体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法

摘要

蛋白质合成是 细胞的一项关键生物学过程。在大脑中，该过程对适应性变化至关重要。测量完整大脑中的蛋白质合成速率需要仔细考虑方法学因素。本文介绍了L-[1-¹⁴体内脑区蛋白质合成速率测定的C-亮氨酸定量放射自显影法

摘要

蛋白质合成对于神经元功能的发育和维持至关重要，并参与神经系统中的适应性变化。此外，人们认为神经系统中蛋白质合成的失调可能是某些发育障碍的核心表型。在动物模型中准确测量脑内蛋白质合成速率，对于理解这些疾病具有重要意义。我们所建立的方法旨在用于清醒、行为正常动物的研究。该方法为定量放射自显影法，可同时获得脑内所有区域的合成速率。该方法基于使用示踪氨基酸L-[1-¹⁴C]-亮氨酸以及L-亮氨酸在脑内代谢行为的动力学模型。我们选择L-[1-¹⁴C]-亮氨酸作为示踪剂，是因为其不会产生额外的标记代谢产物。该示踪剂要么被掺入蛋白质中，要么迅速代谢生成¹⁴CO₂，后者在脑内大量未标记的CO₂池中被稀释。该方法及模型还可校正组织蛋白水解产生的未标记亮氨酸对蛋白质合成前体库的贡献。该方法具有足够的空间分辨率，可测定细胞层、神经毡层以及下丘脑和脑神经核团中的蛋白质合成速率。为了获得可靠且可重复的定量数据，严格遵循操作细节至关重要。本文将详细介绍利用定量放射自显影L-[1-¹⁴C]-亮氨酸法在活体条件下测定脑区特异性蛋白质合成速率的具体操作步骤。

引言

蛋白质合成是 神经系统长期适应性变化所必需的重要生物学过程¹抑制蛋白质合成会阻断无脊椎动物和脊椎动物的长期记忆存储²蛋白质合成对于维持某些形式的长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的晚期阶段至关重要³发育过程中的神经元存活⁴以及神经元及其突触连接的常规维持⁵脑蛋白合成速率的测量可能是研究适应性变化以及神经发育障碍和与学习记忆相关疾病的重要工具。

我们已开发出一种方法，可在清醒动物体内定量测定脑蛋白质合成速率，该方法相较于其他用于估计脑组织离体或体外样本中合成速率的技术具有固有优势⁶。最主要的优势在于其适用于清醒动物完整脑组织中的测量。这一点至关重要，因为它能够在突触结构与功能保持完整的情况下进行测定，且无需担忧死后效应的影响。此外，我们所采用的定量放射自显影方法具有高度的空间定位能力。尽管¹⁴C的能量限制使得我们无法在亚细胞或细胞水平上对示踪剂进行精确定位，但我们仍可在细胞层和如下丘脑核团等较小的脑区中测量合成速率，空间分辨率约为25 µm⁷。

使用放射性示踪剂进行体内测量的一个挑战在于确保所测得的放射性标记存在于目标反应产物中，而非未反应的标记前体或其他非相关的标记代谢产物中。⁶我们选择了 L-[1-¹⁴C]-亮氨酸作为示踪氨基酸，因为它要么被掺入蛋白质，要么迅速被代谢 ¹⁴CO_2, 在大量未标记的CO中被稀释₂ 由于大脑能量代谢速率高，导致脑组织中产生⁸此外，任何 ¹⁴未掺入蛋白质的C主要以游离形式存在[¹⁴C]-亮氨酸，在60分钟的实验期间内，几乎完全从组织中清除⁶蛋白质随后用甲醛固定于组织上，并用清水冲洗以去除任何游离的[¹⁴C]-亮氨酸标记，随后进行放射自显影。

另一个重要的考虑因素是，组织蛋白质分解产生的非标记氨基酸会稀释前体氨基酸池的特异性放射活性。我们已证明，在成年大鼠和小鼠中，脑内蛋白质合成所用的前体亮氨酸池约有40%来源于蛋白质降解产生的氨基酸⁶。在计算脑区蛋白质合成速率（rCPS）时必须计入这一因素，并且在相关关系可能发生改变的研究中必须对此加以验证。该方法的理论基础和假设已在其他文献中详细阐述⁶。本文则重点讨论该方法应用中的实验操作问题。

该方法已用于测定地松鼠⁹、绵羊¹⁰、恒河猴¹¹、大鼠^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}、结节性硬化症小鼠模型²²、脆性X综合征小鼠模型^23,24,25,26、脆性X前突变小鼠²⁷以及苯丙酮尿症小鼠模型²⁸中的rCPS。在本论文中，我们介绍了使用活体放射自显影L-[1-¹⁴C]-亮氨酸法测定rCPS的操作步骤。我们展示了清醒对照小鼠脑区中的rCPS。此外，我们还证明了体内给予翻译抑制剂茴香霉素可完全消除脑内的蛋白质合成。

方案

注意：所有动物实验程序均经国家精神卫生研究所动物护理与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院关于动物护理与使用的指南进行。

方案的概述见图1。

1. 通过手术在股静脉和股动脉植入导管，分别用于示踪剂的给药和定时采集动脉血样。手术需在示踪剂给药前至少22小时完成，手术过程约需1小时。

1. 准备所需材料：无菌外科器械（手术剪、显微剪、镊子、三把外科皮肤拉钩），异氟烷麻醉设备（异氟烷挥发罐、主动式废气清除装置、密闭麻醉室、麻醉鼻罩），无菌手术台，毛发剪刀，70% 乙醇，聚维酮碘，无菌纱布，外科胶带，市售暖手袋，手术显微镜，无菌0.9%氯化钠溶液（生理盐水），含肝素100 USP单位/毫升的无菌0.9%氯化钠溶液（肝素化生理盐水），无菌6-0可吸收缝线五段，每段20厘米，无菌聚乙烯导管PE-8和PE-10各一段，长度均为25厘米，一端切成45度斜面^o，无菌1 cc注射器，无菌32号针头，电灼设备，无菌15-20 cm中空不锈钢棒（内径2.5 mm，外径3 mm），局部麻醉药（布比卡因和利多卡因软膏），以及配备旋转装置的动物饲养笼（30 cm弹簧束缚装置，带转环、转环支架和臂杆，20 × 13 cm透明圆柱形容器）。
2. 准备动物以进行手术。
3. 确保根据贵机构的要求，采用适当的无菌和无菌技术。
   1. 称重动物。动物体重必须至少达到25 g，才能进行成功的手术。
   2. 将动物放入一个密封的聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）舱内，并将舱体连接至异氟烷麻醉装置。雄性动物的气体流量设为2.5 L/min，雌性为3.0 L/min，异氟烷浓度为1.5%（以O₂为载体）₂大约2分钟后，通过轻捏脚趾检查小鼠是否已适当麻醉，若无退缩反射则表明麻醉效果合适。
   3. 麻醉后，将小鼠从麻醉舱中取出，使其呈俯卧位，面部置于麻醉鼻罩内。将鼻罩连接至麻醉机蒸发器供气，并连接废气回收系统。回收系统将通过活性炭过滤器收集异氟烷。
   4. 使用电推剪剃除肩胛骨之间的毛发。确保对剃毛区域进行彻底消毒，用聚维酮碘和乙醇反复交替擦拭三次。
   5. 将小鼠翻转至仰卧位，保持其面部位于鼻罩内。用胶带将小鼠左腿固定于手术台上，使用剃毛器剃除从左侧大腿内侧至左上腹部区域的毛发。确保对剃毛区域进行彻底消毒，交替使用碘伏和乙醇擦拭三次。
   6. 将一个已激活的市售暖手袋用纱布包裹后，滑入小鼠身下。用胶带将小鼠右腿固定在手术台上。
4. 将导管插入左侧股静脉。
   1. 在手术显微镜辅助下，使用手术剪从左侧大腿上内侧区域向头侧至中线处做一长约1厘米的切口，暴露股动脉和股静脉。
   2. 使用外科皮肤拉钩回缩松弛的皮肤，以进一步暴露水疱。
   3. 将无菌0.9%氯化钠溶液涂抹于暴露区域，以保持适当的湿润度。
   4. 使用镊子进行钝性解剖，分离股动脉和静脉周围的一小段结缔组织。仔细分离动脉与静脉（图2).
   5. 用镊子将一根可吸收缝线（A线）从切口最外侧处穿过股静脉和股动脉的下方。将缝线拉至一半，使两端长度相等。
   6. 在靠近腹股沟更近的位置，使用镊子将第二根缝线（Strand B）仅从股静脉下方穿过。轻轻打一个半结，用于限制血流。
   7. 在A线与B线之间的某一点，用镊子将第三根缝线（C线）仅从股静脉下方穿过。轻轻打一个完整的结，用于限制血流，注意不要撕裂静脉。
   8. 轻轻拉动B端以限制血流。使用止血钳轻轻牵拉B端，以维持受限的血流状态。
   9. 用显微剪刀在股静脉受限区域剪开一个小孔，将预先用肝素化生理盐水冲洗过的PE-8导管的斜端小心插入，方向朝向Strand B。插入后，松开Strand B的张力，并继续将导管沿静脉向上推进。随后，在包含导管的静脉周围收紧Strand B。
   10. 使用C股线在导管周围再打一个结。确保此结不缠绕股动脉。
   11. 轻轻回拉注射器筒，使血液部分充满导管，以确认导管已正确植入。
5. 采用相同操作步骤，将PE-10导管插入左侧股动脉。
6. 完整的手术过程
   1. 在股静脉和股动脉导管均固定后，将A线在两根导管周围打结。
   2. 剪除所有多余的缝线并取下皮肤拉钩。用肝素化生理盐水冲洗动脉导管，以防凝血。电灼两根导管的末端以形成密封。
   3. 将小鼠置于俯卧位，在颈部基部做一小切口，并向暴露区域滴加生理盐水。
   4. 从颈部切口到股部切口皮下插入中空金属导管。将导管经中空金属导管穿引并从颈部切口引出。移除中空金属导管。皮下植入导管可防止小鼠损伤导管。
   5. 将布比卡因涂抹于伤口两侧。用缝线闭合股部切口。在已闭合的缝合伤口上涂抹利多卡因软膏。
   6. 将导管穿过一根30厘米长的柔性中空管（弹簧 tether），并将弹簧 tether 的按钮缝合于皮下。在伤口两侧涂抹布比卡因。将弹簧 tether 的按钮缝合于皮下。在闭合的缝合伤口上涂抹利多卡因软膏。
   7. 将小鼠移入一个透明的圆柱形容器（高20 cm，直径13 cm）中，容器配有旋转支架和固定臂，用于动物在恢复期间的安置。在容器下方放置一个暖手袋，以保持动物体温。
   8. 将弹簧 tether 的顶端拧到一个旋转接头（swivel）上，并将该旋转接头固定到连接在圆柱形容器上的旋转臂（swivel arm）上。确保小鼠能够自由活动，且导管可被顺利接触。
   9. 在动物饲养箱上放置一个带孔盖子，确保其不会妨碍旋转装置的运作。参见 图3 完整设置。
   10. 让小鼠恢复，建议至少恢复22小时。

2. 准备用于注射的L-[1-¹⁴C]亮氨酸溶液以及用于沉淀血浆样品蛋白的16% (w/v) 5-磺基水杨酸（SSA）二水合物溶液。在SSA溶液中还需加入0.04 mM正亮氨酸和每毫升含1 µCi的[³H]亮氨酸，分别作为氨基酸分析及酸可溶性血浆组分中示踪剂浓度分析的内标物。SSA溶液可在4 ˚C下保存最多两个月。

1. 购买市售的L-[1-¹⁴C]亮氨酸（50-60 mCi/mmol），该产品以2%乙醇或0.1 N HCl溶液形式出售。取已知放射活性的示踪剂，在温和的氮气流下吹干，然后重新溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为100 μCi/mL的溶液。

3. 静脉注射 L-[1-¹⁴C]亮氨酸并采集动脉血样本。

1. 准备所需材料：18 个 1.5 mL 微量离心管（用于血浆去蛋白处理，每管加入 70 µL 去离子水），17 个 250 mL 玻璃小瓶内插管（其中 15 个用于采集动脉血样本，2 个用于收集死腔血并重新注入。为减少额外和不必要的血液采集，建议使用底部锥形、细小且壁薄的玻璃内插管，以便于吸取上清血浆），2 根微毛细管（32 × 0.8 mm，用于 hematocrit 测定），1 根涂有肝素和氟化锂的微量离心管（分别用于防止凝血和糖酵解），止血钳（钳尖用 Tygon 软管包裹，以防夹伤 PE 导管），血糖仪，血压传感器，1 mL 无菌注射器（用于生理盐水冲洗），以及市售的安乐死溶液（用去离子水按 1:1 稀释，适用于小鼠）。
2. 确保实验开始时动物处于正常的生理状态。
   1. 将动脉导管末端约 2 cm 处夹闭，并剪去管尖，以形成血液流出的开口。随后松开夹子，收集死腔血（约 30 µL），以清除之前残留的生理盐水和/或血液；另取一独立试管，采集对照样本（约 30 µL）、hematocrit 样本（约半管毛细管体积）和血糖样本（约 20 µL）。
   2. 用封口胶泥封闭毛细管一端，于 4500 × g 离心 1 分钟测定 hematocrit。计算红细胞体积占全血体积的比例。若动物 hematocrit 低于 30%，则不应继续实验。
   3. 使用市售血糖仪测定一滴血液中的葡萄糖水平。
   4. 将对照样本于 18,000 × g 离心 2 分钟以分离血浆。按如下方法对血浆样本进行去蛋白处理：取 5 µL 血浆加入含 70 µL 去离子水的 1.5 mL 微量离心管中，再加入 25 µL 16% 高氯酸（SSA）溶液，涡旋混匀。冰上静置 30 分钟后，置于干冰上速冻。
   5. 通过静脉通路将死腔血回输给动物，随后用肝素化生理盐水冲洗，以防止过度失血。
   6. 将动脉通路连接至血压传感器，以测量平均动脉血压。
   7. 采样后务必重新夹闭动脉管路，并用少量（50 µL）肝素化生理盐水冲洗管路。
3. 静脉注射示踪剂，并采集定时动脉血样本。
   1. 使用 Y 型连接器，将一支装有示踪剂（100 µCi/kg）的注射器和一支装有 50 µL 无菌生理盐水的注射器连接，以便在注射示踪剂后冲洗静脉通路。将 Y 型连接器接入静脉管路。
   2. 同时启动秒表并注射示踪剂，以开始实验。注射后立即用生理盐水（约 100 µL）冲洗静脉管路。
   3. 在实验开始后的前 2 分钟内，连续采集第 1 至第 7 个血样，方法相同。采集第 7 个样本后，每次采集后续样本前均需先收集 30 µL 死腔血。第 8 至第 14 个样本分别于 3、5、10、15、30、45 和 60 分钟采集。
   4. 采集后应立即处理血样，处理方法同对照样本。若存在延迟，应将样本置于冰上。通过动脉导管小心地将死腔血重新注入动脉，并用肝素化生理盐水冲洗。
   5. 在实验过程中某一时点，制备三份内标品：向 75 µL 水中加入 25 µL 16% SSA、0.04 mM 正亮氨酸（norleucine）和 1 mCi/mL [³H]亮氨酸，涡旋混匀后置于冰上。
   6. 在第 60 分钟采集第 14 个样本后，向静脉通路注入约 0.2 mL B-euthanasia-D 溶液以实施安乐死。记录死亡时间。
   7. 将动物从旋转装置上取下并移出动物饲养箱。小心取出脑组织，置于铝箔上，并在干冰上速冻。切勿使用液氮冷冻脑组织，以防脑组织开裂。将脑组织、样本及内标品于 -80 ˚C 保存，直至准备处理。后续任一时间点均可进行样本处理。

4. 分析血浆样品中亮氨酸和L-[1-¹⁴C]亮氨酸的浓度。

1. 将样品和内标物置于冰上解冻，涡旋混匀后在2 ˚C下以18,000 × g离心5分钟。上清液中含有游离的标记与未标记亮氨酸。
2. 将40 µL上清液转移至液体闪烁计数小瓶中，加入闪烁液。定量测定每分钟衰变数（DPM） ³H 和 ¹⁴通过液体闪烁计数法及专为同时双标记设计的淬灭曲线测定 C³H 和 ¹⁴C）计数。
3. 使用配备钠阳离子交换柱的高效液相色谱系统，通过柱后邻苯二甲醛衍生化及荧光检测法测定血浆亮氨酸浓度。
   1. 将高效液相色谱仪（HPLC）设置如下：荧光检测器激发波长330 nm，发射波长465 nm。流动相由pH 7.40的钠盐洗脱液和含5%四氢噻吩砜（sulfolane）的pH 3.15钠盐洗脱液组成。缓冲液流速设为0.400 mL/min，衍生化装置流速设为0.300 mL/min。色谱柱温度设为48 ˚C，反应器温度设为45 ˚C。
   2. 使用30至500 pmol/10mL范围内的氨基酸浓度（包括正亮氨酸）对系统进行校准。校准曲线呈线性。待测10 mL注射样品中的氨基酸浓度均处于该校准曲线范围内。

5. 进行定量放射自显影。

1. 准备厚度为 20 µm 的脑切片用于放射自显影。使用冷冻切片机在 -20 ˚C 下对脑组织进行切片。
2. 将连续的脑切片贴附于明胶包被的载玻片上，自然风干。
3. 将载玻片在五次更换的 10% 甲醛溶液中洗涤，每次 30 分钟，随后用去离子水持续冲洗 1 小时。用铝箔松散覆盖载玻片以防止灰尘污染，并静置干燥 24 小时。
4. 将载玻片与一组 [¹⁴C]甲基丙烯酸甲酯标准品一同放入 X 射线胶片暗盒中（推荐使用可容纳 20×25 cm 乳腺摄影胶片的暗盒），标准品应已根据已知 ¹⁴C 浓度的组织进行校准，方法如文献²⁹所述。标准品可商业购买，但需确保其覆盖 2–300 mCi/g 组织的浓度范围，并针对 20 µm 组织厚度进行校准。在红光安全灯下，将一张乳腺摄影胶片乳剂面向下放置于切片上方。
5. 密封暗盒，放入黑色换片袋中，并在柜内存放 40–45 天。
6. 按照制造商说明显影胶片。注意：不推荐使用自动胶片显影，因为背景可能不均匀，影响定量分析。

6. 分析图像。

注意：建议使用市售的图像分析软件，并配备CCD相机和具有均匀照明的荧光成像仪。CCD相机可检测曝光胶片中的相对光密度。

1. 根据胶片上一组校准标准品的光密度（OD）构建光密度（OD）与组织¹⁴C浓度的校准曲线。将这些数据（包括空白或背景值）拟合至多项式方程，二次或三次多项式方程均可获得良好拟合。
2. 为分析特定脑区，通过与脑图谱比对，在六至八张切片中定位感兴趣区域（ROI）。记录所有切片中该区域内各像素的光密度（OD），并依据校准曲线计算每个像素的组织¹⁴C浓度。进一步计算该感兴趣区域（ROI）内组织¹⁴C浓度的平均值。

7. rCPS 的计算。通过以下公式计算每个 ROI 中的 rCPS：

其中 P*(T) 表示 ROI 内组织中 ¹⁴C 的加权平均浓度，C_p(t) 和 C^*_p(t) 分别表示在时间 t 时动脉血浆中未标记和标记亮氨酸的浓度，T 表示动物死亡的时间（约 60 分钟），λ 表示组织前体池中来自血浆的亮氨酸所占的比例。λ 的评估需通过单独的实验进行⁶。λ 值已在野生型（WT）、Fmr1 基因敲除型、Tsc^+/- 型以及苯丙酮尿症（PKU）小鼠中进行了评估^6,22,25,28。如果实验涉及可能影响蛋白质合成、降解或亮氨酸代谢速率的遗传或药理学干预，则应在新的实验条件下重新评估 λ 值。

结果

此处展示了一项代表性实验，用于说明预先给予蛋白质合成抑制剂对rCPS的影响。在开始测定rCPS前30分钟，将溶于生理盐水中的茴香霉素（100 mg/kg）皮下注射至一只成年C57/BL6雄性野生型小鼠体内。与溶剂处理的对照动物相比，茴香霉素处理的小鼠中rCPS几乎无法检测到（图4）。这些数据表明，体内放射自显影L-[1-¹⁴C]-亮氨酸法能够准确测量脑组织中的蛋白质合成速率。

我们展示了一张L-[1-¹⁴C]-亮氨酸放射自显影图展示了脑部四个层面的结果，以证明该方法的分辨率（图5). 图示为嗅球中的细胞层图 5A 和 B），海马体（图5C）...

讨论

我们介绍一种在实验动物体内定量测定脑区蛋白质合成速率（rCPS）的方法。该方法相较于现有方法具有显著优势：1. 测量在清醒、正常活动的动物中进行，因此能够反映大脑功能状态下正在进行的生理过程。2. 通过定量放射自显影技术进行测量，可同时测定脑内所有区域及亚区域的rCPS。3. 该方法的动力学模型考虑了组织蛋白质降解产生的未标记氨基酸重新进入氨基酸池（即“再循环”）的可能性，及其对蛋白质合成前体池的影响⁶。

该方法的主要局限性在于其耗时且要求较高。尽管采用更简单、通量更高的方法颇具吸引力，但必须认识到所获得数据的局限性。

由于在完整的小鼠体内测量rCPS具有复杂性，可能会遇到维持正常生理状态、采集足够的血液样本以及避免可能干扰因素等方面的问题。静脉和动脉导管的外科植入具有挑战性。与任何外科手术一样，尤其是处理 delicate vasculature 时，动物死亡存在固有风险。对我们而言，这种情况较为罕见（约1%）。在随后22小时的恢复期间，偶尔（约4%）会有动物将导管拔出。在测量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠	杰克逊实验室	003024	Fmr1 基因敲除繁育对
茴香霉素	Tocris 生物科学	1290
微量压积管	德拉蒙德科学公司	1-000-3200-H	毛细管
Critoseal 毛细管密封剂	徕卡显微系统公司	39215003	密封腻子
玻璃小瓶内插管	安捷伦科技公司	5183-2089	用于采集血液样本
Digi-Med 血压分析仪	Micro-Med 公司	BPA-400	血压分析仪
Bayer Breeze 2 血糖监测系统	Bayer Breeze	9570A	血糖仪
气密注射器	哈密尔顿公司	1710	结核菌素玻璃注射器
HeatMax HotHands-2 暖手袋	HeatMax	型号 HH2	加热垫
肝素锁冲洗液	Fresenius Kabi USA, LLC	504505	肝素生理盐水
透明动物容器	Instech	MTANK/W	动物饲养笼
弹簧束缚装置	Instech	PS62	导管管路/啮齿类动物固定装置
旋转接头	Instech	375/25	连接至弹簧束缚装置
旋转臂及支架	Instech	SMCLA	连接旋转接头和动物饲养笼
束缚按钮	Instech	VAB62BS/22	连接至弹簧束缚装置底部
不锈钢管	自制	N/A	用于将导管穿过小鼠体内
Matrx VIP 3000	Matrx	91305430	异氟烷蒸发器
异氟烷	Stoelting 公司	50207	异氟烷/氟烷吸附剂
电动剪毛器	Oster Finisher	型号 59
外科皮肤拉钩	自制（??）	N/A（??）
0.9% 氯化钠生理盐水	APP 制药有限责任公司	918610
镊子	精细科学工具公司	11274-20
手术剪刀	精细科学工具公司	14058-11
显微剪刀	精细科学工具公司	15000-00
UNIFY 丝制外科缝线	AD 外科公司	#S-S618R13	6-0 USP，不可吸收
PE-8 聚乙烯管	SAI 输注技术公司	PE-8-25
注射器	贝克顿-迪金森公司	309659	1cc/mL
PE-10 聚乙烯管	Clay Adams	427400
MCID 分析软件	Imaging Research 公司	版本 7.0	光密度分析
明胶包被载玻片（75×25 mm）	FD Neurotechnologies	PO101
冷冻切片机	徕卡	CM1850
Super RX-N 医用X光胶片	富士	47410-19291
Hypercassette（8×10 英寸）	Amersham Pharmacia Biotech	11649
[1-14C]亮氨酸	Moravek	MC404E
微量离心管	Sarstedt 股份有限公司 & Co.	72.692.005	用于血液样本去蛋白处理
玻璃巴斯德移液管	Wheaton	357335
玻璃棉	西格玛-奥德里奇公司	18421
氮气	美国国立卫生研究院供应中心	6830009737285
闪烁液	CytoScint	882453
液体闪烁计数器	Packard Tri-Carb	2250CA
氨基酸分析仪	Pickering 实验室	Pinnacle PCX
HPLC 系统	安捷伦科技公司	1260 Infinity	包含 1260 Bio-Inert 泵
手术显微镜	Wild Heerbrugg	M650
磺基水杨酸	西格玛-奥德里奇公司	MKBS1634V	5-磺基水杨酸二水合物
正亮氨酸	西格玛公司	N8513
1.0 N HCl	西格玛-奥德里奇公司	H9892
[H3]亮氨酸	Moraevk	MC672
Falcon 管	赛默飞世尔科技公司	339652	50 mL 圆锥形离心管
秒表	Heuer Microsplit	型号 1000	1/100 分钟
安乐死溶液	Vet One	H6438
Northern Light 精密照明器	Imaging Research 公司	型号 B95	荧光灯箱
Micro-NIKKOR 55mm f/2.8	尼康	1442	CDD 相机