体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法

摘要

蛋白质合成是 细胞的一项关键生物学过程。在大脑中，该过程对适应性变化至关重要。测量完整大脑中的蛋白质合成速率需要仔细考虑方法学因素。本文介绍了L-[1-¹⁴体内脑区蛋白质合成速率测定的C-亮氨酸定量放射自显影法

摘要

蛋白质合成对于神经元功能的发育和维持至关重要，并参与神经系统中的适应性变化。此外，人们认为神经系统中蛋白质合成的失调可能是某些发育障碍的核心表型。在动物模型中准确测量脑内蛋白质合成速率，对于理解这些疾病具有重要意义。我们所建立的方法旨在用于清醒、行为正常动物的研究。该方法为定量放射自显影法，可同时获得脑内所有区域的合成速率。该方法基于使用示踪氨基酸L-[1-¹⁴C]-亮氨酸以及L-亮氨酸在脑内代谢行为的动力学模型。我们选择L-[1-¹⁴C]-亮氨酸作为示踪剂，是因为其不会产生额外的标记代谢产物。该示踪剂要么被掺入蛋白质中，要么迅速代谢生成¹⁴CO₂，后者在脑内大量未标记的CO₂池中被稀释。该方法及模型还可校正组织蛋白水解产生的未标记亮氨酸对蛋白质合成前体库的贡献。该方法具有足够的空间分辨率，可测定细胞层、神经毡层以及下丘脑和脑神经核团中的蛋白质合成速率。为了获得可靠且可重复的定量数据，严格遵循操作细节至关重要。本文将详细介绍利用定量放射自显影L-[1-¹⁴C]-亮氨酸法在活体条件下测定脑区特异性蛋白质合成速率的具体操作步骤。

引言

蛋白质合成是 神经系统长期适应性变化所必需的重要生物学过程¹抑制蛋白质合成会阻断无脊椎动物和脊椎动物的长期记忆存储²蛋白质合成对于维持某些形式的长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的晚期阶段至关重要³发育过程中的神经元存活⁴以及神经元及其突触连接的常规维持⁵脑蛋白合成速率的测量可能是研究适应性变化以及神经发育障碍和与学习记忆相关疾病的重要工具。

我们已开发出一种方法，可在清醒动物体内定量测定脑蛋白质合成速率，该方法相较于其他用于估计脑组织离体或体外样本中合成速率的技术具有固有优势⁶。最主要的优势在于其适用于清醒动物完整脑组织中的测量。这一点至关重要，因为它能够在突触结构与功能保持完整的情况下进行测定，且无需担忧死后效应的影响。此外，我们所采用的定量放射自显影方法具有高度的空间定位能力。尽管¹⁴C的能量限制使得我们无法在亚细胞或细胞水平上对示踪剂进行精确定位，但我们仍可在细胞层和如下丘脑核团等较小的脑区中测量合成速率，空间分辨率约为25 µm⁷。

使用放射....

方案

注意：所有动物实验程序均经国家精神卫生研究所动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院关于动物护理和使用指南的规定执行。

方案的概述见图1。

1. 通过手术在股静脉和股动脉中植入导管，分别用于示踪剂的给药和定时采集动脉血样。手术应在示踪剂给药前至少22小时完成。手术过程约需1小时。

1. 准备所需材料：无菌外科器械（手术剪、显微剪、镊子、三把外科皮肤拉钩）、异氟烷麻醉设备（异氟烷挥发器、主动式废气清除装置、密闭麻醉室、麻醉面罩）、无菌手术台、毛发剪刀、70%乙醇、聚维酮碘、无菌纱布、外科胶带、商用暖手袋、手术显微镜、无菌0.9%氯化钠溶液（生理盐水）、含肝素100 USP单位/毫升的无菌0.9%氯化钠溶液（肝素化生理盐水）、五段无菌20厘米长6-0可吸收缝线、无菌25厘米长PE-8和PE-10聚乙烯导管各一段，其中一端切成45°斜面^o，无菌1 cc注射器、无菌32号针头、电灼设备、无菌15-20 cm中空不锈钢棒（内径2.5 mm，外径3 mm）、局部麻醉药（布比卡因和利多卡因软膏）、带旋转连接装置的动物饲养笼（30 cm弹簧束缚线，带按钮、旋转接头、旋转支架和支架臂，20 × 13 cm透明圆柱形容器）。
2. 准备动物以进行手术。
3. 确保根据贵机构的要求，采用适当的无菌和无菌技术....

结果

此处展示了一项代表性实验，用于说明预先给予蛋白质合成抑制剂对rCPS的影响。在开始测定rCPS前30分钟，通过皮下注射给予成年雄性C57/BL6野生型小鼠生理盐水溶解的茴香霉素（100 mg/kg）。与给予溶剂对照的动物相比，茴香霉素处理组小鼠的rCPS几乎无法检测到（图4）。这些数据表明，体内放射自显影法使用L-[1-¹⁴C]-亮氨酸测定脑内蛋白质合成速率的方法是可靠的。

我们展示了一幅L-[1-¹⁴C]-亮氨酸放射自显影图，显示脑部四个层面的方法分辨率（图5）。图示为嗅球中的细胞层图 5A 和 B），海马体（图5C），以及小脑（

讨论

我们介绍一种在实验动物体内定量测定脑区蛋白质合成速率（rCPS）的方法。该方法相较于现有方法具有显著优势：1. 测量在清醒、正常活动的动物中进行，因此能够反映大脑功能状态下正在进行的生理过程。2. 通过定量放射自显影技术进行测量，可同时测定脑内所有区域及亚区域的rCPS。3. 该方法的动力学模型考虑了组织蛋白质降解产生的未标记氨基酸重新进入氨基酸池（即“再循环”）的可能性，及其对蛋白质合成前体池的影响⁶。

该方法的主要局限性在于其耗时且要求较高。尽管采用更简单、通量更高的方法颇具吸引力，但必须认识到所获得数据的局限性。

由于在完整的小鼠体内测量rCPS具有复杂性，可能会遇到维持正常生理状态、采集足够的血液样本以及避免可能干扰因素等方面的问题。静脉和动脉导管的外科植入具有挑战性。与任何外科手术一样，尤其是处理 delicate vasculature 时，动物死亡存在固有风险。对我们而言，这种情况较为罕见（约1%）。在随后22小时的恢复期间，偶尔（约4%）会有动物将导管拔出。在测量.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠	杰克逊实验室	003024	Fmr1 基因敲除繁育对
茴香霉素	Tocris 生物科学	1290
微量压积管	德拉蒙德科学公司	1-000-3200-H	毛细管
Critoseal 毛细管密封剂	徕卡显微系统公司	39215003	密封腻子
玻璃小瓶内插管	安捷伦科技公司	5183-2089	用于采集血液样本
Digi-Med 血压分析仪	Micro-Med 公司	BPA-400	血压分析仪
Bayer Breeze 2 血糖监测系统	Bayer Breeze	9570A	血糖仪
气密注射器	哈密尔顿公司	1710	结核菌素玻璃注射器
HeatMax HotHands-2 暖手袋	HeatMax	型号 HH2	加热垫
肝素锁冲洗液	Fresenius Kabi USA, LLC	504505	肝素生理盐水
透明动物容器	Instech	MTANK/W	动物饲养笼
弹簧束缚装置	Instech	PS62	导管管路/啮齿类动物固定装置
旋转接头	Instech	375/25	连接至弹簧束缚装置
旋转臂及支架	Instech	SMCLA	连接旋转接头和动物饲养笼
束缚按钮	Instech	VAB62BS/22	连接至弹簧束缚装置底部
不锈钢管	自制	N/A	用于将导管穿过小鼠体内
Matrx VIP 3000	Matrx	91305430	异氟烷蒸发器
异氟烷	Stoelting 公司	50207	异氟烷/氟烷吸附剂
电动剪毛器	Oster Finisher	型号 59
外科皮肤拉钩	自制（??）	N/A（??）
0.9% 氯化钠生理盐水	APP 制药有限责任公司	918610
镊子	精细科学工具公司	11274-20
手术剪刀	精细科学工具公司	14058-11
显微剪刀	精细科学工具公司	15000-00
UNIFY 丝制外科缝线	AD 外科公司	#S-S618R13	6-0 USP，不可吸收
PE-8 聚乙烯管	SAI 输注技术公司	PE-8-25
注射器	贝克顿-迪金森公司	309659	1cc/mL
PE-10 聚乙烯管	Clay Adams	427400
MCID 分析软件	Imaging Research 公司	版本 7.0	光密度分析
明胶包被载玻片（75×25 mm）	FD Neurotechnologies	PO101
冷冻切片机	徕卡	CM1850
Super RX-N 医用X光胶片	富士	47410-19291
Hypercassette（8×10 英寸）	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-14C]亮氨酸	Moravek	MC404E
微量离心管	Sarstedt 股份有限公司 & Co.	72.692.005	用于血液样本去蛋白处理
玻璃巴斯德移液管	Wheaton	357335
玻璃棉	西格玛-奥德里奇公司	18421
氮气	美国国立卫生研究院供应中心	6830009737285
闪烁液	CytoScint	882453
液体闪烁计数器	Packard Tri-Carb	2250CA
氨基酸分析仪	Pickering 实验室	Pinnacle PCX
HPLC 系统	安捷伦科技公司	1260 Infinity	包含 1260 Bio-Inert 泵
手术显微镜	Wild Heerbrugg	M650
磺基水杨酸	西格玛-奥德里奇公司	MKBS1634V	5-磺基水杨酸二水合物
正亮氨酸	西格玛公司	N8513
1.0 N HCl	西格玛-奥德里奇公司	H9892
[H3]亮氨酸	Moraevk	MC672
Falcon 管	赛默飞世尔科技公司	339652	50 mL 圆锥形离心管
秒表	Heuer Microsplit	型号 1000	1/100 分钟
安乐死溶液	Vet One	H6438
Northern Light 精密照明器	Imaging Research 公司	型号 B95	荧光灯箱
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8	尼康	1442	CDD 相机