本文介绍了一种在流体剪切应力条件下培养内皮细胞并进行基因表达分析的工作流程。该流程包括一种物理装置，可在受控环境中同时容纳和监测多个流动腔室，并采用外源性参照RNA进行定量PCR分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
我们描述了一种利用多个监测式平行板流动腔分析经稳态层流作用的内皮细胞基因表达的工作流程。内皮细胞构成血管的内层细胞衬里，长期暴露于血液流动所产生的摩擦力，即剪切应力。在生理条件下，内皮细胞在多种剪切应力环境中发挥功能。因此，在体外实验中施加剪切应力条件对于研究内皮细胞的生物学行为至关重要。 体外 模型可更深入地揭示内皮细胞的反应 体内Lane先前发表的平行板流动腔 等9 适用于研究稳态（非脉动）层流存在与缺失条件下内皮细胞基因表达的调控。本文所述层流实验装置的关键改进包括：设有专门的大空间环境以容纳多个并行的流体回路，实时监测流速，以及在定量实时PCR数据分析中引入外源性参照RNA进行归一化处理。为在施加剪切应力的同时评估多种处理/条件，我们在同一温控恒湿培养箱内同步运行多个流体回路和泵。每个流体回路的流速均被连续实时测量，以确保整个实验过程中剪切应力条件的一致性。由于此类实验涉及多个实验条件，我们还使用一种外源性参照RNA，在RNA提取时加入，用于校正RNA提取效率及第一链cDNA合成效率的差异。这些措施可显著降低样本间的变异。该策略已整合至我们基于平行板流动腔开展剪切应力实验的基因表达分析流程中；但其中部分策略（如外源性参照RNA加标）亦可简便、经济地应用于其他研究场景。
引言
血管内皮细胞构成高等物种封闭心血管系统中血管的内层细胞衬里。它们形成血液与组织之间的界面，并具有管腔面和管腔外表面。内皮组织是一个多样化、活跃且具有适应性的系统，可调节血流、营养物质运输、免疫反应以及新生血管的形成1。在体内，内皮细胞通常存在于受到循环摩擦力——即剪切应力——作用的环境中2。剪切应力是调控内皮细胞基因表达的重要因素3，内皮细胞会努力将剪切应力维持在一定范围内2,4。在缺乏剪切应力的情况下，内皮细胞会表现出促血管生成的模式5，从而改善组织灌注。局部区域的紊乱血流和异常剪切应力与炎症相关基因的表达6以及动脉粥样硬化的发生发展密切相关7,8。因此，包含剪切应力的模型对于理解内皮细胞基因调控机制至关重要。
我们描述了一种在剪切应力条件下研究血管内皮细胞基因调控的方法。该系统采用非脉动流动，模拟动脉内皮细胞所处环境中的流体剪切应力水平和氧浓度。本方案包括利用RNA干扰（RNAi）进行基因敲低的方法、使用....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 外源性参照RNA的制备
注意：选择一种在目标物种或模型中不存在的外源性参照 RNA。对于哺乳动物系统，可使用萤火虫荧光素酶 RNA。
- 外源性参考RNA质粒的线性化
- 至少在预计进行RNA提取前48小时制备外源性参照RNA。获取或构建所选外源性参照RNA的cDNA克隆，例如萤火虫荧光素酶cDNA克隆，并将其插入适合的质粒载体中 体外 转录（参见 材料清单).
- 进行限制性内切酶（RE）消化 1 µg 全长质粒（萤火虫荧光素酶质粒为 pSP-luc+，含 4100 bp）使用单一切点限制性内切酶（RE）进行消化XhoI在1.5 mL离心管中进行。选择一种在异源参考RNA序列3’端仅切割一次（即质粒中单一切点）并产生5’突出端或平末端的限制性内切酶（RE）。对于常规制备，需平行进行七组质粒线性化反应（步骤1.1.4–1.1.7），以获得足够浓度和数量的RNA，用于完成一组实验或一个项目。
- 使用分光光度法或荧光分光光度法测定质粒浓度。
- 在每支试管中配制限制性内切酶（RE）混合液：加入 4 µL 的 XhoI (20,000 单位/mL) 8 µL x 微升 RE 缓冲液 µL 质粒的1 µg），以及充足的 H2O 以达到....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
通过在琼脂糖凝胶上电泳消化产物，验证了使用限制性内切酶对荧光素酶质粒进行线性化的成功（图1）。通过DNA分子量标记物以及与未切割质粒的比较，确认了线性化产物的大小。
我们改进了Lane et al.9报道的平行板流动腔装置，用于需要多种条件/处理或多种剪切应力条件的实验。我们使用一个专用环境——BEACH，可容纳多个完全组装的流动回路，且每个回路的流速均受到监控（图 2）。流速在平行板组件的上游附近进行监测（图 3）。通过BEACH的玻璃门可直接监控流动回路及流速，而不会引起BEACH内部温度、湿度或气体含量的波动。
制造工艺可能导致通道高度.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
剪切应力是一种生理条件，部分通过影响基因的稳态表达来调节内皮细胞功能2,5。在不同剪切应力条件下研究基因调控的模型将有助于更深入地理解内皮细胞功能。该实用工作流程包含一个使用平行板流动腔的流动回路，该装置改编自 Lane et al.9，可模拟层流、非脉动性流动。整体装置设计旨在支持需要多个流动腔的实验，并在此类实验条件下最大限度地减少实验变异性。
流路组件是该工作流程的主要组成部分，改编自 Lane 等9对这一组装和方案进行了多种调整，以适应不同实验系统之间的差异。其中一种改进是大型加热装置BEACH，该装置可在相同环境下同时运行并监测多个流体回路。该系统已成功用于对内皮细胞施加不同持续时间（从1小时至7天）和多种水平的剪切应力例如，1.0、1.5 和 2.0 Pa）。该系统还用于基因敲低研究，以评估在剪切应力条件下.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）MOP 142307 项目对 P.A.M. 的资助。H.S.J.M. 获得了加拿大卫生研究院再生医学培训项目博士后奖学金。H.S.J.M.、A.N.S.、K.H.K. 和 M.K.D. 获得了伊丽莎白二世科学技术研究生奖学金。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 302995 | |
| 10 mm2 培养皿 | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL 注射器 | BD | 302832 | |
| 四通旋塞阀 | Discofix | D500 | |
| 铝箔 | |||
| 海滩 | 达尔文·钱伯斯公司 | MN: HO85，SN: 4947549 | |
| 细胞刮刀 | |||
| 一氧化碳2 流量计 | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| 一氧化碳2 传感器 | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| 蒸馏水 | gibco | 15230-170 | |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）-/- | gibco | 14190-144 | |
| 内皮细胞生长培养基2 | Promo Cell | C-22011 | |
| 内皮细胞生长培养基2补充剂混合液 | Promo Cell | C-39216 | |
| 纤连蛋白（纯品） | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| 滤器（0.20 μm） | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| 流阻尼器与盖帽 | 多伦多大学玻璃吹制车间 | ||
| 流量计：400系列控制台 | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| 流量计：400系列管路 | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| 流体储液罐与盖帽 | 多伦多大学玻璃吹制车间 | ||
| 流量传感器 | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F 烘箱 | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J 布 | J 布 | ||
| 显微镜载玻片（25 × 75 × 1 mm） | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| 纸制灭菌袋 | Cardinal Health | 92713 | |
| 泵（Masterflex L/S Economy Drive） | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| 泵头（Masterflex L/S Easy Load） | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 矩形4孔培养皿 | Thermo Scientific | 267061 | |
| 镊子 | |||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 管路 | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 软管 | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 软管 | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 软管 | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 硬质管 | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 硬管 | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 鲁尔 | |||
| 3/16" 雄性鲁尔接头 | Cole-Parmer | 45518-08 | 对于 #25 规格导管 |
| 1/8" 雄性鲁尔接头 | Cole-Parmer | 30800-24 | 对于 #16 管路 |
| 1/8" 女性鲁尔接头 | Cole-Parmer | 30800-08 | 对于 #16 管路 |
| 1/16" 雄性鲁尔接头 | Cole-Parmer | 45518-00 | 对于 #14 管路 |
| 1/16" 女性鲁尔接头 | Cole-Parmer | 45508-00 | 对于 #14 管路 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 基因敲低试剂 | |||
| Oligofectamine 试剂 | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | gibco | 31985-070 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 体外 转录 | |||
| Generuler 1kb+ DNA Ladder | 赛默飞世尔科技 | SM1331 | |
| MEGAclear试剂盒 | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 转录试剂盒 | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| 超螺旋DNA梯度标记物 | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure 琼脂糖 | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure 溴化乙锭 | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI 限制性内切酶 | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| RNA提取 | |||
| β-巯基乙醇 | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
参考文献
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Cl....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
