1. 确定荧光素酶RNA的理论产量。
    1. 确定每个样本中添加的荧光素酶拷贝总数。（在RNA提取前，每样本添加0.025 ng = 每样本2.73 × 107个荧光素酶RNA拷贝。）
    2. 利用每个核苷酸的平均分子质量330 g/mol，乘以萤火虫荧光素酶RNA的长度（1652个核苷酸），计算荧光素酶RNA的分子质量。
    3. 将RNA提取前每个样本添加的荧光素酶RNA量（0.025 ng）除以分子质量，得到摩尔数；再乘以阿伏伽德罗常数，得到每个样本添加的拷贝数。
    4. 使用以下公式计算每个RT-qPCR反应中荧光素酶拷贝的理论产量：
      用于cDNA合成的RNA定量公式，基因表达分析中使用的方程。
  2. 利用荧光素酶质粒生成RT-qPCR的标准曲线，计算每个RT-qPCR反应中荧光素酶拷贝的实验产量。
  3. 使用以下公式计算荧光素酶效率（%）：
    荧光素酶效率公式，用于计算实验产量百分比的研究方程。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过在琼脂糖凝胶上电泳消化产物，验证了使用限制性内切酶对荧光素酶质粒进行线性化的成功（图1）。通过DNA分子量标记物以及与未切割质粒的比较，确认了线性化产物的大小。

我们改进了Lane et al.9报道的平行板流动腔装置，用于需要多种条件/处理或多种剪切应力条件的实验。我们使用一个专用环境——BEACH，可容纳多个完全组装的流动回路，且每个回路的流速均受到监控（图 2）。流速在平行板组件的上游附近进行监测（图 3）。通过BEACH的玻璃门可直接监控流动回路及流速，而不会引起BEACH内部温度、湿度或气体含量的波动。

制造工艺可能导致通道高度...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

剪切应力是一种生理条件，部分通过影响基因的稳态表达来调节内皮细胞功能2,5。在不同剪切应力条件下研究基因调控的模型将有助于更深入地理解内皮细胞功能。该实用工作流程包含一个使用平行板流动腔的流动回路，该装置改编自 Lane et al.9，可模拟层流、非脉动性流动。整体装置设计旨在支持需要多个流动腔的实验，并在此类实验条件下最大限度地减少实验变异性。

流路组件是该工作流程的主要组成部分，改编自 Lane 等9对这一组装和方案进行了多种调整，以适应不同实验系统之间的差异。其中一种改进是大型加热装置BEACH，该装置可在相同环境下同时运行并监测多个流体回路。该系统已成功用于对内皮细胞施加不同持续时间（从1小时至7天）和多种水平的剪切应力例如，1.0、1.5 和 2.0 Pa）。该系统还用于基因敲低研究，以评估在剪切应力条件下...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）MOP 142307 项目对 P.A.M. 的资助。H.S.J.M. 获得了加拿大卫生研究院再生医学培训项目博士后奖学金。H.S.J.M.、A.N.S.、K.H.K. 和 M.K.D. 获得了伊丽莎白二世科学技术研究生奖学金。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTAgibco25300-062
10 mL 注射器BD302995
10 mm2 培养皿Sarstedt83.3902
30 mL 注射器BD302832
四通旋塞阀DiscofixD500
铝箔
海滩达尔文·钱伯斯公司MN: HO85，SN: 4947549
细胞刮刀
一氧化碳2 流量计BioSphenix, Ltd.MN: P120, SN: 0342
一氧化碳2 传感器BioSphenix, Ltd.MN: C700, SN: 52852
蒸馏水gibco15230-170
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）-/-gibco14190-144
内皮细胞生长培养基2Promo CellC-22011
内皮细胞生长培养基2补充剂混合液Promo CellC-39216
纤连蛋白（纯品）Sigma-Aldrich11051407001
滤器（0.20 μm）Sarstedt83.1826.001
流阻尼器与盖帽多伦多大学玻璃吹制车间
流量计：400系列控制台Transonic Scisense Inc.T402
流量计：400系列管路Transonic Scisense Inc.TS410
流体储液罐与盖帽多伦多大学玻璃吹制车间
流量传感器Transonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F 烘箱Fisher ScientificFI-737F
J 布J 布
显微镜载玻片（25 × 75 × 1 mm）Fisherfinest12-544-4
纸制灭菌袋Cardinal Health92713
泵（Masterflex L/S Economy Drive）Cole-Parmer7554-90
泵头（Masterflex L/S Easy Load）Cole-Parmer7518-00
矩形4孔培养皿Thermo Scientific267061
镊子
名称公司目录编号评论
管路
Masterflex C-Flex L/S 25 软管Cole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 软管Cole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 软管Cole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 硬质管Cole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 硬管Cole-Parmer06508-14
名称公司目录编号评论
鲁尔
3/16" 雄性鲁尔接头Cole-Parmer45518-08对于 #25 规格导管
1/8" 雄性鲁尔接头Cole-Parmer30800-24对于 #16 管路
1/8" 女性鲁尔接头Cole-Parmer30800-08对于 #16 管路
1/16" 雄性鲁尔接头Cole-Parmer45518-00对于 #14 管路
1/16" 女性鲁尔接头Cole-Parmer45508-00对于 #14 管路
名称公司目录编号评论
基因敲低试剂
Oligofectamine 试剂Invitrogen12252-011
Opti-MEM I 低血清培养基gibco31985-070
名称公司目录编号评论
体外 转录
Generuler 1kb+ DNA Ladder赛默飞世尔科技SM1331
MEGAclear试剂盒AmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 转录试剂盒AmbionAM1340
pSP-luc+PromegaE4471
超螺旋DNA梯度标记物New England BioLabs Inc.N0472S
UltraPure 琼脂糖Invitrogen16500-500
UltraPure 溴化乙锭Invitrogen15585011
XhoI 限制性内切酶New England BioLabs Inc.R0146S
名称公司目录编号评论
RNA提取
β-巯基乙醇SigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104

参考文献

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645(2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984(2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

RNA RNA PCR
使用多个平行板流动腔对暴露于剪切应力下的内皮细胞进行基因表达分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。