ICP0 在 HSV-1 感染过程中会发生从细胞核到细胞质的转位。这一事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了使用共聚焦显微镜作为量化 HSV-1 感染中 ICP0 运动的工具，为今后在机制研究中对 ICP0 转位进行定量分析奠定了基础。
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本文内容
摘要
摘要
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染细胞蛋白0（ICP0）是一种含有RING型E3泛素连接酶的即刻早期蛋白。它介导宿主限制性因子的蛋白酶体降解，并促进后续病毒基因的激活。ICP0含有一个经典的核定位序列（NLS），在感染后立即进入细胞核 从头合成 合成，并主要在细胞核内执行其抗宿主防御功能。然而，在感染后期，ICP0 仅存在于细胞质中，表明在 HSV-1 感染过程中发生了从细胞核到细胞质的转位。推测 ICP0 的转位使其能够根据感染不同阶段的亚细胞定位来调节其功能。为了阐明 ICP0 核质转位的生物学功能及其调控机制，我们改进了一种免疫荧光显微镜方法，用于监测 HSV-1 感染过程中 ICP0 的转运。该方案包括免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像以及细胞核 与 细胞质分布分析。本实验方案旨在将时间序列中采集的稳态共聚焦图像转化为对裂解感染过程中 ICP0 运动的定量记录。我们提出，该方法可推广用于对细胞核的定量分析。 与 无需使用活体成像技术即可研究其他病毒或细胞蛋白的细胞质定位。
引言
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）可引起多种轻重不一的疱疹性疾病，包括唇疱疹、生殖器疱疹、间质性角膜炎和脑炎。感染后，病毒可在神经节神经元中建立终身潜伏感染。在发热、应激和免疫抑制等多种因素刺激下，病毒可偶尔被重新激活。1，导致疱疹反复感染。感染细胞蛋白0（ICP0）是HSV-1裂解期和潜伏期感染的关键病毒调控因子，可转激活下游病毒基因。 通过 抵消宿主固有/先天抗病毒防御机制2,3ICP0 具有 E3 泛素连接酶活性，可靶向多种细胞因子并介导其依赖蛋白酶体的降解3它还与多种细胞通路相互作用，调控其活性，从而抵消宿主的抗病毒限制作用。3随着感染的进行，ICP0 被发现定位于不同的亚细胞区域3,4,5该蛋白在第500至506位氨基酸处含有一段富含赖氨酸/精氨酸的核定位信号（NLS）。6。当 从头合成 在HSV-1感染早期进行合成时，ICP0立即被导入细胞核，并首先定位于一种称为核结构域10（ND10）的动态核结构....
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方案
1. 细胞接种与病毒感染
- 在病毒感染前 20–24 小时，将 5 × 104 个人类胚胎肺（HEL）成纤维细胞或其他待检测细胞接种于含生长培养基（添加 10% 胎牛血清（FBS）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））的 4 孔 11 mm 错列载玻片中。在 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）条件下培养细胞。
注意：感染时每个孔的细胞融合度应达到 70–80%。 - 次日，移除生长培养基，并用 Medium-199 培养基以每细胞 4–10 pfu 的感染复数（pfu/cell）感染细胞。将病毒感染的细胞在 37 °C 下孵育 1 小时。孵育期间持续轻轻摇动载玻片。
- 孵育 1 小时后，移除 Medium-199 培养基，并补充生长培养基。
注意：可在此步骤或病毒吸附前加入干扰不同感染阶段的药物。 - 将病毒感染的细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育不同时间段。
2. 固定与通透处理
- 在适当的感染时间，用磷酸盐缓冲液（PBS）快速洗涤感染的细胞3次，并加入200 μL新配制的4%多聚甲醛PBS溶液。室温下孵育8–10分钟，以固定每个孔中的细胞。
- 吸弃多聚甲醛，用 200 μL PBS 洗涤孔板 3 次。第三次洗涤后彻底吸弃 ....
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结果
为了理解HSV-1感染过程中ICP0转运的分子基础和生物学功能，我们采用免疫荧光显微镜方法分析ICP0在不同感染阶段的亚细胞分布。图1展示了随着感染进展，ICP0定位特征明显的代表性细胞。为了定量分析ICP0从细胞核到细胞质的转位，我们通过将感染细胞分为三类——核定位、胞质定位以及核加胞质共定位——来评估ICP0相对于细胞核的分布情况（图2）。为了明确感染过程中ICP0转运所需的元件，我们在野生型或突变型HSV-1感染的不同阶段追踪ICP0的移动。图3展示了在感染不同时间点ICP0亚细胞分布结果的一个示例性数据汇总表。
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讨论
本方案已用于研究HSV-1 ICP0从细胞核向细胞质的转位过程。在HSV-1感染期间，ICP0会发生亚细胞定位的动态变化（图1）。ICP0可能通过与多种细胞通路相互作用，在不同亚细胞位置执行不同的功能，从而在与人类宿主的相互博弈中精细调控其多种功能13。然而，ICP0如何以时空特异性的方式协调其多种功能，目前尚缺乏深入研究。利用上述荧光显微镜检测方案，我们开始解析ICP0从细胞核向细胞质转位的分子机制。目前，我们已鉴定出ICP0羧基末端的35个氨基酸是该转位过程所必需的关键元件。在缺失C末端的情况下，ICP0在整个感染过程中被限制在细胞核内（图3）。我们还发现，在U2OS细胞中，依赖于ICP0 E3泛素连接酶活性的细胞核滞留力会延迟其向细胞质的转位12。此外，我们发现ICP0的C末端与晚期病毒蛋白的表达协同作用，可克服细胞核滞留效应，促进其向细胞质的转位12。目前，我们正利用该.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）基金（RO1AI118992）对Haidong Gu的资助。我们感谢显微成像中心 & 韦恩州立大学显微镜与细胞计量资源（MICR）核心设施提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞与病毒 | |||
| 人胚胎肺成纤维细胞（HEL细胞） | 托马斯·E·申克博士（普林斯顿大学） | HEL细胞在添加了10% FBS的DMEM培养基中培养 | |
| HSV-1 病毒储备液（F株） | Dr. Bernard Roizman 实验室 | ||
| <强>培养基 | |||
| 杜尔贝科’s 改良的 Eagle’DMEM培养基 | Invitrogen | 11965-092 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199（10倍浓缩） | Gibco | 11825-015 | |
| <强>试剂 | |||
| 4孔11毫米错列载玻片 | Cel-Line/赛默飞世尔科技 | 30-149H-黑色 | |
| 16% 多聚甲醛溶液（w/v），无甲醇 | 赛默飞世尔科技 | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher试剂 | BP151-1C0 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| 马血清 | Sigma | H1270 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，pH 7.4） | 郭海东博士实验室 | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| 封闭缓冲液（PBS 加 1% BSA 和 5% 马血清） | 郭海东博士实验室 | ||
| 兔抗ICP0抗体 | 郭海东博士实验室 | ||
| PML（PG-M3）-小鼠单克隆IgG | Santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-山羊抗兔IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-山羊抗小鼠IgG | invitrogen | A11001 | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| 巴斯德吸管 | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| 指甲油 | Sally Hansen | ||
| <强>仪器设备 | |||
| 共聚焦显微镜 | Leica SP8 | ||
| 共聚焦软件 | Leica LAS X 应用套件 | ||
| Excel 软件 | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO₂ 培养箱2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 货号 51026282 |
参考文献
- Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Li....
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重印与许可
