Method Article

多平行板流室对剪切应力暴露的内皮细胞基因表达分析

DOI:

10.3791/58478

⸱

October 21st, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

In This Article

Summary

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本文介绍了流体剪切应力作用下内皮细胞培养和基因表达分析的工作流程。包括一个物理安排, 可同时在受控环境中同时外壳和监测多个流室, 并使用外源参考 RNA 进行定量 PCR。

Abstract

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我们描述了一个工作流程, 用于分析受稳定层流流的内皮细胞的基因表达, 使用多个监控的平行板流室。内皮细胞形成血管内细胞衬里, 长期暴露于血流的摩擦力, 称为剪切应力。在生理条件下, 内皮细胞在不同的剪切应力条件下发挥作用。因此, 在体外模型中应用剪切应力条件可以更深入地了解体内的内皮反应。平行板流室以前由车道等出版。9是适应研究内皮基因调控在存在和缺乏稳定 (非脉动) 层流。此处介绍的层流流设置的关键调整包括一个大的、专用的环境来容纳并发流电路、实时监控流速和包含外源参考 RNA 以实现标准化定量的实时 PCR 数据。为了评估多重处理/条件与应用的剪切应力, 多流电路和泵在同一加热和加湿孵化器中同时使用。在整个实验过程中, 实时测量每个流量回路的流速, 以实现剪切应力条件的标准化。由于这些实验有多个条件, 我们还使用在 rna 提取时被刺入的外源参考 rna, 用于 rna 提取和第一链 cDNA 合成效率的正常化。这些步骤可将样本之间的变异性降至最低。该策略在我们的管道中使用平行板流室进行了剪切应力实验的基因表达分析, 但该策略的一些部分, 如外源参考 RNA 尖峰, 可以很容易且经济有效地用于其他应用程序。

Introduction

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血管内皮细胞形成的血管内细胞衬里在封闭心血管系统的较高物种。它们形成血液和组织之间的接口, 并具有管腔和 abluminal 表面的特征。内皮是一个多样化的, 活跃的和适应的系统, 调节血液流动, 养分的贩运, 免疫力和新血管的生长1。在体内, 内皮细胞通常存在于暴露于循环摩擦力的环境中, 剪切应力2。剪切应力是内皮细胞基因表达3的重要调节因子, 内皮细胞试图在给定范围内保持剪切应力2,4。内皮细胞在缺乏剪切应力5的情况下显示血管生成模式, 可改善组织灌注。扰动流和改变的剪切应力的区域模式与炎症基因6的表达和动脉粥样硬化7,8的发展有关。因此, 包括剪切应力的模型是了解内皮基因调控的主要组成部分。

本文介绍了一种在剪切应力作用下研究血管内皮细胞基因调控的方法。该系统使用非脉动流和模拟流体剪切应力水平和氧浓度, 模型条件的动脉内皮细胞。本协议包括使用 RNA 干扰 (RNAi) 进行基因敲除的方法的详细信息、使....

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Protocol

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1. 外源参考 RNA 的制备

注: 选择不存在于感兴趣的物种或模型中的外源参考 RNA。对于哺乳动物系统, 可以使用萤火虫荧光素酶 RNA。

  1. 外源参考 RNA 质粒的线性化
    1. 在预期 rna 提取前至少48小时准备外源参考 rna。获取或制造所选择的外源参考 RNA 的 cdna 克隆, 如萤火虫荧光素酶 cdna 克隆, 适合于体外转录的质粒载体 (见材料表)。
    2. 执行限制性酶 (RE) 消化1µg 的全长质粒 (萤火虫荧光素酶质粒是 pSP-卢克 + 这有 4100 bp) 使用单刀 RE (XhoI) 在1.5 毫升微量离心管。在外源参考 RNA 序列的 3 ' 末端, 选择一个在 5 ' 悬伸或钝端上的单刀 (切割质粒仅为 1x) 的 RE。对于一个典型的制备, 执行七质粒线性化反应 (步骤 1.1.4-1.1.7) 并行生成足够的 RNA 浓度和数量, 以完成一组实验或一个项目。
      1. 使用分光光度法或 spectrofluorometry 测量质粒浓度。
      2. 在每管中准备 RE 混合物: 添加4µL 的XhoI (2万个单位/毫升), 8 µL 的 re 缓冲液, x µL 的质粒 (1 µg), 足够的 H2O 达到80µL 的总....

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Results

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通过在琼脂糖凝胶上运行消化产物, 证实了荧光素酶质粒的成功线性化 (图 1)。使用 DNA 梯子和未切割质粒进行比较, 确定线性化产品的尺寸。

我们已经适应了平行板流室设置从车道等。9用于需要多个条件/处理剪切应力或多重剪应力条件的实验。我们使用一个专用的环境, 海滩, 可以房子多, 完全组装的流量电路, 所有有监控的流量 (图 2)。流量仅在平行板组件的上游进行监测 (图 3)。可通过玻璃门直接监测流量电路和速率, 而不会引起海滩内温度、湿度或气体含量的波动。

制造过程可能.......

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Discussion

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剪切应力是调节内皮功能的生理条件, 部分通过影响稳态基因表达2,5。各种剪切应力条件下的基因调控模型将有助于更深入地了解内皮功能。这一实用的工作流程包括一个使用平行板流腔的流动电路, 它适合车道等。9表示层流, 非脉动流。总体设置旨在促进需要多个流室的实验, 并将此设置中的实验变异性降至最低。

流量电路组件是该工作流程的主要组成部分, 并根据车道等进行调整。9. 本大会和议定书的若干改编是为了反映实验系统的差异。一个大的加热单元, 海滩, 是一个适应, 有利于同时运行和监测在同一环境中的几个流电路。该系统已成功应用于不同时间段的内皮细胞的剪切应力, 从1小时到7天, 并在几个层次的剪切应力 (例如, 1.0, 1.5, 和 2.0 Pa)。该系统还用于基因敲除研究, 以评估流动反应性内皮基因在剪切应力设置中的作用 (<.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了卫生研究院 MOP 142307 的支持 P.A.M. h.s.j. m 是加拿大卫生研究院再生医学研究培训项目的接受者。h.s.j. m、A.N.S.、K.H.K. 和方程都是伊丽莎白二世的科技研究生奖学金获得者。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% 胰蛋白酶-EDTAgibco25300-062
10 mL 注射器BD302995
10 mm2培养皿Sarstedt83.3902
30 mL 注射器BD302832
4 通旋塞阀DiscofixD500
铝箔
BEACHDarwin Chambers CompanyMN：HO85，SN：4947549
Cell Scrapers
CO2 MeterBioSphenix， Ltd.MN：P120，SN：0342
CO2传感器BioSphenix， Ltd.MN：C700，SN：52852
蒸馏水gibco15230-170
杜氏磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） -/-gibco14190-144
内皮细胞生长培养基 2促销细胞C-22011
内皮细胞生长培养基 2 补充剂混合物促销细胞C-39216
纤连蛋白（纯）Sigma-Aldrich11051407001
过滤器 （0.20 um）Sarstedt83.1826.001
流量阻尼器和U of T 玻璃吹制车间
流量计：400 系列控制台Transonic Scisense Inc.T402
流量计：400 系列管Transonic Scisense Inc.TS410
储液器和U of T 玻璃吹制车间
流量传感器Transonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F 烤箱Fisher ScientificFI-737F
J 布
载玻片（25 x 75 x 1 毫米）Fisherfinest12-544-4
纸质消毒袋Cardinal Health92713
泵（Masterflex L/S 经济驱动器）Cole-Parmer7554-90
泵头 （Masterflex L/S Easy Load）Cole-Parmer7518-00
矩形 4 孔培养皿Thermo Scientific267061
镊子
名称公司目录号评论
管
Masterflex C-Flex L/S 25 软管Cole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 软管Cole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 软管Cole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 硬管Cole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 硬管Cole-Parmer06508-14
名称Company目录号评论
Luer
3/16" 外螺纹 LuerCole-Parmer45518-08用于 #25 管
1/8" 外螺纹 LuerCole-Parmer30800-24用于 #16 管道
1/8" 内螺纹Luer Cole-Parmer30800-08用于 #16 管道
1/16" 外螺纹 LuerCole-Parmer45518-00用于 #14 管道
1/16" 内螺纹 LuerCole-Parmer45508-00用于 #14 管道
名称>公司<strong>目录号评论
敲低试剂
Oligofectamine 试剂Invitrogen12252-011
Opti-MEM I 减血清培养基gibco31985-070
名称<strong>公司目录号评论
体外转录
Generuler 1kb + DNA ladderThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 转录试剂盒AmbionAM1340
pSP-luc+PromegaE4471
超螺旋 DNA 分子量标准，New England BioLabs Inc.N0472S
UltraPure 琼脂糖Invitrogen16500-500
UltraPure 溴化乙锭Invitrogen15585011
XhoI限制性内切酶New England BioLabs Inc.货号 R0146S
名称公司目录号评论
RNA 提取
β-巯基乙醇SigmaM3148-100mL
RNeasy 迷你试剂盒Qiagen74104
显微镜

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Cl....

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Endothelial CellsShear StressGene Expression AnalysisParallel plate Flow ChamberLaminar FlowExogenous Reference RNARNA ExtractionQuantitative Real time PCRFlow Rate MonitoringCell Adhesion

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