实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

摘要

我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位 软骨细胞

摘要

关节软骨的稳态依赖于其固有细胞（软骨细胞）的存活能力。然而，机械性创伤可导致软骨细胞广泛死亡，进而可能引发关节不可逆的破坏并诱发骨关节炎。此外，在骨软骨移植手术中，维持软骨细胞的存活能力对于获得理想的手术效果至关重要。本文介绍一种用于评估在施加可控机械载荷或冲击后，完整小鼠滑膜关节关节表面细胞损伤/死亡空间范围的方法。该方法可用于比较研究，以探讨不同机械加载方案、不同环境条件或基因操作，以及软骨退变不同阶段对原位关节软骨细胞短期和/或长期易损性的影响。本实验方案的目标是评估小鼠滑膜关节关节表面细胞损伤/死亡的空间分布范围。重要的是，该方法可在完全完整的软骨上进行测试，且不破坏其天然的边界条件。此外，该方法支持对活体染色的关节软骨细胞进行实时观察，并可基于单张图像分析由可控静态加载和冲击加载所诱导的细胞损伤。我们的代表性结果表明，在健康的软骨组织样本中，细胞损伤的空间范围对载荷大小和冲击强度具有高度敏感性。本方法可便捷地拓展应用于研究不同机械加载方案、不同环境条件或不同基因操作对软骨细胞机械易损性的影响。 原位 关节软骨细胞

引言

关节软骨（AC）是一种承重组织，覆盖并保护滑膜关节中的骨骼，提供平滑的关节活动。组织稳态依赖于软骨细胞的存活，软骨细胞是唯一存在于AC中的细胞类型。然而，由于创伤（例如，跌倒、交通事故或运动损伤）或创伤后关节不稳导致关节软骨暴露于极端力学负荷下，可引发软骨细胞死亡，进而导致关节不可逆的破坏（骨关节炎）¹。此外，在旨在修复受损软骨局部缺损的骨软骨移植手术中，移植物植入相关机械性创伤会降低软骨细胞的存活率，并对手术效果产生不利影响²。

软骨组织块模型常用于研究关节软骨细胞对机械诱导细胞死亡的易感性。这些模型通常采用大型动物的组织块，以研究加载条件、环境条件及其他因素对细胞易损性的影响^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}然而，由于天然关节体积较大，这些模型通常需要从完整关节的关节面移除一块组织，从而破坏了天然的边界条件。此外，它们通常需要施加较大的机械负荷才能诱导细胞损伤。相比之下，小鼠软骨外植体模型在研究机械易损性方面相较于大型动物模型具有多项优势 原位 软骨细胞。特别是由于其尺寸较小，这些模型有助于在不破坏天然组织完整性的前提下，对完整的关节软骨进行测试。此外，小鼠软骨的加载作用发生在较小的接触面积上，因此仅需较小的载荷即可诱导软骨细胞死亡或损伤（<1 N）。最后，小鼠基因组易于操作，可用来检测特定基因如何影响易感性 原位 软骨细胞对机械损伤的反应。

本方法的总体目标是实时量化并可视化空间范围 原位 由于对完整的小鼠软骨-骨外植体施加机械负荷导致的细胞死亡/损伤 体外该方法需要在不损害软骨细胞活性的前提下，对小鼠滑膜关节进行精细解剖，随后使用安装在显微镜上的测试装置对活体染色的组织外植体进行力学检测；该装置类似于我们近期开发的用于量化小鼠软骨力学特性的测试平台。¹⁶在进行力学测试时，解剖所得骨组织的大部分（完整）关节面可在单张荧光显微图像中清晰可见，从而能够在施加载荷后快速分析细胞活力。此前虽已对小鼠软骨离体样本进行过类似的表面细胞活力分析，但未实现载荷的同步施加。¹⁷本方法的潜在应用包括开展比较研究，以探讨关节软骨细胞在不同可控环境和力学条件下的易损性，以及筛选旨在降低软骨细胞对机械负荷敏感性的治疗方法。

方案

所有动物实验均经罗切斯特大学动物资源委员会批准。

1. 溶液

1. 配制含有钙、镁但不含酚红的 Hank's 平衡盐溶液（1X HBSS）。通过加入少量 HCl 或 NaOH 将 pH 值调节至 7.4。
2. 通过添加 NaCl 或去离子水将渗透压调节至 303 mOsm。在解剖、样本制备和力学测试过程中使用该缓冲液。

2. 保留完整关节软骨的远端股骨和近端肱骨解剖

1. 根据机构指南，使用 CO₂ 吸入式安乐死装置对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。整个操作过程须遵循无菌技术。
   注：可使用任何品系和性别的 8 至 81 周龄小鼠。
2. 解剖时使用以下手术器械：显微剪刀（用于制作切口）、常规解剖剪刀（用于切割骨骼）、带 #11 刀片的手术刀（用于切割软组织）、珠宝匠镊子（用于去除软组织）和常规镊子（用于剥离软组织和皮肤）。
3. 对于股骨远端的解剖，请遵循以下说明。
   1. 将小鼠置于仰卧位。
   2. 在膝关节前部皮肤上做一个小切口（约 5 mm）。
   3. 将切口围绕膝关节完全延伸，并向后拉开皮肤，以暴露膝关节和腿部肌肉。
   4. 从股骨近端开始，使用手术刀片（#11）沿远端方向切割。将刀片置于股四头肌-肌腱单元与股骨干前侧之间。将切口延伸至并越过髌骨，最后切断髌腱中部，从而移除股四头肌-肌腱单元。
   5. 从股骨近端开始，使用手术刀片（#11）沿远端方向切割。将刀片置于腘绳肌-肌腱单元与股骨干后侧之间。当切口接近膝关节时，开始切割软组织，避免刀片接触股骨远端髁的关节面。将切口继续延伸至膝关节远端。
   6. 向后拉开股四头肌和腘绳肌，暴露股骨。切除股骨外侧和内侧的多余肌肉。
   7. 在胫骨近端后侧切断小腿肌肉，并翻转腿部以观察股骨后侧。
   8. 通过去除膝关节周围的多余组织，暴露股骨远端髁和胫骨近端后表面。
   9. 使用手术刀切断前交叉韧带和后交叉韧带，切割方向应远离股骨髁。将胫骨从股骨上拉开，并切断所有韧带，使下肢与股骨分离。
   10. 使用常规解剖剪刀，从外侧在股骨近端（胫股关节上方 8 mm 处）切断股骨。切断骨骼后，擦去骨外表面可见的骨髓，以避免骨髓细胞可能造成的污染。
       注：从外侧切割可降低裂纹沿骨骼扩展的风险。
   11. 使用珠宝匠镊子去除股骨周围的软组织（即 韧带和多余肌肉），暴露股骨远端两个髁上的软骨。避免镊子与软骨接触。
4. 对于肱骨的解剖，请遵循以下说明。
   1. 将小鼠置于仰卧位。
   2. 使用显微剪刀在肘部后侧皮肤上做一个切口（约 5 mm），将切口围绕肘部延伸，并向后拉开皮肤，以暴露上臂和肩部肌肉。
   3. 从肱骨近端开始，使用手术刀片（#11）沿远端方向切割。将刀片置于肱三头肌-肌腱单元与肱骨后侧之间。将切口延伸至肱骨远端，并切断肱三头肌腱完成切割。
   4. 然后将肱三头肌向肱骨近端方向拉开，直至暴露肱骨头。
   5. 使用手术刀片（#11）在不接触关节面的前提下，切断肱骨头周围的结缔组织，并将肢体（上臂和肩部）从身体上分离。定期使用 HBSS 液湿润肱骨头的关节面。
   6. 首先用镊子折断上臂后侧尺骨近端，然后切断肱骨远端周围的结缔组织，从而将肱骨与上臂分离。清除肱骨上任何多余组织。
   7. 使用常规解剖剪刀切除肱骨后侧的三角肌粗隆。
5. 将解剖完成的标本放入含有 HBSS 缓冲液的 1.5 mL 微量离心管中。

3. 活细胞（Calcein AM）/死细胞（Propidium Iodide）染色方案

1. 使用钙黄绿素 AM 进行染色，步骤如下。
   1. 通过将 12.5 µL 二甲基亚砜（DMSO）加入含有 50 µg 钙黄绿素 AM 的小瓶中，配制钙黄绿素 AM 储存液，得到浓度为 4 mg/mL（4.02 mM）的储存液。
   2. 将钙黄绿素储存液用 HBSS 稀释 1:400，使钙黄绿素 AM 的终浓度为 10 µg/mL（10.05 µM）（例如，将 1.25 µL 储存液加入 500 µL HBSS 中）。
   3. 将稀释后的染色液在 2,000 × g 条件下离心 5 秒，以确保可能附着在管壁上的染料充分混入缓冲液中。不要去除上清液。涡旋振荡溶液以确保充分混匀。
   4. 将解剖好的样本放入含有 500 µL 稀释染色液的 1.5 mL 微量离心管中。在 37 °C 条件下，于恒温混匀仪中以 800 rpm 振荡孵育 30 分钟。确保试管用铝箔包裹以避光。
   5. 将样本转移至不含钙黄绿素 AM 的 HBSS 缓冲液中。此时样本已准备好进行力学测试。
2. 配制碘化丙啶（PI）染色液，步骤如下。
   1. 将购买的 PI 储存液（1 mg/mL，1.5 mM）用 HBSS 稀释 1:25，配制成终浓度为 40 µg/mL（60 µM）的 PI 染色液（例如，将 40 µL 储存液加入 1000 µL HBSS 中）。
   2. 将 PI 染色液用铝箔包裹以避光保存。在力学测试后立即使用该染色液检测受损细胞（见第 4 节）。
      注意：也可在加载前进行 PI 染色，以更严格地评估解剖样本的质量。

4. 机械测试方案

1. 将样本（股骨或肱骨）放置于定制的显微镜载物台机械测试装置的玻璃载片上，使股骨髁后部或肱骨头的关节面接触玻璃表面图1).
   注意：将一根长10 mm、直径为2 mm的木制涂药棒固定在远端侧 肱骨 使用氰基丙烯酸盐胶水将样本固定在平面上，以稳定其在装置上的位置。有关机械测试平台的详细描述，请参见 补充文件 1第1节
2. 用HBSS水合样本，并将带有样本的装置置于荧光显微镜上。
3. 在荧光显微镜下使用4倍干镜（NA = 0.13）对经钙黄绿素AM染色的关节软骨细胞（激发/发射波长 = 495/515 nm）在施加负荷前（基线状态）进行成像。调整图像采集参数以优化图像质量。
4. 在样本上方施加机械载荷，使关节软骨受压紧贴盖玻片。
   1. 对于 静态加载，施加规定的静态载荷（例如，在试样（股骨或肱骨）顶部施加0.5 N的载荷。保持载荷5分钟，然后卸载。
   2. 对于 影响，施加规定的冲击能量（例如，1 mJ）通过下落已知重量的圆柱形冲击器向样本施加冲击力例如，0.1 N）从规定高度（例如，1 cm）。在撞击后5秒释放负荷。
      注意：可使用以下公式将撞击器的质量（mg）和规定高度（h）转换为撞击能量（E）：E = mgh。
5. 将样本在室温下于PI染色液中孵育5分钟。
6. 在荧光显微镜下观察经钙黄绿素AM和碘化丙啶（PI）染色的关节软骨细胞（激发/发射波长 = 535/617 nm）图2).

5. 数据分析

1. 量化因施加的机械负荷方案导致的损伤/死亡细胞区域。
   1. 在 ImageJ¹⁸ 中打开施加机械负荷前后获取的关节表面显微图像。
   2. 将图像合并为一个图像栈。
   3. 根据图像分辨率设置图像的比例尺。
   4. 使用 多边形 工具标定细胞变为钙黄绿素阴性（绿色荧光丢失）且碘化丙啶阳性（红色荧光获得）的区域。这些细胞被视为受损或死亡细胞。
   5. 使用 测量 工具确定损伤/死亡细胞的面积。

结果

对来自8-10周龄BALB/c小鼠的股骨和肱骨软骨施加六种不同的加载方案（静态加载：0.1 N、0.5 N和1 N，持续5分钟；冲击加载：1 mJ、2 mJ和4 mJ），均可重复地诱导出可量化的局部细胞损伤区域（图2）。重要的是，可在ImageJ软件中快速、简便地测量关节表面软骨细胞损伤的空间范围。代表性结果表明，软骨细胞的机械易损性受到载荷大小和冲击强度的影响。特别是，在股骨和肱骨中，较高的载荷大小和较高的冲击强度均显著加剧了细胞损伤的空间范围（图3）。

讨论

上述方法已成功用于可视化活细胞及受损/死亡细胞 原位 从小鼠关节中分离经规定力学载荷或冲击后的关节软骨细胞。特别是，我们能够分析两种不同滑膜关节——膝关节（股骨远端）和肩关节（肱骨）——完整关节软骨内软骨细胞的力学易损性。代表性结果表明，关节表面软骨细胞损伤的空间范围对载荷大小和冲击强度具有高度敏感性图3）。重要的是，该方法有助于在生理相关条件下研究细胞对机械负荷的响应。也就是说，它能够实现对关节软骨进行测试 完整 生理和超生理载荷下的关节（参见 补充文件 1: 第2节）

鉴于小鼠滑膜关节解剖操作的学习曲线陡峭，以及在保持组织活性方面存在的困难 原位 在基线状态下的软骨细胞，可能需要对某些实验步骤进行调整和故障排除。在解剖过程中，对关节软骨细胞造成损伤的最大风险出现在步骤2.3.5至2.3.10以及2.4.5至2.4.7期间。为尽量减少解剖过程中细胞的损伤或死亡，研究人员应避免手术器械与细胞之间的任何直接接触<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Calcein, AM	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	C3100MP	20x50mg ，美国俄勒冈州尤金
碘化丙啶	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	P3566	1 mg/mL 水溶液，10mL，美国俄勒冈州尤金
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	276855	1L DMSO，无水，≥99.9%，美国密苏里州圣路易斯
HBSS（含钙、镁，不含酚红）	Gibco by Thermo Fisher Scientific	14025-092	1X，500mL，美国纽约州格兰德岛
羽毛手术刀（#11）	VWR	102097-822	美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德
蒸汽压渗透压仪（VAPRO）	ELITechGroup	Model 5520	法国普托
pH计	Beckman	Model Phi 32	美国加利福尼亚州布雷亚
Eppendorf 恒温混匀仪	Eppendorf AG	Model 5350	德国汉堡
电动倒置研究显微镜	Olypmus	Model IX-81	美国宾夕法尼亚州中心谷
木质涂药棒	Puritan Medical Products Company, LLC	807	6"x100，美国缅因州吉尔福德
1.5号玻璃盖玻片	Warner Instruments, LLC	64-1696	#1.5，厚度0.17mm，直径40mm，美国康涅狄格州哈姆登