通过免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1型蛋白的核质转位进行时间分析

摘要

ICP0 在 HSV-1 感染过程中会发生从细胞核到细胞质的转位。这一事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了使用共聚焦显微镜作为量化 HSV-1 感染中 ICP0 运动的工具，为今后在机制研究中对 ICP0 转位进行定量分析奠定了基础。

摘要

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染细胞蛋白0（ICP0）是一种含有RING型E3泛素连接酶的即刻早期蛋白。它介导宿主限制性因子的蛋白酶体降解，并促进后续病毒基因的激活。ICP0含有一个经典的核定位序列（NLS），在感染后立即进入细胞核 从头合成 合成，并主要在细胞核内执行其抗宿主防御功能。然而，在感染后期，ICP0 仅存在于细胞质中，表明在 HSV-1 感染过程中发生了从细胞核到细胞质的转位。推测 ICP0 的转位使其能够根据感染不同阶段的亚细胞定位来调节其功能。为了阐明 ICP0 核质转位的生物学功能及其调控机制，我们改进了一种免疫荧光显微镜方法，用于监测 HSV-1 感染过程中 ICP0 的转运。该方案包括免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像以及细胞核 与 细胞质分布分析。本实验方案旨在将时间序列中采集的稳态共聚焦图像转化为对裂解感染过程中 ICP0 运动的定量记录。我们提出，该方法可推广用于对细胞核的定量分析。 与 无需使用活体成像技术即可研究其他病毒或细胞蛋白的细胞质定位。

引言

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）可引起多种轻重不一的疱疹性疾病，包括唇疱疹、生殖器疱疹、间质性角膜炎和脑炎。感染后，病毒可在神经节神经元中建立终身潜伏感染。在发热、应激和免疫抑制等多种因素刺激下，病毒可偶尔被重新激活。¹，导致疱疹反复感染。感染细胞蛋白0（ICP0）是HSV-1裂解期和潜伏期感染的关键病毒调控因子，可转激活下游病毒基因。 通过 抵消宿主固有/先天抗病毒防御机制^2,3ICP0 具有 E3 泛素连接酶活性，可靶向多种细胞因子并介导其依赖蛋白酶体的降解³它还与多种细胞通路相互作用，调控其活性，从而抵消宿主的抗病毒限制作用。³随着感染的进行，ICP0 被发现定位于不同的亚细胞区域^3,4,5该蛋白在第500至506位氨基酸处含有一段富含赖氨酸/精氨酸的核定位信号（NLS）。⁶。当 从头合成 在HSV-1感染早期进行合成时，ICP0立即被导入细胞核，并首先定位于一种称为核结构域10（ND10）的动态核结构处。⁷ICP0 的 E3 泛素连接酶活性可触发 ND10 组织蛋白、早幼粒细胞白血病（PML）蛋白以及 100 kDa 斑点蛋白（Sp100）的降解^8,9,10组织蛋白丢失后，ND10核体解体，ICP0扩散至整个细胞核^4,11.

有趣的是，在病毒DNA复制开始后，ICP0从细胞核中消失，仅在细胞质中被检测到，提示在HSV-1感染的晚期发生了从细胞核到细胞质的转位。^4,12DNA复制的需求暗示了晚期病毒蛋白可能参与促进HSV-1 ICP0的胞质转位^4,12显然，ICP0在感染过程中于不同细胞区室间的转运使其能够以时空特异性的方式调节与多种细胞通路的相互作用，从而协调其多重功能，精细调控HSV-1裂解性感染与潜伏性感染之间的平衡。¹³为了更好地理解ICP0的多功能性及其在裂解感染过程中各功能结构域的协调作用，我们深入剖析了ICP0动态转位的分子基础¹²进行先前报道的机制研究¹²，我们采用免疫荧光染色方法，在共聚焦显微镜下观察不同感染状态下ICP0的亚细胞定位。同时，我们还建立了一种定量分析方案，用于分析细胞核内 与 使用共聚焦软件分析ICP0的胞质分布。在不同生化处理条件下，统计了HSV-1感染各阶段的感染细胞群体，并分析了ICP0定位变化的趋势。¹². 本文描述了一种详细方案，用于记录 HSV-1 感染过程中 ICP0 的转位。我们建议该方法可作为研究核内事件的通用方法 与 细胞质转位可用于其他病毒或细胞蛋白，当活体成像技术因标记方法、信号强度或蛋白丰度等问题而无法适用时，可作为活体成像的替代方法。

方案

1. 细胞接种与病毒感染

1. 在病毒感染前 20–24 小时，将 5 × 10⁴ 个人类胚胎肺（HEL）成纤维细胞或其他待检测细胞接种于含生长培养基（添加 10% 胎牛血清（FBS）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））的 4 孔 11 mm 错列载玻片中。在 37 °C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下培养细胞。
   注意：感染时每个孔的细胞融合度应达到 70–80%。
2. 次日，移除生长培养基，并用 Medium-199 培养基以每细胞 4–10 pfu 的感染复数（pfu/cell）感染细胞。将病毒感染的细胞在 37 °C 下孵育 1 小时。孵育期间持续轻轻摇动载玻片。
3. 孵育 1 小时后，移除 Medium-199 培养基，并补充生长培养基。
   注意：可在此步骤或病毒吸附前加入干扰不同感染阶段的药物。
4. 将病毒感染的细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育不同时间段。

2. 固定与通透处理

1. 在适当的感染时间，用磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤感染的细胞3次，并加入200 μL新配制的4%多聚甲醛PBS溶液。室温下孵育8–10分钟，以固定每个孔中的细胞。
2. 吸弃多聚甲醛，用 200 μL PBS 洗涤孔板 3 次。第三次洗涤后彻底吸弃 PBS^rd 洗涤。
3. 每孔加入 100 μL 0.2% 非离子型表面活性剂，孵育 5–10 分钟以通透细胞。
4. 吸出非离子型表面活性剂，用 200 μL PBS 洗涤孔板 3 次。

3. 免疫荧光染色

1. 彻底吸除 PBS，每孔加入 200 μL 封闭缓冲液（含 1% 牛血清白蛋白（BSA）和 5% 马血清的 PBS），室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。
2. 在封闭缓冲液中加入经实验确定浓度的一抗（兔抗 ICP0 多克隆抗体¹²），室温孵育 2 小时，或 4 °C 过夜。
3. 用封闭缓冲液洗涤 3 次，每次孵育 10 分钟。加入 Alexa 594 标记的山羊抗兔二抗（按 1:400 稀释于封闭缓冲液中），室温孵育 1 小时。随后用封闭缓冲液洗涤切片 3 次，每次间隔 10 分钟。
4. 最后用 PBS 洗涤切片一次，以去除残留的 BSA 和马血清。
5. 加入一滴含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，并用透明指甲油封固。

4. 共聚焦成像

1. 使用共聚焦显微镜时，将Alexa 594的波长设置为590–650 nm，DAPI的波长设置为410–520 nm。选择1024 × 1024的图像格式和8次线平均，以获取高分辨率图像。
2. 在共聚焦显微镜下分析4孔载玻片上每个孔的样本。使用100倍物镜获取代表性细胞图像，如图 1和图 2所示。
3. 若需计数大量细胞，可在40倍物镜下连续拍摄多个视野的图像。
   注意：每个感染时间点的每个感染样本需拍摄5–10张图像，以累计获得超过200个感染细胞。
4. 在每次实验中，所有需要比较的样本应使用相同的共聚焦参数进行拍照。

5. 细胞核分析 与 细胞质分布

1. 使用共聚焦显微镜应用软件打开项目。从图像中选择需要进行细胞核计数的细胞区域 与 ICP0的胞质分布
2. 点击标签页 "数量" 从顶部菜单中选择 "排序感兴趣区域" 从工具菜单中。
3. 沿待分析细胞的长轴画一条线 "画线" 从顶部菜单。
   注意：直方图将显示沿该线的ICP0和DAPI荧光强度。在直方图中，蓝线代表DAPI像素，标记细胞核边界，而红线代表ICP0像素。
4. 根据背景染色，为每次实验中ICP0强度设定恒定阈值，以分析ICP0的亚细胞分布。
   1. 如示例所示 图2如果红色信号在核区域内的平均值低于阈值，但在蓝色边界之外高于阈值，则将红色信号归类为主要位于细胞质中。
   2. 如果红色信号在整个细胞核内均高于阈值，并延伸至蓝色信号边界之外，则将红色信号归类为细胞核与细胞质共定位。
   3. 如果红色信号在细胞核内的强度高于阈值，但在蓝色信号边界外的平均强度低于阈值，则将红色信号归类为核定位。
5. 对每个样本在不同感染时间点统计超过200个感染细胞，并以柱状图展示ICP0随时间变化的定位情况图3).

结果

为了理解HSV-1感染过程中ICP0转运的分子基础及其生物学功能，我们采用免疫荧光显微镜方法分析ICP0在不同感染阶段的亚细胞分布。图1展示了随着感染进程表现出不同ICP0定位的代表性细胞。为了定量分析ICP0从细胞核到细胞质的转位情况，我们通过将感染细胞分为三类——核定位、胞质定位以及核与胞质共定位——来分析ICP0相对于细胞核的分布（图2）。为了明确感染过程中ICP0转运所需的元件，我们在野生型或突变型HSV-1感染的不同阶段追踪ICP0的移动情况。图3展示了一个在感染不同时间点ICP0亚细胞分布统计结果的示例。

讨论

本方案已用于研究HSV-1 ICP0从细胞核向细胞质的转位过程。在HSV-1感染期间，ICP0会发生亚细胞定位的动态变化（图1）。ICP0可能通过与多种细胞通路相互作用，在不同亚细胞位置执行不同的功能，从而在与人类宿主的相互博弈中精细调控其多种功能¹³。然而，ICP0如何以时空特异性的方式协调其多种功能，目前尚缺乏深入研究。利用上述荧光显微镜检测方案，我们开始解析ICP0从细胞核向细胞质转位的分子机制。目前，我们已鉴定出ICP0羧基末端的35个氨基酸是该转位过程所必需的关键元件。在缺失C末端的情况下，ICP0在整个感染过程中被限制在细胞核内（图3）。我们还发现，在U2OS细胞中，依赖于ICP0 E3泛素连接酶活性的细胞核滞留力会延迟其向细胞质的转位¹²。此外，我们发现ICP0的C末端与晚期病毒蛋白的表达协同作用，可克服细胞核滞留效应，促进其向细胞质的转位¹²。目前，我们正利用该...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>细胞与病毒
人胚胎肺成纤维细胞（HEL细胞）	托马斯·E·申克博士（普林斯顿大学）		HEL细胞在添加了10% FBS的DMEM培养基中培养
HSV-1 病毒储备液（F株）	Dr. Bernard Roizman 实验室
<强>培养基
杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基	Invitrogen	11965-092
胎牛血清（FBS）	Sigma	F0926-500ml
Medium-199（10倍浓缩）	Gibco	11825-015
<强>试剂
4孔11毫米错列载玻片	Cel-Line/赛默飞世尔科技	30-149H-黑色
16% 多聚甲醛溶液（w/v），无甲醇	赛默飞世尔科技	28908
Triton X-100	Fisher试剂	BP151-1C0
牛血清白蛋白（BSA）	Calbiochem	CAS 9048-46-8
马血清	Sigma	H1270
磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，pH 7.4）	郭海东博士实验室
NaCl	Fisher Bioreagent	BP358-212
KH2PO4	Fisher Bioreagent	BP362-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
Na2HPO4	Fisher Bioreagent	BP332-500
封闭缓冲液（PBS 加 1% BSA 和 5% 马血清）	郭海东博士实验室
兔抗ICP0抗体	郭海东博士实验室
PML（PG-M3）-小鼠单克隆IgG	Santa Cruz Biotechnology	SC-966
Alexa Fluor 594-山羊抗兔IgG	invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488-山羊抗小鼠IgG	invitrogen	A11001
含DAPI的Vectashield封片剂	Vector Laboratories	H-1200
巴斯德吸管	Fisher Brand	13-678-20D
指甲油	Sally Hansen
<强>仪器设备
共聚焦显微镜	Leica SP8
共聚焦软件	Leica LAS X 应用套件
Excel 软件	Microsoft Excel
HERAcell 150i CO₂ 培养箱2 培养箱	赛默飞世尔科技	货号 51026282