需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法

6.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/58503

⸱

2019年6月28日

 ,  ,  ,  , 
1Section on Neuroadaptation and Protein Metabolism, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health

本文内容

摘要

蛋白质合成是 细胞的一项关键生物学过程。在大脑中，该过程对适应性变化至关重要。测量完整大脑中的蛋白质合成速率需要仔细考虑方法学因素。本文介绍了L-[1-14体内脑区蛋白质合成速率测定的C-亮氨酸定量放射自显影法

摘要

蛋白质合成对于神经元功能的发育和维持至关重要，并参与神经系统中的适应性变化。此外，人们认为神经系统中蛋白质合成的失调可能是某些发育障碍的核心表型。在动物模型中准确测量脑内蛋白质合成速率，对于理解这些疾病具有重要意义。我们所建立的方法旨在用于清醒、行为正常动物的研究。该方法为定量放射自显影法，可同时获得脑内所有区域的合成速率。该方法基于使用示踪氨基酸L-[1-14C]-亮氨酸以及L-亮氨酸在脑内代谢行为的动力学模型。我们选择L-[1-14C]-亮氨酸作为示踪剂，是因为其不会产生额外的标记代谢产物。该示踪剂要么被掺入蛋白质中，要么迅速代谢生成14CO2，后者在脑内大量未标记的CO2池中被稀释。该方法及模型还可校正组织蛋白水解产生的未标记亮氨酸对蛋白质合成前体库的贡献。该方法具有足够的空间分辨率，可测定细胞层、神经毡层以及下丘脑和脑神经核团中的蛋白质合成速率。为了获得可靠且可重复的定量数据，严格遵循操作细节至关重要。本文将详细介绍利用定量放射自显影L-[1-14C]-亮氨酸法在活体条件下测定脑区特异性蛋白质合成速率的具体操作步骤。

引言

蛋白质合成是 神经系统长期适应性变化所必需的重要生物学过程1抑制蛋白质合成会阻断无脊椎动物和脊椎动物的长期记忆存储2蛋白质合成对于维持某些形式的长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的晚期阶段至关重要3发育过程中的神经元存活4以及神经元及其突触连接的常规维持5脑蛋白合成速率的测量可能是研究适应性变化以及神经发育障碍和与学习记忆相关疾病的重要工具。

我们已开发出一种方法，可在清醒动物体内定量测定脑蛋白质合成速率，该方法相较于其他用于估计脑组织离体或体外样本中合成速率的技术具有固有优势6。最主要的优势在于其适用于清醒动物完整脑组织中的测量。这一点至关重要，因为它能够在突触结构与功能保持完整的情况下进行测定，且无需担忧死后效应的影响。此外，我们所采用的定量放射自显影方法具有高度的空间定位能力。尽管14C的能量限制使得我们无法在亚细胞或细胞水平上对示踪剂进行精确定位，但我们仍可在细胞层和如下丘脑核团等较小的脑区中测量合成速率，空间分辨率约为25 µm7。

使用放射性示踪剂进行体内测量的一个挑战在于确保所测得的放射性标记存在于目标反应产物中，而非未反应的标记前体或其他非相关的标记代谢产物中。6我们选择了 L-[1-14C]-亮氨酸作为示踪氨基酸，因为它要么被掺入蛋白质，要么迅速被代谢 14CO2, 在大量未标记的CO中被稀释2 由于大脑能量代谢速率高，导致脑组织中产生8此外，任何 14未掺入蛋白质的C主要以游离形式存在[14C]-亮氨酸，在60分钟的实验期间内，几乎完全从组织中清除6蛋白质随后用甲醛固定于组织上，并用清水冲洗以去除任何游离的[14C]-亮氨酸标记，随后进行放射自显影。

另一个重要的考虑因素是，组织蛋白质分解产生的非标记氨基酸会稀释前体氨基酸池的特异性放射活性。我们已证明，在成年大鼠和小鼠中，脑内蛋白质合成所用的前体亮氨酸池约有40%来源于蛋白质降解产生的氨基酸6。在计算脑区蛋白质合成速率（rCPS）时必须计入这一因素，并且在相关关系可能发生改变的研究中必须对此加以验证。该方法的理论基础和假设已在其他文献中详细阐述6。本文则重点讨论该方法应用中的实验操作问题。

该方法已用于测定地松鼠9、绵羊10、恒河猴11、大鼠12,13,14,15,16,17,18,19,20,21、结节性硬化症小鼠模型22、脆性X综合征小鼠模型23,24,25,26、脆性X前突变小鼠27以及苯丙酮尿症小鼠模型28中的rCPS。在本论文中，我们介绍了使用活体放射自显影L-[1-14C]-亮氨酸法测定rCPS的操作步骤。我们展示了清醒对照小鼠脑区中的rCPS。此外，我们还证明了体内给予翻译抑制剂茴香霉素可完全消除脑内的蛋白质合成。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：所有动物实验程序均经国家精神卫生研究所动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院关于动物护理和使用指南的规定执行。

方案的概述见图1。

1. 通过手术在股静脉和股动脉中植入导管，分别用于示踪剂的给药和定时采集动脉血样。手术应在示踪剂给药前至少22小时完成。手术过程约需1小时。

  1. 准备所需材料：无菌外科器械（手术剪、显微剪、镊子、三把外科皮肤拉钩）、异氟烷麻醉设备（异氟烷挥发器、主动式废气清除装置、密闭麻醉室、麻醉面罩）、无菌手术台、毛发剪刀、70%乙醇、聚维酮碘、无菌纱布、外科胶带、商用暖手袋、手术显微镜、无菌0.9%氯化钠溶液（生理盐水）、含肝素100 USP单位/毫升的无菌0.9%氯化钠溶液（肝素化生理盐水）、五段无菌20厘米长6-0可吸收缝线、无菌25厘米长PE-8和PE-10聚乙烯导管各一段，其中一端切成45°斜面o，无菌1 cc注射器、无菌32号针头、电灼设备、无菌15-20 cm中空不锈钢棒（内径2.5 mm，外径3 mm）、局部麻醉药（布比卡因和利多卡因软膏）、带旋转连接装置的动物饲养笼（30 cm弹簧束缚线，带按钮、旋转接头、旋转支架和支架臂，20 × 13 cm透明圆柱形容器）。
  2. 准备动物以进行手术。
  3. 确保根据贵机构的要求，采用适当的无菌和无菌技术。
    1. 称重动物。动物体重必须至少达到25 g，才能进行成功的手术。
    2. 将动物放入一个密封的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室中，并将该腔室连接至异氟烷麻醉装置。设定氧气中异氟烷浓度为1.5%，雄性动物的气体流速设为2.5 L/min，雌性为3.0 L/min2约2分钟后，通过捏脚趾观察是否无回缩反射来确认小鼠是否已适当麻醉。
    3. 麻醉后，将小鼠从麻醉舱中取出，俯卧放置，使其面部位于麻醉鼻罩内。将鼻罩连接至挥发器以接收麻醉气体，并连接废气收集装置以回收气体。废气收集装置将通过活性炭过滤器捕获异氟烷。
    4. 使用剪毛器剃除肩胛骨之间的毛发。确保对剃毛区域进行充分消毒，交替使用碘伏和乙醇擦拭三次。
    5. 将小鼠翻转至仰卧位，保持其面部位于鼻罩中。用胶带将小鼠左腿固定于手术台上，使用电动剃毛器剃除左侧大腿内侧至左上腹部区域的毛发。确保对剃毛区域进行充分消毒，交替使用聚维酮碘和乙醇擦拭三次。
    6. 将一个已激活的市售暖手袋用纱布包裹后，滑入小鼠身下。用胶带将小鼠右腿固定在手术台上。
  4. 将导管插入左侧股静脉。
    1. 在手术显微镜辅助下，使用手术剪从左侧大腿上内侧部位向头侧至中线方向做1 cm切口，暴露股动脉和股静脉。
    2. 用外科皮肤拉钩牵拉松弛的皮肤，以进一步暴露水疱。
    3. 用无菌的0.9%氯化钠溶液处理暴露区域，以保持适当的湿润度。
    4. 使用镊子进行钝性解剖，分离股动脉和静脉周围的一小段结缔组织。仔细分离动脉与静脉（图2).
    5. 使用镊子将一根可吸收缝线（A股）从切口最外侧处穿过股静脉和股动脉的下方。将缝线拉至一半，使两端长度相等。
    6. 在靠近腹股沟更近端的位置，使用镊子将第二根缝线（B线）仅从股静脉下方穿过。轻轻打一个半结，用于限制血流。
    7. 在股静脉下方的A线与B线之间的某一点，用镊子将第三根缝线（C线）仅从股静脉下方穿过。轻柔地打一个完整的结，用于限制血流，注意不要撕裂静脉。
    8. 轻轻拉动B端以限制血流。使用止血钳轻轻牵拉B端，以维持受限的血流状态。
    9. 用显微剪刀在股静脉受限区域剪开一个小孔，将预先用肝素化生理盐水冲洗过的PE-8导管的斜端小心地插入，朝向B线。插入后，松开B线的张力，继续将导管沿静脉向上推进。随后在包含导管的静脉周围收紧B线。
    10. 使用C股线在导管周围再打一个结。确保此结不包含股动脉。
    11. 轻轻回抽注射器筒芯，使血液部分充满导管，以确认导管已正确植入。
  5. 采用相同操作步骤，将PE-10导管插入左侧股动脉。
  6. 完整的手术过程
    1. 在股静脉和股动脉导管均固定后，将A线在两根导管周围打结。
    2. 剪除所有多余的缝线并取下皮肤拉钩。用肝素化生理盐水冲洗动脉导管，以防凝血。灼烧两根导管的末端以形成密封。
    3. 将小鼠置于俯卧位，在颈部基部做一小切口，并向暴露区域滴加生理盐水。
    4. 从颈部切口到股部切口皮下插入中空金属杆。将导管穿过中空金属杆并从颈部切口引出。移除中空金属杆。皮下植入导管可防止小鼠损伤导管。
    5. 将布比卡因涂抹于伤口两侧。用缝线闭合股部切口。在闭合的缝合伤口上涂抹利多卡因软膏。
    6. 将导管穿过一根30 cm长的柔性中空管（弹簧 tether），并将弹簧tether的按钮缝合于皮下。将布比卡因涂抹于伤口两侧。将弹簧tether的按钮缝合于皮下。在闭合的缝合伤口上涂抹利多卡因软膏。
    7. 将小鼠移入一个透明的圆柱形容器（高20 cm，直径13 cm）中，容器配有旋转支架和支撑臂，用于动物在恢复期间的安置。在容器下方放置一个暖手袋，以保持动物体温。
    8. 将弹簧 tether 的顶端拧到转环上，并将转环固定到连接在圆柱形容器上的转臂上。确保小鼠能够自由活动，并且可以接触导管。
    9. 在动物饲养箱上放置一个带孔的盖子，确保其不会妨碍旋转装置的运作。参考 图3 完整的设置。
    10. 让小鼠恢复，建议至少恢复22小时。

2. 准备用于注射的 L-[1-14C]亮氨酸溶液以及用于沉淀血浆样品蛋白的 16% (w/v) 5-磺基水杨酸（SSA）二水合物溶液。在 SSA 溶液中还需加入 0.04 mM 正亮氨酸和每毫升含 1 µCi 的 [H3]亮氨酸，分别作为氨基酸分析及酸溶性血浆组分中示踪剂浓度分析的内标物。SSA 溶液可于 4 °C 保存不超过两个月。

  1. 购买市售的 L-[1-14C]亮氨酸（50-60 mCi/mmol），该产品以 2% 乙醇或 0.1 N HCl 溶液形式出售。取已知放射活性的示踪剂，在温和的氮气流下吹干，然后重新溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为 100 μCi/mL 的溶液。

3. 静脉注射 L-[1-14C]亮氨酸并采集动脉血样本。

  1. 准备所需材料：18 个 1.5 mL 离心管（用于血浆去蛋白处理，每管加入 70 mL 去离子水），17 个 250 mL 玻璃小瓶插件（15 个用于采集动脉血样本，2 个用于收集死腔血以重新注入。为减少额外和不必要的血液采集，建议使用底部锥形、便于移取上清血浆的小型细长玻璃小瓶插件），2 根微毛细管（32 × 0.8 mm，用于 hematocrit 测定），1 根涂有肝素和氟化锂的微型离心管（分别用于防止凝血和糖酵解），止血钳（钳尖用 Tygon 塑料管包裹，以防夹伤 PE 导管），血糖仪，血压换能器，1 mL 无菌注射器（用于生理盐水冲洗），以及市售的安乐死溶液（用去离子水按 1:1 稀释（适用于小鼠））。
  2. 确保实验开始时动物处于正常的生理状态。
    1. 将动脉导管在距末端约 2 cm 处夹住，并剪去管尖，形成血液流出的开口。然后松开夹子，收集死腔血（约 30 µL），以获取之前采样残留的生理盐水和/或血液；另取一个独立离心管，分别采集对照样本（约 30 µL）、红细胞压积样本（约半根毛细管体积）和血糖样本（约 20 µL）。
    2. 用密封胶泥封住毛细管一端，以 4500 × g 离心 1 分钟测定红细胞压积。测量红细胞体积占全血总体积的比例。若动物的红细胞压积低于 30%，则不应继续实验。
    3. 使用市售血糖仪测定一滴血液中的葡萄糖水平。
    4. 将对照样本以 18,000 × g 离心 2 分钟，分离血浆。按如下方法对血浆样本进行去蛋白处理：在 1.5 mL 离心管中加入 5 µL 血浆和 70 µL 去离子水，再加入 25 µL 16% SSA 溶液，涡旋混匀。冰上放置 30 分钟后，置于干冰上冷冻。
    5. 通过静脉通路将死腔血回输给动物，随后用肝素化生理盐水冲洗，以防止过多失血。
    6. 将动脉通路连接至血压换能器，以测量平均动脉血压。
    7. 采样后务必重新夹闭动脉管路，并用少量（50 µL）肝素化生理盐水冲洗管路。
  3. 静脉注射示踪剂并采集定时动脉血样本。
    1. 使用 Y 型连接器，将一支装有示踪剂（100 µCi/kg）的注射器和一支装有 50 µL 无菌生理盐水的注射器连接，以便在注射示踪剂后冲洗静脉通路。将 Y 型连接器连接至静脉通路。
    2. 启动实验时，同时开始计时并注射示踪剂。注射后立即用生理盐水（约 100 µL）冲洗静脉通路。
    3. 在实验前 2 分钟内连续采集第 1 至第 7 个血样，方法相同。采集第 7 个样本后，每次采集后续样本前均需先收集 30 µL 死腔血。第 8 至第 14 个样本分别在 3、5、10、15、30、45 和 60 分钟时采集。
    4. 采集后立即处理血样，处理方法同对照样本。若存在延迟，应将样本置于冰上。通过动脉导管小心将死腔血重新注入动脉，并用肝素化生理盐水冲洗。
    5. 在实验过程中某个时间点，制备三个内标样本：向 75 µL 水中加入 25 µL 16% SSA、0.04 mM 正亮氨酸和 1 mCi/mL [3H]亮氨酸，涡旋混匀后置于冰上。
    6. 在 60 分钟采集第 14 个样本后，向静脉通路注入约 0.2 mL B-euthanasia-D 溶液以处死动物。记录死亡时间。
    7. 将动物从旋转接头装置上卸下并移出动物饲养箱。小心取出脑组织，置于铝箔上，并在干冰上速冻。切勿使用液氮冷冻脑组织，以防脑组织开裂。将脑组织、样本及内标物在 -80 ˚C 下保存，直至进行后续处理。后续处理可在任意时间进行。

4. 分析血浆样品中亮氨酸和L-[1-14C]亮氨酸的浓度。

  1. 将样品和内标物在冰上解冻，涡旋混匀后于2 ˚C以18,000 × g离心5分钟。上清液部分将含有游离的标记与未标记亮氨酸。
  2. 转移 40 µL 将上清液转移至液体闪烁瓶中，并加入闪烁液。定量测定每分钟衰变数（DPM） 3H 和 14通过液体闪烁计数法及专为双标记同时检测设计的淬灭曲线测定 C3H 和 14C）计数。
  3. 使用配备钠阳离子交换柱的高效液相色谱系统，通过柱后邻苯二甲醛衍生化及荧光检测法测定血浆亮氨酸浓度。
    1. 将高效液相色谱仪（HPLC）设置为以下参数：荧光检测器激发波长330 nm，发射波长465 nm。流动相由pH 7.40的钠系洗脱液和含5%四氢噻吩砜（sulfolane）的pH 3.15钠系洗脱液组成。缓冲液流速设为0.400 mL/min，衍生化装置流速设为0.300 mL/min。色谱柱温度设为48 ˚C，反应器温度设为45 ˚C。
    2. 使用30至500 pmol/10mL范围内的氨基酸浓度（包括正亮氨酸）对系统进行校准。校准曲线呈线性。待测10 mL注射样品中的氨基酸浓度均在此校准曲线范围内。

5. 进行定量放射自显影。

  1. 为进行自显影，准备厚度为 20 µm 的脑切片。使用冷冻切片机在 -20 ˚C 下对脑组织进行切片。
  2. 将连续的脑切片贴附于明胶包被的载玻片上，自然解冻后风干。
  3. 将载玻片在 10% 福尔马林溶液中换液洗涤五次，每次 30 分钟，随后用去离子水持续冲洗 1 小时。用铝箔 loosely 覆盖载玻片以防止灰尘污染，并静置干燥 24 小时。
  4. 将载玻片与一组 [14C]甲基丙烯酸甲酯标准品一同放入 X 射线胶片暗盒中（推荐使用可容纳 20×25 cm 乳腺摄影胶片的暗盒），标准品需事先根据已知 14C 浓度的组织进行校准，方法如文献29所述。标准品可商业购买，但需确保其覆盖 2–300 mCi/g 组织的浓度范围，并针对 20 µm 组织厚度进行过校准。在红光安全灯下，将一张乳腺摄影胶片乳剂面向下放置于切片上方。
  5. 密封暗盒并置于黑色换片袋中，存放于柜内曝光 40–45 天。
  6. 按照制造商说明显影胶片。注意：不推荐使用自动胶片显影，因为背景可能不均匀，影响定量结果。

6. 分析图像。

注意：建议使用一种市售的图像分析软件，并结合 CCD 相机和具有均匀照明的荧光灯箱。CCD 相机可检测照明胶片上的相对光密度。

  1. 根据胶片上一组已校准标准品的光密度（OD）构建光密度（OD）与组织14C浓度之间的校准曲线。将这些数据（包括空白或背景值）拟合至多项式方程，二次或三次多项式方程均可获得良好的拟合效果。
  2. 为分析特定脑区，通过与脑图谱比对，在六至八张切片中定位感兴趣区域（ROI）。记录所有切片中ROI内各像素的光密度（OD）值，并依据校准曲线计算每个像素的组织14C浓度，进而计算该ROI内的平均组织14C浓度。

7. rCPS 的计算。通过以下公式计算每个 ROI 的 rCPS：

公式中的静态平衡方程 \( R_i = \frac{P_i^*}{\lambda_i \int_0^T \left[\frac{C_p^*(t)}{C_p}\right] dt} \)

其中，P*(T) 表示 ROI 内组织中 14C 的加权平均浓度，Cp(t) 和 C*p(t) 分别表示在时间 t 时动脉血浆中未标记和标记亮氨酸的浓度，T 为动物死亡的时间（约 60 分钟），λ 表示组织前体池中来自血浆的亮氨酸所占的比例。对 λ 的评估需通过单独的实验进行6。λ 已在野生型（WT）、Fmr1 基因敲除型、Tsc+/- 型以及苯丙酮尿症（PKU）小鼠中进行了评估6,22,25,28。如果实验涉及可能影响蛋白质合成、降解或亮氨酸代谢速率的遗传或药理学干预，则应在新的实验条件下重新评估 λ 的值。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

此处展示了一项代表性实验，用于说明预先给予蛋白质合成抑制剂对rCPS的影响。在开始测定rCPS前30分钟，通过皮下注射给予成年雄性C57/BL6野生型小鼠生理盐水溶解的茴香霉素（100 mg/kg）。与给予溶剂对照的动物相比，茴香霉素处理组小鼠的rCPS几乎无法检测到（图4）。这些数据表明，体内放射自显影法使用L-[1-14C]-亮氨酸测定脑内蛋白质合成速率的方法是可靠的。

我们展示了一幅L-[1-14C]-亮氨酸放射自显影图，显示脑部四个层面的方法分辨率（图5）。图示为嗅球中的细胞层图 5A 和 B），海马体（图5C），以及小脑（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们介绍一种在实验动物体内定量测定脑区蛋白质合成速率（rCPS）的方法。该方法相较于现有方法具有显著优势：1. 测量在清醒、正常活动的动物中进行，因此能够反映大脑功能状态下正在进行的生理过程。2. 通过定量放射自显影技术进行测量，可同时测定脑内所有区域及亚区域的rCPS。3. 该方法的动力学模型考虑了组织蛋白质降解产生的未标记氨基酸重新进入氨基酸池（即“再循环”）的可能性，及其对蛋白质合成前体池的影响6。

该方法的主要局限性在于其耗时且要求较高。尽管采用更简单、通量更高的方法颇具吸引力，但必须认识到所获得数据的局限性。

由于在完整的小鼠体内测量rCPS具有复杂性，可能会遇到维持正常生理状态、采集足够的血液样本以及避免可能干扰因素等方面的问题。静脉和动脉导管的外科植入具有挑战性。与任何外科手术一样，尤其是处理 delicate vasculature 时，动物死亡存在固有风险。对我们而言，这种情况较为罕见（约1%）。在随后22小时的恢复期间，偶尔（约4%）会有动物将导管拔出。在测量...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢夏增艳在小鼠基因分型方面的工作，感谢汤姆·伯林在氨基酸和胶片处理方面的工作，以及感谢秦梅在部分rCPS实验中的贡献。本研究由美国国家精神卫生研究院（NIMH）院内研究计划（ZIA MH00889）资助。RMS还获得了自闭症之声基金会博士后奖学金（8679）和FRAXA博士后奖学金的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠杰克逊实验室003024Fmr1 基因敲除繁育对
茴香霉素Tocris 生物科学1290
微量压积管德拉蒙德科学公司1-000-3200-H毛细管
Critoseal 毛细管密封剂徕卡显微系统公司39215003密封腻子
玻璃小瓶内插管安捷伦科技公司5183-2089用于采集血液样本
Digi-Med 血压分析仪Micro-Med 公司BPA-400血压分析仪
Bayer Breeze 2 血糖监测系统Bayer Breeze9570A血糖仪
气密注射器哈密尔顿公司1710结核菌素玻璃注射器
HeatMax HotHands-2 暖手袋HeatMax型号 HH2加热垫
肝素锁冲洗液Fresenius Kabi USA, LLC504505肝素生理盐水
透明动物容器InstechMTANK/W动物饲养笼
弹簧束缚装置InstechPS62导管管路/啮齿类动物固定装置
旋转接头Instech375/25连接至弹簧束缚装置
旋转臂及支架InstechSMCLA连接旋转接头和动物饲养笼
束缚按钮InstechVAB62BS/22连接至弹簧束缚装置底部
不锈钢管自制N/A用于将导管穿过小鼠体内
Matrx VIP 3000Matrx91305430异氟烷蒸发器
异氟烷Stoelting 公司50207异氟烷/氟烷吸附剂
电动剪毛器Oster Finisher型号 59
外科皮肤拉钩自制（??）N/A（??）
0.9% 氯化钠生理盐水APP 制药有限责任公司918610
镊子精细科学工具公司11274-20
手术剪刀精细科学工具公司14058-11
显微剪刀精细科学工具公司15000-00
UNIFY 丝制外科缝线AD 外科公司#S-S618R136-0 USP，不可吸收
PE-8 聚乙烯管SAI 输注技术公司PE-8-25
注射器贝克顿-迪金森公司3096591cc/mL
PE-10 聚乙烯管Clay Adams427400
MCID 分析软件Imaging Research 公司版本 7.0光密度分析
明胶包被载玻片（75×25 mm）FD NeurotechnologiesPO101
冷冻切片机徕卡CM1850
Super RX-N 医用X光胶片富士47410-19291
Hypercassette（8×10 英寸）Amersham Pharmacia Biotech11649
[1-14C]亮氨酸MoravekMC404E
微量离心管Sarstedt 股份有限公司 & Co.72.692.005用于血液样本去蛋白处理
玻璃巴斯德移液管Wheaton357335
玻璃棉西格玛-奥德里奇公司18421
氮气美国国立卫生研究院供应中心6830009737285
闪烁液CytoScint882453
液体闪烁计数器Packard Tri-Carb2250CA
氨基酸分析仪Pickering 实验室Pinnacle PCX
HPLC 系统安捷伦科技公司1260 Infinity包含 1260 Bio-Inert 泵
手术显微镜Wild HeerbruggM650
磺基水杨酸西格玛-奥德里奇公司MKBS1634V5-磺基水杨酸二水合物
正亮氨酸西格玛公司N8513
1.0 N HCl西格玛-奥德里奇公司H9892
[H3]亮氨酸MoraevkMC672
Falcon 管赛默飞世尔科技公司33965250 mL 圆锥形离心管
秒表Heuer Microsplit型号 10001/100 分钟
安乐死溶液Vet OneH6438
Northern Light 精密照明器Imaging Research 公司型号 B95荧光灯箱
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8尼康1442CDD 相机

参考文献

  1. West, A. E., et al. Calcium regulation of neuronal gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 11024-11031 (2001).
  2. Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R. W., Fisher, S., Uhler, M. Basic Neurochemistry. , 6th ed, Lippincott-Raven. New York. (1999).
  3. Nguyen, P. V., Abel, T., Kandel, E. R. Requirement of a critical period of transcription for induction of a late phase of LTP. Science. 265, 1104-1107 (1994).
  4. Mao, Z., Bonni, A., Xia, F., Nadal-Vicens, M., Greenberg, M. E. Neuronal activity-dependent cell survival mediated by transcription factor MEF2. Science. 286, 785-790 (1999).
  5. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Current advances in local protein synthesis and synaptic plasticity. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 7147-7150 (2006).
  6. Smith, C. B., Deibler, G. E., Eng, N., Schmidt, K., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral protein synthesis in vivo: influence of recycling of amino acids derived from protein degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85, 9341-9345 (1988).
  7. Schmidt, K. C., Smith, C. B. Resolution, sensitivity and precision with autoradiography and small animal positron emission tomography: implications for functional brain imaging in animal research. Nuclear Medicine and Biology. 32, 719-725 (2005).
  8. Banker, G., Cotman, C. W. Characteristics of different amino acids as protein precursors in mouse brain: advantages of certain carboxyl-labeled amino acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 142, 565-573 (1971).
  9. Frerichs, K. U., et al. Suppression of protein synthesis in brain during hibernation involves inhibition of protein initiation and elongation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 14511-14516 (1998).
  10. Abrams, R. M., Burchfield, D. J., Sun, Y., Smith, C. B. Rates of local cerebral protein synthesis in fetal and neonatal sheep. The American Journal of Physiology. 272, R1235-R1244 (1997).
  11. Nakanishi, H., et al. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. The European Journal of Neuroscience. 9, 271-279 (1997).
  12. Sun, Y., Deibler, G. E., Sokoloff, L., Smith, C. B. Determination of regional rates of cerebral protein synthesis adjusted for regional differences in recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool in conscious adult rats. Journal of Neurochemistry. 59, 863-873 (1992).
  13. Scammell, T. E., Schwartz, W. J., Smith, C. B. No evidence for a circadian rhythm of protein synthesis in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain Research. 494, 155-158 (1989).
  14. Smith, C. B., Eintrei, C., Kang, J., Sun, Y. Effects of thiopental anesthesia on local rates of cerebral protein synthesis in rats. The American Journal of Physiology. 274, E852-E859 (1998).
  15. Sun, Y., Deibler, G. E., Smith, C. B. Effects of axotomy on protein synthesis in the rat hypoglossal nucleus: examination of the influence of local recycling of leucine derived from protein degradation into the precursor pool. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 13, 1006-1012 (1993).
  16. Smith, C. B., Yu, W. H. Rates of protein synthesis in the regenerating hypoglossal nucleus: effects of testosterone treatment. Neurochemical Research. 19, 623-629 (1994).
  17. Orzi, F., Sun, Y., Pettigrew, K., Sokoloff, L., Smith, C. B. Effects of acute and delayed effects of prior chronic cocaine administration on regional rates of cerebral protein synthesis in rats. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 272, 892-900 (1995).
  18. Nadel, J., et al. Voluntary exercise regionally augments rates of cerebral protein synthesis. Brain Research. 1537, 125-131 (2013).
  19. Sun, Y., et al. Rates of local cerebral protein synthesis in the rat during normal postnatal development. The American Journal of Physiology. 268, R549-R561 (1995).
  20. Smith, C. B., Sun, Y., Sokoloff, L. Effects of aging on regional rates of cerebral protein synthesis in the Sprague-Dawley rat: examination of the influence of recycling of amino acids derived from protein degradation into the precursor pool. Neurochemistry International. 27, 407-416 (1995).
  21. Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B. The effects of aging on local rates of cerebral protein synthesis in rats. Monographs in Neural Sciences. 11, 47-50 (1984).
  22. Sare, R. M., Huang, T., Burlin, T., Loutaev, I., Smith, C. B. Decreased rates of cerebral protein synthesis measured in vivo in a mouse model of Tuberous Sclerosis Complex: unexpected consequences of reduced tuberin. Journal of Neurochemistry. 145, 417-425 (2018).
  23. Liu, Z. H., Huang, T., Smith, C. B. Lithium reverses increased rates of cerebral protein synthesis in a mouse model of fragile X syndrome. Neurobiology of Disease. 45, 1145-1152 (2012).
  24. Qin, M., et al. Altered cerebral protein synthesis in fragile X syndrome: studies in human subjects and knockout mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 499-507 (2013).
  25. Qin, M., Kang, J., Burlin, T. V., Jiang, C., Smith, C. B. Postadolescent changes in regional cerebral protein synthesis: an in vivo study in the FMR1 null mouse. The Journal of Neuroscience: the Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, 5087-5095 (2005).
  26. Qin, M., et al. R-Baclofen Reverses a Social Behavior Deficit and Elevated Protein Synthesis in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 18, pyv034(2015).
  27. Qin, M., et al. Cerebral protein synthesis in a knockin mouse model of the fragile X premutation. ASN Neuro. 6, (2014).
  28. Smith, C. B., Kang, J. Cerebral protein synthesis in a genetic mouse model of phenylketonuria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11014-11019 (2000).
  29. Reivich, M., Jehle, J., Sokoloff, L., Kety, S. S. Measurement of regional cerebral blood flow with antipyrine-14C in awake cats. Journal of Applied Physiology. 27, 296-300 (1969).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

定量放射自显影L-14C亮氨酸示踪剂脑区分析活体测量动脉血采样脑组织切片光密度校准蛋白质合成速率放射自显影成像
体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。