本实验方案的目的是以高通量方式测量荧光标记食物通过斑马鱼幼体肠道的转运时间。
本文内容
摘要
摘要
斑马鱼被用作药物安全性测试的替代模型生物。斑马鱼的胃肠道在遗传、神经和药理学特性方面与哺乳动物具有相似性。在临床药物候选物测试过程中，胃肠道不耐受现象较为常见，可能对人类健康构成严重威胁。在临床前哺乳动物模型中进行胃肠道毒性测试往往耗时较长、需要大量测试化合物和人力，成本较高。本文介绍的高通量方法可用于预测药物的胃肠道安全性问题。与哺乳动物模型相比，该方法能够更快速地评估测试化合物对胃肠道转运的影响，同时所需化合物用量更少。在本方法中，将斑马鱼幼体（受精后7天）喂食含有荧光标记的食物。喂食后，每条幼鱼被置于96孔圆底培养板的单个孔中，并给予测试化合物（溶于水中）或溶剂对照。随着肠道转运的进行，粪便物质逐渐沉积在孔底，通过使用酶标仪从孔底部随时间多次测量荧光强度，可动态监测该过程的发生速率。将同一处理组中幼鱼的荧光信号取平均值，并结合标准误，按每个时间点绘制成曲线，从而反映食物在胃肠道中的平均转运过程。通过比较各处理组曲线下面积与溶剂对照组的差异，可识别出对肠道转运时间的影响。该方法能够检测已知具有临床胃肠道效应的药物所引起的斑马鱼胃肠道转运时间变化；每天可同时检测数十种处理条件对胃肠道功能的影响。因此，可快速筛选出更安全的候选化合物进入哺乳动物实验阶段，从而加速药物发现进程，并推动“3R”原则（减少、优化、替代）的发展。
引言
斑马鱼（Danio rerio）被用于模拟脊椎动物生物学，并预测药物的毒性及/或疗效；该领域每年都会出现新的应用。与哺乳动物模型相比，斑马鱼具有繁殖力强、体型小以及在器官发生过程中身体透明等优势。斑马鱼可用于预测候选药物的急性毒性，也可用于评估化合物对器官功能的影响，例如心脏、眼部和胃肠道（GI）功能1,2。斑马鱼的发育和生理在许多方面与哺乳动物相似3，且与人类疾病相关的基因中有80%在斑马鱼中具有同源基因4。
斑马鱼的胃肠道在生理上与哺乳动物的胃肠道相似，但结构更为简单5。斑马鱼没有胃，其前肠膨大部分作为食物储存器官。斑马鱼肠道中的基因表达与哺乳动物有许多相似之处5。与哺乳动物类似，斑马鱼的肠神经系统调控肠道蠕动，其肠道神经支配模式也与其他脊椎动物相似6,7。基于这些相似性，研究人员已利用源自哺乳动物模型的方法，在斑马鱼中研究人类肠道的功能性障碍8。
在药物候选物的临床测试过程中，胃肠道不耐受现象较为常见，并可能对人类健康构成严重威胁。一项针对某大型制药公司2005年至2010年期间研发项目进行的回顾显示，胃肠道安全性问题是导致9%临床研究终止的主要原因9。在临床前哺乳动物模型中进行胃肠道毒性测试，往往在时间、化合物用量和人力方面成本较高。一种可用于预测胃肠道转运情况的高通量筛选方法，能够为化合物毒性测试提供更大的灵活性，并实现3R（替代、减少、优化）原则的积极影响。本文所述方案即介绍了一种可实现此类检测的新方法。该高通量检测方法可在药物研发早期阶段用于候选化合物的优先排序，有助于减少在较大物种中进行的胃肠道安全性测试。
方案
本研究所述所有方法均已获得艾伯维公司机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。艾伯维在经实验动物照护评估与认证协会（AAALAC）认证的设施内，依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》开展工作。在这些研究中未观察到任何动物健康问题。
1. 繁殖成年斑马鱼并收集胚胎
- 使用常规饲养和繁殖方法饲养和繁殖成年斑马鱼。例如，参见 Westerfield10。
- 通过将脱水海盐（见材料表）溶解于去离子水中，配制成浓度为 60 mg/L 的胚胎培养液。
- 从成年斑马鱼繁殖盒中收集受精卵，用胚胎培养液充分冲洗，并将胚胎置于 10 cm 培养皿中，每皿约 50 mL 胚胎培养液（每皿 50 个胚胎），在 28 ± 1 °C、14:10 h 光照:黑暗循环条件下培养。
- 24 小时后移除未存活胚胎，并补充存活胚胎，使每皿保持 50 个胚胎。
2. 使用未染色食物训练幼虫进食
- 第4天th 受精后第4天（4 dpf），向每个培养皿中的幼鱼投喂2 mg粉末状幼鱼饲料（参见 材料表通过将食物撒在水面上进行投喂。
- 让幼虫进食3–4小时，然后将其转移至含有约50 mL新鲜胚胎培养基的洁净（无食物）培养皿中。
- 为尽量减少食物的转移，在最后一次转移至新培养皿前，将每只幼虫在含有约50 mL新鲜胚胎培养基的培养皿中冲洗。
- 在受精后第5天和第6天重复喂食并冲洗幼鱼。
3. 在受精后第6天制备荧光食物，并于第7天投喂幼鱼
- 制备含有荧光标记物的食物（以下简称荧光食物，参照 Field et al.3 的方法）。简言之，在10 cm表面皿中混合300 µL荧光标记物（见材料表）、100 µL去离子水和200 mg粉末状幼虫食物。
- 将所得糊状物在表面皿上铺成薄层，在避光条件下室温干燥>8 h。
- 将干燥后的混合物从表面皿上刮下，研磨成粉末，并在避光条件下室温保存。荧光食物现已可饲喂幼虫。
- 在受精后第7天（7 dpf），以与此前喂养相同的方式将荧光食物饲喂给幼虫，即每皿提供2 mg荧光食物（见步骤2.1–2.2.1）。
注意：确保食物被充分研磨成细粉。将包裹在称量纸中的荧光食物用拇指和食指揉搓，是确保食物充分研磨的有效方法。
4. 制备测试化合物的浓缩给药溶液
- 将每种待测化合物溶解于胚胎培养基中，使其浓度为靶剂量的2倍。若需测试剂量范围，应配制多种相应浓度的高浓度给药溶液，以满足不同剂量的需求。
- 每种高浓度给药溶液需配制足够处理24条幼虫的量。每条幼虫需要100 µL给药溶液（每孔终体积为200 µL），因此每个处理组至少需要2.4 mL给药溶液；2.5 mL为适宜体积。
- 若使用了溶剂（i.e., 二甲基亚砜）进行待测化合物的初始溶解，请配制相应的溶剂对照给药溶液（i.e., 与化合物处理组所含溶剂量相同但不含化合物）。并且，如同每个化合物处理组一样，配制足够处理24条幼虫的溶剂对照溶液。
5. 将幼虫转移至96孔板并施加处理
- 让幼虫在荧光食物上取食2小时后，使用转移移液管将它们转移到清洗皿中，操作方式与此前每天取食后的处理相同。
- 每只幼虫清洗后，将其连同100 µL胚胎培养基一并吸出，并转移至96孔聚苯乙烯圆底多孔板的一个孔中（参见材料表），将全部100 µL胚胎培养基与幼虫一同加入该孔。
- 当所需数量的幼虫均已转移至96孔板后，向每个孔中加入100 µL浓度为2×的给药溶液。
注意：使用12通道多通道移液器可实现对幼虫的快速给药（每次12个孔）。为避免误加处理试剂，请密切记录各孔幼虫所接受的处理，并确保在不同处理之间更换移液器吸头。
6. 测量每个孔的初始和后续荧光
- 加入剂量溶液后，将96孔板放入能够激发并检测荧光标记发射光的酶标仪中。
注意：对于所使用的黄绿色荧光标记（参见材料表），合适的光波长为激发波长505 nm，检测波长515 nm。 - 在不振荡96孔板的情况下，立即连续从底部读取5次荧光值。取每个孔5次读数中的最小值作为该孔的初始荧光值。
注意：每次读取96孔板时均进行5次读数的原因是，幼虫有时会游动至激发光路径中，其肠道内的食物会产生极强的信号，这并不能代表已排出的粪便情况。取5次读数中的最小值有助于避免因未排出的食物造成的人为高估测量值。 - 给药后前2小时内每20分钟读取一次96孔板的荧光值（读取方式与初始读数相同），第3和第4小时每30分钟读取一次，之后在第5、6、7和8小时每小时读取一次。
- 读数过程中需注意不要扰动已沉降的粪便物质（避免振荡96孔板），并在两次读数之间将幼虫在28 ± 1 °C条件下孵育。
- 将幼虫在28 ± 1 °C条件下过夜孵育，并于次日早晨在与前一天给药时间相近的时间点读取96孔板的荧光值。将此测量值作为给药后24小时的荧光值。
7. 分析数据
注意：此处我们计算每个时间点每孔的累积量及各组的平均值。
- 根据每次读数的最小值计算每个孔的累积量时，用每个时间点的值减去初始值。同样对初始值进行此计算（这将使每个孔的初始累积量为零）。
- 如果在24小时时间点时，孔中的累积荧光值低于150相对荧光单位，则应将该孔排除在后续分析之外；这些低值很可能是由于幼虫在摄食期间对荧光食物摄入量过低或未摄入所致，因此这些幼虫不适合用于测定转运时间。
- 针对每个时间点，计算含有共处理幼虫的孔的平均累积量，以及这些平均值的标准误。
- 将平均积累量绘于Y轴 与 X轴上绘制每个处理组的时间，并比较这些曲线下面积（AUC）。
注意：与溶剂对照组相比，显著减缓或加速转运时间的处理组，其药时曲线下面积（AUC）将分别显著减小或增大。
结果
该方法利用基于微孔板的分光光度法评估胃肠道转运，可作为高通量替代方案，取代用于评估相同功能但通量较低的荧光显微镜法（图1）。为获得图1中的数据，对经相同处理的鱼类在给药后0、4、8和24小时共4个时间点，分别采用荧光显微镜法（展示代表性图像）或分光光度法分析胃肠道转运；比较这两类实验的数据发现结果高度相关（数据线性回归r2 = 0.95）。线性回归的斜率为负，原因是显微镜测量的是残留的荧光信号，而分光光度法测量的是已通过的信号。
使用分光光度法检测可检测到具有不同作用机制且在人体中具有明确胃肠道活性的化合物在斑马鱼中的效应（图2）。与溶剂对照组相比，阿托品（4.2 µM）和阿米替林（5 µM）减缓了胃肠道转运，而替加色罗（3.3 µM）和甲氧氯普胺（33 µM）则加快了转运时间。红霉素（14 µM）预期可加快转运时间，但在此方法测定下未观察到显著效应。处理组在剔除无信号或信号极弱的幼鱼数据前的样本量为24。采用Tukey显著性差异检验（用于控制Ⅰ类误差）比较化合物处理组与溶剂对照组在各时间点平均信号曲线下面积（AUC）。仅当p ≤ 0.05时判定为具有显著效应。上述处理所用浓度均为最大耐受剂量，该剂量在前期实验中确定，定义为通过肉眼观察未发现明显不良反应的最高剂量。
分光光度法检测可测量化合物的剂量依赖性效应。图3 提供的数据表明，阿托品以剂量依赖性方式减缓斑马鱼幼虫的胃肠道转运。所测试的最低阿托品剂量（0.042 µM）无显著影响，而两个较高浓度均产生显著影响，其中0.42 µM 的作用弱于 4.2 µM。
可通过测试阳性和阴性对照来评估新检测方法的性能，即分别在目标系统中已知具有活性和无活性的化合物（在本例中，目标系统为哺乳动物胃肠道转运）。对于分光光度法检测，共测试了18个有活性（阳性）对照和6个无活性（阴性）对照。根据这些实验结果，分光光度法检测具有较高的阳性预测值（90.9%），但敏感性较低（55.6%）和阴性预测值较低（38.5%）。这些数值来源于表1中提供的数据。在实际应用中，这意味着如果某种处理影响了斑马鱼的转运时间，则很可能也会影响哺乳动物的转运时间；然而，如果该处理对斑马鱼转运时间无影响，则不能据此预测其对哺乳动物是否会产生影响。
图1：通过显微成像信号的减少和基于微孔板分光光度法信号的相应增加，检测荧光标记食物的转运过程。 （A）阿托品（4.2 µM）对胃肠道转运时间影响的代表性显微图像。 （B）从显微图像中定量得到的平均信号与经相同处理的斑马鱼排泄粪便物质中检测到的信号（分光光度法）高度（负）相关。阿托品处理组的数据以红色表示。本图经Cassar et al.11许可复制。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：通过分析多孔板中荧光信号随时间的积累，可识别出影响胃肠道转运速率的处理方式。 星号（*）表示与溶剂处理组鱼类相比，曲线下面积（AUC）具有显著差异。误差线表示每个时间点处理组幼鱼信号的平均值标准误。该图已获Cassar et al.11许可重用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：阿托品以剂量依赖方式减缓斑马鱼肠道转运时间，通过随时间推移的粪便累积荧光分光光度法检测反映。 星号（*）表示与溶剂处理组鱼相比，AUC 差异具有显著性。误差线表示每时间点处理组幼鱼信号的平均值标准误。本图经 Cassar 等11 许可重用。请点击此处查看此图的放大版本。
表1： 24种化合物在哺乳动物和鱼类中的GI活性。 本表格经Cassar et al.11许可重用。
讨论
本文介绍的利用分光光度法测定斑马鱼幼体胃肠道转运时间的新方法是一种高效的检测手段，可用于预测治疗措施对哺乳动物胃肠道功能的影响。尽管该方法的灵敏度较低，但其阳性预测率较高，适用于作为初筛检测手段，以根据毒性情况减少候选治疗方案的数量12。与荧光显微镜法相比，该方法操作更简便、通量更高，且涉及的动物操作步骤更少。
该方法本身存在一些技术难点。在给予荧光食物喂养后，捕获单个幼虫并将其转移至各单独孔中，起初操作较难。然而，经过练习后，熟练的技术人员可在15分钟内完成一块96孔板的操作。若在某一时间点读数前，不小心晃动了培养板，导致孔底的粪便颗粒重新悬浮，则会观察到荧光累积量似乎减少。通过小心移动培养板，避免震荡，可防止该问题。根据我们的经验，常规操作（包括酶标仪自动进板装置的移动）不会干扰检测结果。配备加热装置的酶标仪（即，测量之间无需将培养板放回培养箱，且将其置于靠近实验台的位置可能有助于降低干扰风险，但根据我们的经验，这并非必需。
早期尝试该方法时，未在检测前的数天内进行喂食。若缺少这些“练习”性喂食，较少数量的幼虫能在处理前的限定时间内摄入足量的荧光食物。在这些尝试中，处理组内的变异程度更大，且由于随时间推移荧光信号积累不足或无信号，导致更多数据无法使用。即使进行了练习性喂食，仍有一些幼虫未能摄入足量的荧光食物；排除这些幼虫的数据可降低组内变异，提高检测处理效应的能力。起始时采用较大的群体规模（即 24 而非 12），可确保有足够数量的幼虫为分析提供有效数据。
荧光显微镜观察显示，经阿托品处理的幼虫在24小时时食物转运已基本完成（未展示），但微孔板在最终时间点的数据反映出阿托品组的最终信号低于对照溶剂组。相反，微孔板荧光信号更高与加快了转运时间的处理相关，尽管接受溶剂处理的幼虫在最终时间点前似乎已排空其胃肠道。基于对摄食荧光食物的幼虫进行的随机分组处理，我们假设各处理组平均摄食的荧光食物量相当。基于此假设以及上述描述的模式，粪便中的荧光强度随其在幼虫胃肠道中停留时间的延长而降低，或转运加快会以某种方式增加粪便的荧光。具体机制尚不明确，也未被深入探究，但该检测方法仍能够用于测量和比较各组之间的转运时间。
该方法可用于检测小分子化合物引起的胃肠道毒性效应。其他可能的应用包括疾病建模（例如，肠易激综合征）、针对此类疾病的新型疗法发现，或促动力化合物的筛选。此外，结合转基因模型，该方法还可用于研究基因在正常胃肠道转运以及胃肠道转运障碍（包括肠神经元缺乏）中的作用。斑马鱼幼体提供了一个接近细胞培养规模的完整生物体平台；但由于斑马鱼体内存在多种组织和大量协同工作的细胞类型，因此可利用该模型提出并解答系统生物学相关的问题。
随着技术的进步及其新应用的出现，斑马鱼毒性试验的实施效率将持续提高。斑马鱼幼体的操作方法和检测技术在通量方面不断改进13,14。本文介绍的新方法便是提升斑马鱼研究影响力的一个改进实例。
披露
本研究的设计、实施以及经费支持由艾伯维（AbbVie）提供。艾伯维参与了数据解读、稿件的审阅和批准。S. Cassar、X. Huang 和 T. Cole 为艾伯维公司员工，无其他利益冲突需要披露。
致谢
Simon Cassar（carpetbones.com）设计并制作了用于演示胃肠道转运实验活体操作过程的动画图示。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 野生型斑马鱼繁殖对 | 多种来源——例如 ZIRC（斑马鱼国际资源中心） | ZL-1 | AB 品系的成年野生型斑马鱼 |
| 1.7 L 繁殖缸——斜坡式设计 | Tecniplast | 1.7L SLOPED | 繁殖缸 |
| Instant Ocean 海盐 | Instant Ocean | SS15-10 | 脱水海盐 |
| First Bites 幼鱼饲料 | Hikari | 20095 | 粉末状幼鱼饲料 |
| 黄绿色（505/515）Fluospheres | Invitrogen | F8827 | 荧光标记物 |
| V 型底 96 孔聚苯乙烯微孔板 | Thermo Fisher Scientific | 249570 | 每孔具有 V 形底部的多孔微孔板 |
| 阿托品 | Sigma Aldrich | A0132 | |
| 阿米替林 | Sigma Aldrich | A8404 | |
| 替加色罗 | Sigma Aldrich | SML1504 | |
| 甲氧氯普胺 | Sigma Aldrich | M0763 | |
| 红霉素 | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Spectramax M2e 微孔板读板仪 | Molecular Devices | Spectramax M2e | 一种可检测荧光激发和发射的多孔板分光光度计 |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | SoftMax Pro | 分光光度计数据采集软件 |
参考文献
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重印与许可
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