我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位 软骨细胞
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摘要
摘要
关节软骨的稳态依赖于其固有细胞（软骨细胞）的存活能力。然而，机械性创伤可导致软骨细胞广泛死亡，进而可能引发关节不可逆的破坏并诱发骨关节炎。此外，在骨软骨移植手术中，维持软骨细胞的存活能力对于获得理想的手术效果至关重要。本文介绍一种用于评估在施加可控机械载荷或冲击后，完整小鼠滑膜关节关节表面细胞损伤/死亡空间范围的方法。该方法可用于比较研究，以探讨不同机械加载方案、不同环境条件或基因操作，以及软骨退变不同阶段对原位关节软骨细胞短期和/或长期易损性的影响。本实验方案的目标是评估小鼠滑膜关节关节表面细胞损伤/死亡的空间分布范围。重要的是，该方法可在完全完整的软骨上进行测试，且不破坏其天然的边界条件。此外，该方法支持对活体染色的关节软骨细胞进行实时观察，并可基于单张图像分析由可控静态加载和冲击加载所诱导的细胞损伤。我们的代表性结果表明，在健康的软骨组织样本中，细胞损伤的空间范围对载荷大小和冲击强度具有高度敏感性。本方法可便捷地拓展应用于研究不同机械加载方案、不同环境条件或不同基因操作对软骨细胞机械易损性的影响。 原位 关节软骨细胞
引言
关节软骨（AC）是一种承重组织，覆盖并保护滑膜关节中的骨骼，提供平滑的关节活动。组织稳态依赖于软骨细胞的存活，软骨细胞是唯一存在于AC中的细胞类型。然而，由于创伤（例如，跌倒、交通事故或运动损伤）或创伤后关节不稳导致关节软骨暴露于极端力学负荷下，可引发软骨细胞死亡，进而导致关节不可逆的破坏（骨关节炎）1。此外，在旨在修复受损软骨局部缺损的骨软骨移植手术中，移植物植入相关机械性创伤会降低软骨细胞的存活率，并对手术效果产生不利影响2。
软骨组织块模型常用于研究关节软骨细胞对机械诱导细胞死亡的易感性。这些模型通常采用大型动物的组织块，以研究加载条件、环境条件及其他因素对细胞易损性的影响3,4,5,6,7,8,9,10,<....
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方案
所有动物实验均经罗切斯特大学动物资源委员会批准。
1. 溶液
- 配制含有钙、镁但不含酚红的 Hank's 平衡盐溶液（1X HBSS）。通过加入少量 HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.4。
- 通过添加 NaCl 或去离子水将渗透压调节至 303 mOsm。在解剖、样本制备和力学测试过程中使用该缓冲液。
2. 保留完整关节软骨的远端股骨和近端肱骨解剖
- 根据机构指南，使用 CO2 吸入式安乐死装置对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。整个操作过程须遵循无菌技术。
注：可使用任何品系和性别的 8 至 81 周龄小鼠。 - 解剖时使用以下手术器械：显微剪刀（用于制作切口）、常规解剖剪刀（用于切割骨骼）、带 #11 刀片的手术刀（用于切割软组织）、珠宝匠镊子（用于去除软组织）和常规镊子（用于剥离软组织和皮肤）。
- 对于股骨远端的解剖，请遵循以下说明。
- 将小鼠置于仰卧位。
- 在膝关节前部皮肤上做一个小切口（约 5 mm）。
- 将切口围绕膝关节完全延伸，并向后拉开皮肤，以暴露膝关节和腿部肌肉。
- 从股骨近端开始，使用手术刀片（#11）沿远端方向切割。将刀片置于股四....
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结果
对来自8-10周龄BALB/c小鼠的股骨和肱骨软骨施加六种不同的加载方案（静态加载：0.1 N、0.5 N和1 N，持续5分钟；冲击加载：1 mJ、2 mJ和4 mJ），均可重复地诱导出可量化的局部细胞损伤区域（图2）。重要的是，可在ImageJ软件中快速、简便地测量关节表面软骨细胞损伤的空间范围。代表性结果表明，软骨细胞的机械易损性受到载荷大小和冲击强度的影响。特别是，在股骨和肱骨中，较高的载荷大小和较高的冲击强度均显著加剧了细胞损伤的空间范围（图3）。
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讨论
上述方法已成功用于可视化活细胞及受损/死亡细胞 原位 从小鼠关节中分离经规定力学载荷或冲击后的关节软骨细胞。特别是，我们能够分析两种不同滑膜关节——膝关节（股骨远端）和肩关节（肱骨）——完整关节软骨内软骨细胞的力学易损性。代表性结果表明，关节表面软骨细胞损伤的空间范围对载荷大小和冲击强度具有高度敏感性图3）。重要的是，该方法有助于在生理相关条件下研究细胞对机械负荷的响应。也就是说，它能够实现对关节软骨进行测试 完整 生理和超生理载荷下的关节（参见 补充文件 1: 第2节）
鉴于小鼠滑膜关节解剖操作的学习曲线陡峭，以及在保持组织活性方面存在的困难 原位 在基线状态下的软骨细胞，可能需要对某些实验步骤进行调整和故障排除。在解剖过程中，对关节软骨细胞造成损伤的最大风险出现在步骤2.3.5至2.3.10以及2.4.5至2.4.7期间。为尽量减少解剖过程中细胞的损伤或死亡，研究人员应避免手术器械与细胞之间的任何直接接触<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Richard Waugh 博士和 Luis Delgadillo 提供 pH 计和渗透压仪的使用支持。此外，作者感谢 Andrea Lee 为机械测试系统的初步开发做出的贡献。本研究由 NIH P30 AR069655 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Calcein, AM | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C3100MP | 20x50mg ，美国俄勒冈州尤金 |
| 碘化丙啶 | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | P3566 | 1 mg/mL 水溶液，10mL，美国俄勒冈州尤金 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 276855 | 1L DMSO，无水，≥99.9%，美国密苏里州圣路易斯 |
| HBSS（含钙、镁，不含酚红） | Gibco by Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | 1X，500mL，美国纽约州格兰德岛 |
| 羽毛手术刀（#11） | VWR | 102097-822 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德 |
| 蒸汽压渗透压仪（VAPRO） | ELITechGroup | Model 5520 | 法国普托 |
| pH计 | Beckman | Model Phi 32 | 美国加利福尼亚州布雷亚 |
| Eppendorf 恒温混匀仪 | Eppendorf AG | Model 5350 | 德国汉堡 |
| 电动倒置研究显微镜 | Olypmus | Model IX-81 | 美国宾夕法尼亚州中心谷 |
| 木质涂药棒 | Puritan Medical Products Company, LLC | 807 | 6"x100，美国缅因州吉尔福德 |
| 1.5号玻璃盖玻片 | Warner Instruments, LLC | 64-1696 | #1.5，厚度0.17mm，直径40mm，美国康涅狄格州哈姆登 |
参考文献
- Lotz, M. K., Kraus, V. B. New developments in osteoarthritis. Posttraumatic osteoarthritis: pathogenesis and pharmacological treatment options. Arthritis Research & Therapy. 12 (3), 211(2010).
- Pallante, A. L., et al.
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重印与许可
