方法文章

基于X射线显微计算机断层扫描的玉米维管束微米级表型分析技术

DOI：

10.3791/58501

⸱

2018年10月9日

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1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提供了一种新颖的方法，可提高玉米组织的X射线吸收对比度，适用于常规的微型计算机断层扫描。基于CT图像，我们引入了一套针对不同玉米材料的图像处理工作流程，以有效提取玉米维管束的显微表型特征。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于高通量图像分析技术，准确量化玉米材料的解剖结构十分必要。本文提供了一种适用于常规微型计算机断层扫描（micro-CT）的玉米材料（i.e.，茎、叶和根）的“样品制备方案”。基于玉米茎、叶和根的高分辨率CT图像，我们描述了两种用于维管束表型分析的方案：（1）基于玉米茎和叶的CT图像，我们开发了一套特定的图像分析流程，可自动提取31项和33项维管束表型性状；（2）基于玉米根的CT图像序列，我们建立了一种图像处理方案，用于对后生木质部导管进行三维（3-D）分割，并提取了诸如后生木质部导管体积、表面积等二维（2-D）和三维表型性状。etc. 与传统的玉米材料维管束人工测量方法相比，所提出的方案显著提高了微米尺度表型定量的效率和准确性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

玉米的维管系统贯穿整株植物，从根和茎延伸至叶片，构成了输送水分、矿物质养分以及有机物质的关键运输通道1。维管系统的另一重要功能是为玉米植株提供机械支撑。例如，根和茎中维管束的形态、数量和分布与玉米植株的抗倒伏能力密切相关2,3。目前，关于维管束解剖结构的研究主要依赖显微和超微观察技术，展示茎、叶或根某一部分的解剖结构，再通过人工观察进行测量和计数。毋庸置疑，对大规模显微图像中各种微观结构进行人工测量是一项极为繁琐且低效的工作，由于主观性和不一致性，严重限制了微形态性状的精确性4,5。

玉米没有次生生长，其初生分生组织的细胞内容物主要由水组成。若不进行任何预处理，玉米组织的新鲜样品可直接使用显微CT设备扫描；然而，扫描结果可能较差且粗糙。主要原因总结如下：（1）植物组织的衰减密度较低，导致原子序数对比度低，图像噪声较高；（2）新鲜植物材料在常规扫描环境中容易脱水和收缩，正如Du6所报道。上述问题已成为玉米、小麦、水稻及其他单子叶植物显微表型技术发展与应用的主要限制因素。本文介绍了一种“样品制备方案”，用于对玉米茎、叶和根的样品进行预处理。该方案可避免植物材料在CT扫描过程中发生脱水和变形，从而有利于延长植物样品在无变形状态下的保存时间。此外，基于固态碘的染色步骤也增强了植物材料的对比度，显著提高了显微CT的成像质量。进一步地，我们开发了名为VesselParser的图像处理软件，用于处理玉米茎和叶的CT图像。该软件集成了多种图像处理流程，可对不同植物组织的二维CT图像进行高通量、自动化的表型分析。通过自动化的图像处理方法，可对玉米茎和叶整个横截面中的维管束进行检测、提取和识别。最终，我们获得了玉米茎的31种微观表型性状和玉米叶的33种微观表型性状。对于玉米根的CT图像序列，我们开发了一套图像处理方案，用于获取后生木质部导管的三维表型性状。与传统方法相比，该方案在图像获取和重建效率方面具有明显优势。

这些结果表明，考虑普通X射线显微CT成像特性的图像处理流程为维管束的显微表型分析提供了一种有效方法；这极大地拓展了CT技术在植物科学中的应用，并提升了植物材料在细胞分辨率水平上的自动表型分析能力6,7。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 样品制备方案

  1. 取样时，从新鲜的玉米植株中采集茎、叶和根，并将其分为三类样品组（每组设四个重复）。然后使用手术刀将样品切成小段，具体操作如下：（1）截取长度为1–1.5 cm的茎中部节间段；（2）沿主脉方向，在叶片最宽处截取长度为0.5–3 cm的叶段；（3）截取长度为0.5 cm的冠根段。
  2. 对于FAA固定，将样品片段浸入FAA溶液（90:5:5 v/v/v，70%乙醇:100%甲醛:100%乙酸）中，固定时间至少3 d。
  3. 依次进行六步乙醇梯度脱水 procedure即30%、50%、70%、85%、95% 和 100%）梯度乙醇处理，每级处理时间为 30 分钟。
  4. 将植物材料放入使用3D打印机制造的相应样品篮中，然后迅速将样品篮转移至CO₂2 临界点干燥系统。设置干燥参数如下：
    (1) CO2 高速下：夹具填充率：100%
    (2) 电荷：CO2 电荷延迟 120 秒进入循环。交换速度：5。循环次数：12。
    ​(3) 气体排出：加热，快速；速度：慢，50%
    1. 根据玉米根、茎、叶的形态差异，使用3D打印机设计并打印样品篮例如, 图1).
  5. 将干燥的植物材料（玉米根、茎或叶）放入50 mL离心管中，加入2 g固体碘，利用挥发的碘蒸气对植物材料进行染色，然后将离心管置于避光房间中4–5 h。

2. 微型计算机断层扫描（Micro-CT）扫描方案

  1. 扫描原始CT数据时，将CT扫描参数设置如下：茎和叶为40 kV/250 µA，根为34 kV/210 µA。根据所用植物材料的不同尺寸和体积设置相应的扫描范围，并按以下参数调整成像像素大小：玉米根为2.0 µm，玉米茎为6.77 µm，玉米叶为10.0 µm。
  2. 为重建切片图像，使用图像重建软件将原始CT数据转换为分辨率为2K（2,000 × 2,000像素）的CT切片图像。更多细节请参见NRecon用户手册（http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf）。

3. 玉米茎或叶单张CT图像的图像分析方案

注意：使用自动成像软件对玉米茎和叶的CT切片图像中的维管束进行表型分析（图2）。软件使用步骤如下所述。

  1. 指定器官类型以初始化不同的算法流程。点击 方法参数 按钮，并在第一个下拉框中选择玉米茎或玉米叶。
  2. 导入图像时，点击 数据管理 按钮，设置工作目录，并自动导入该目录下的所有切片图像。将单个或多个切片图像选入图像处理流程。
  3. 确定图像的实际像素尺寸。点击 方法参数 按钮，在像素尺寸的编辑项中输入图像的实际像素大小。
  4. 进行表型计算时，点击 表型计算 按钮，系统将自动提取所有选定切片图像中维管束的表型性状。
  5. 点击 统计分析 按钮，以 TXT 或 CSV 文件格式输出结果。

4. 玉米根部CT图像序列的图像分析方案

注意：利用玉米根系的CT图像序列，通过图像处理软件提取中柱木质部导管的三维结构。主要步骤如下。

  1. 导入玉米根系的重建图像（BMP 文件格式），并确定准确的间距参数（体素大小[即，x，y，z]。使用递归高斯工具对这些图像进行平滑处理，以提高图像质量。
  2. 通过调整阈值参数对后生木质部导管进行三维分割，从而为每个连通的后生木质部导管生成统一的颜色标签。
  3. 使用形态学、位运算和泛洪填充操作，交互式地优化并识别后生木质部导管。
  4. 对血管进行体可视化和表面重建。使用掩膜统计工具在二维和三维层面上对血管的表型特征进行计数和测量。

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结果

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适用于普通显微CT扫描的样品制备方案不仅能够防止植物组织变形，还可增强X射线吸收对比度。经预处理的植物材料通过显微CT系统扫描获得高质量的断层图像，最高分辨率可达2 µm/像素。图4展示了茎、叶和根的显微CT扫描图像，与新鲜植物材料直接扫描的结果相比，图像对比度显著提高。在这些CT断层图像中，维管束、薄壁细胞、木质部导管、表皮及其他组织之间的灰度值差异明显可见。

基于该维管束成像软件，可自动分析并量化整个茎或叶横截面内维管束的结构与分布特征。以玉米茎的图像为例，该软件的表型分析算法包含五个步骤：切片图像分割、维管束分割、维管束空间分布分析、维管束识别与优化，以及维管束表型性状的计算与输出。首先，根据特定或自适应的阈值对图像中的整个表皮区域进行分割，并通过轮廓分析技术提取表皮区域（图3A 和 3B）。接...

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讨论

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随着CT技术在生物医学和材料科学领域的成功应用，该技术已逐步被引入植物学与农业领域，成为推动植物生命科学研究的一种有前景的技术工具。20世纪90年代末，CT技术首次被用于研究植物根系的形态结构及其发育过程。在过去十年中，同步辐射高分辨率CT（HRCT）已成为植物生物学家一种强大且非破坏性的研究工具，并已成功应用于葡萄维管系统组织结构8、拟南芥（Arabidopsis）叶片组织结构9,10以及油菜种子结构11的鉴定。借助同步辐射HRCT技术，木本植物维管束结构与功能的研究取得了显著进展12,13,14。然而，针对玉米、小麦、水稻等作物的HRCT技术研究仍十分有限15。玉米无次生生...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究得到国家自然科学基金（No.31671577）、北京市农林科学院科技创新专项建设项目资助计划（KJCX20180423）、中国研究发展计划（2016YFD0300605-01）、北京市自然科学基金（5174033）、北京市博士后研究基金（2016 ZZ-66）以及北京市农林科学院科研项目资助（KJCX20170404）、（JNKYT201604）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Skyscan 1172 X射线计算机断层扫描系统Bruker Corporation, BelgiumNA用于CT扫描
CO2 临界点干燥系统（Leica CPD300）Leica Corporation, GermanyNA用于样品干燥
乙醇任意品牌NA用于FAA固定
甲醛任意品牌NA用于FAA固定
乙酸任意品牌NA用于FAA固定
手术刀片任意品牌NA用于切割样品片段
3D打印机Makerbot Replicator 2, MakerBot Industries, USANA用于打印玉米根、茎、叶的样品篮
离心管Corning, USANA放置根、茎或叶材料
固体碘任意品牌NA用于样品染色
SkyScan NRecon软件SkyScan NRecon, 版本：1.6.9.4, Bruker Corporation, BelgiumNA用于图像重建
VesselParser软件VesselParser, 版本：3.0, 国家农业信息技术工程技术研究中心（NERCITA），中国北京NA玉米茎或叶单张CT图像的图像分析流程
ScanIPScanIP, 版本：7.0; Simpleware, Exeter, UKNA三维图像处理软件
乳胶手套任意品牌NA
镊子任意品牌NA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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