免疫荧光共聚焦显微镜对单纯疱疹病毒1蛋白核细胞质转移的时间分析

Summary

icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间经历核细胞质转移。这个事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了共聚焦显微镜作为量化1型单纯疱疹病毒感染 icp0 运动的工具, 为定量分析 icp0 在未来的机械研究中的移位奠定了基础。

Abstract

单纯疱疹病毒 1 (hsv-1) 的感染细胞蛋白 0 (icp0) 是一种直接的早期蛋白, 含有 rg-3 泛素连接酶。它负责宿主限制性因子的蛋白酶体降解和随后的病毒基因激活。icp0 包含一个规范的核本地化序列 (nls)。它在新合成后立即进入原子核, 并主要在原子核中执行其抗主机防御功能。然而, 在感染后期, icp0 仅在细胞质中发现, 这表明在1型单纯疱疹病毒感染期间发生了核细胞质间的移位。据推测, icp0 的移位使 icp0 能够根据其在不同感染阶段的亚细胞位置调节其功能。为了描述 icp0 核细胞质迁移的生物学功能和调控机制, 我们改进了免疫荧光显微镜法, 以监测 icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间的贩运情况。该协议包括免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像和核与细胞质分布分析。该协议的目标是将在时间过程中拍摄的稳态共聚焦图像调整为整个裂解感染过程中 icp0 运动的定量文档。我们提出, 该方法可以推广到定量分析核与细胞质定位的其他病毒或细胞蛋白, 而不涉及实时成像技术。

Introduction

单纯疱疹病毒 1 (hsv-1) 可引起多种轻度至重度疱疹疾病, 包括唇部疱疹、生殖器疱疹、间质角膜炎和脑炎。一旦感染, 该病毒建立在神经节神经元的终身潜伏性感染。有时, 病毒可以通过各种原因重新激活, 如发烧、压力和免疫抑制¹, 导致复发性疱疹感染。感染细胞蛋白 0 (icp0) 是对裂解和潜伏性1型单纯疱疹病毒感染至关重要的关键病毒调节剂。它通过抵消宿主固有的抗病毒防御 2^,3,^使下游病毒基因转化^.icp0 具有 e3 泛素连接酶活性, 针对几个细胞因子进行蛋白酶依赖性降解³。它还与各种细胞通路相互作用, 以调节其活动, 并随后抵消宿主抗病毒限制³。据悉, icp0 位于不同的亚细胞隔间, 因为感染^{进行 3,4,5}。该蛋白质具有富含赖氨酸的核定位信号 (nls), 位于500至 506^-6 残留物处。在早期 hsv-1 感染的早期重新合成后, icp0 立即被输入细胞核。它首先被探测到在一个称为核域 1....

Protocol

1. 细胞播种和病毒感染

1. 在病毒感染前 20-24小时, 种子 5 x 10 4 人类胚胎肺成纤维细胞或其他细胞将在生长介质中的4井11毫米交错滑块上进行检查 (dulbecco 的改性鹰介质 (dmem) 补充10% 的胎儿牛血清 (fbs))。用5% 的二氧化碳 (_co2) 在37°c 下培养细胞。
   注: 每口井在感染时应该有70-80% 的细胞融合。
2. 第二天, 去除生长培养基, 并在 4-10 pfu 细胞的范围内用中199中的病毒感染细胞。在37°c 下培养感染病毒的细胞1小时。在潜伏期继续晃动滑梯。
3. 1小时孵育后, 去除中 199, 补充生长培养基。
   注: 干扰不同感染阶段的药物可以在此步骤或病毒吸收之前添加。
4. 在37°c 下用 5% co2 对感染病毒的细胞进行不同长度的感染期的培养。

2. 固定和渗透

1. 在适当的感染时间, 用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 快速清洗感染细胞 3次, 并添加200μl 的4% 对苯二甲醛在 pbs 中新鲜制备。在室温下将细胞用甲醛培养 8-10分钟, 以固定每口井中的细胞。
2. 吸入甲醛, 用200μl 的 pbs 清洗井3次。^第三次清洗后完全吸气 pbs。
3. 在每口井中加入 100μl 0.2....

Results

为了了解1型单纯疱疹病毒感染期间 icp0 贩运的分子基础和生物学功能, 我们采用免疫荧光显微镜法分析 icp0 在不同感染阶段的亚细胞分布。图 1显示了随着感染的进展而具有独特 icp0 定位的代表性细胞。为了量化 icp0 的核细胞质转移, 我们通过将受感染细胞分为三类来分析 icp0 相对于细胞核的分布: 核定位、细胞质定位和核加细胞质定位 (图 2)。为了了解 icp0 在感染过程中贩运所需的要素, 我们跟踪 icp0 在不同感染阶段的野生类型或突变体 hsv-1 的运动情况。图 3显示了 icp0 在不同感染时间点的亚细胞分布的列表结果示例。

Discussion

该协议已被用于研究1型 hsv-1 icp0 的核细胞质迁移。icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间遭到亚细胞贩运 (图 1)。很可能, icp0 与各种细胞通路相互作用, 在不同的位置执行不同的功能。这使得 icp0 能够在与人类主机¹³的拔河比赛中微调其多重功能。然而, icp0 如何以时空的方式协调多个函数还没有得到很好的研究。利用上述荧光显微镜协议, 我们开始分析 icp0 核细胞质转移的分子基础。到目前为止, 我们已经确定 icp0 c-端35氨基酸是这种易位的重要元素。在没有 c-终点的情况下, icp0 在整个感染过程中被限制在细胞核内 (图 3)。我们还发现, icp0 e3 配体依赖性核力量延迟了 u2os 细胞12的核细胞质转移.此外, 我们还发现 icp0 c-末端和晚期病毒蛋白的表达相互合作, 以克服核保留, 促进细胞质移位¹²。目前, 我们正在使用该协议.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>细胞和病毒
人胚胎肺成纤维细胞（HEL 细胞）	Thomas E. Shenk 博士（普林斯顿大学）		HEL 细胞在补充有 10% FBS
HSV-1 病毒储液（菌株 F）	Bernard Roizman 博士实验室
Medium
杜尔贝科s 修改后的鹰's 培养基 （DMEM）	Invitrogen	11965-092
胎牛血清 （FBS）	Sigma	F0926-500ml
培养基-199 （10x）	Gibco	11825-015
试剂
4 孔 11 mm 交错载玻片	Cel-Line/Thermofisher Scientific	30-149H-BLACK
16% 多聚甲醛溶液（w/v） 不含甲醇	Thermo Scientific	28908
Triton X-100	Fisher 试剂	BP151-1C0
牛血清 Abumin （BSA）	钙生化学	CAS 9048-46-8
马血清	Sigma	H1270
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4，pH7.4）	顾海东博士实验室
NaCl	Fisher Bioreagent	BP358-212
KH2PO4	Fisher 生物试剂	BP362-500
KCl	费舍尔科技	BP366-500
Na2HPO4	Fisher Bioreagent	BP332-500
封闭缓冲液（含 1% BSA 和 5% 马血清的 PBS）	. Haidong Gu lab
Rabiit Anti-ICP0 anti-ICP	Dr. Haidong Gu lab
PML （PG-M3）-小鼠单克隆 IgG	santa Cruz Biotechnology	SC-966
Alexa Fluor 594-山羊抗兔 IgG	invitrogen	A11012
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG	invitrogen	A11001
Vectashield Mouting 培养基，含 DAPI	矢量实验室	H-1200
巴斯德移液器	Fisher Brand	13-678-20D
指甲油	Sally Hansen
设备
共聚焦显微镜	Leica SP8
共聚焦软件	Leica LAS X 应用程序套件
Excel 软件	Microsoft Excel
HERAcell 150i CO2 培养箱	Thermo Scientific	订购代码 51026282