可视化鸡胚视顶盖发育过程中的切向细胞迁移

摘要

我们介绍了通过电穿孔对切向迁移细胞进行荧光标记的方法，以及在平铺培养物中对标记细胞的运动进行延时成像的方法，以可视化观察发育中鸡胚视顶盖中迁移细胞的行为。

摘要

延时成像是一种用于分析迁移细胞行为的有力方法。在对细胞进行荧光标记后，可通过视频显微镜记录培养物中标记细胞的运动过程。为了研究发育中大脑的细胞迁移，通常采用脑片培养法来观察与切片平面平行的细胞迁移，例如放射状细胞迁移。然而，使用脑片培养方法难以获取与切片平面垂直方向上的细胞迁移信息，例如切向细胞迁移。本文介绍了用于可视化鸡胚视顶盖发育过程中切向细胞迁移的延时成像实验方案。在卵内通过电穿孔实现细胞标记，随后将组织置于细胞培养插件上进行平铺培养，从而能够在水平面上检测迁移细胞的运动。此外，该方法有利于长期观察单个细胞的行为以及细胞群体的协同活动。该技术还可有望用于检测荧光标记的微细结构的动态变化过程，包括神经组织中的轴突延伸或非神经组织中的细胞位移。

引言

随着活体成像技术的进步，细胞迁移的研究也在不断发展。在对细胞进行荧光标记后，可通过视频显微镜记录培养皿中或体内标记细胞随时间推移的运动过程。在神经发育研究中，已利用延时成像技术分析迁移细胞或伸长轴突的形态变化。为了实现有效的成像，必须根据实验和分析目的，选择合适的荧光细胞标记方法和组织制备技术。在研究发育中大脑的细胞迁移时，通常采用脑片培养方法来观察与切片平面平行的细胞迁移过程，例如放射状细胞迁移^1,2,3。脑片培养系统也可用于检测切向细胞迁移^4,5，但在细胞沿垂直于切片平面方向弥散的情况下，该方法不适用于迁移方向的分析。

视顶盖由多层结构组成，这种结构是在胚胎发育过程中通过细胞的放射状和切向迁移形成的。顶盖分层主要依赖于室带中后有丝分裂的神经前体细胞进行放射状迁移，这些细胞在各层中的最终位置与其在室带中的出生时间相关⁶。至于切向迁移，我们先前报道过在发育中的鸡视顶盖中层和浅层存在两条迁移路径。在胚胎第6至8天（E6-E8）的中层，具有长的前导突起和细的尾随突起的双极细胞，沿着视顶盖传出轴突的背腹向轴突束进行背....

方案

1. 电穿孔 在卵内

1. 准备用于荧光标记的高浓度表达质粒DNA。根据制造商的说明（材料表），使用阴离子交换柱通过碱裂解法从200 mL细菌培养物中分离DNA。将pCAGGS-EGFP和pCAGGS-mCherryNuc混合，每种质粒的终浓度为4 µg/µL。
   注意：电穿孔实验建议使用无内毒素的质粒DNA纯化方法。
2. 将受精鸡卵水平放置，在38 °C、70%相对湿度条件下孵育。
3. 孵育2.5天后，使用20 mL注射器配合18号针头，从鸡蛋尖端一侧抽出5 mL蛋清，并用胶带密封针孔。
4. 使用弯头剪刀剪开蛋壳顶部，形成一个直径约2 cm的开口，在体视显微镜下检查胚胎发育阶段（Hamburger和Hamilton分期第17期⁹），然后再次用胶带封闭开口。
   注意：此步骤可在E2.5至E3.0期间任意时间进行。步骤1.3和1.4可降低胚胎在蛋内的位置，避免发育中的胚胎及其血管与蛋壳顶部紧密粘连。
5. 继续孵育至E5.5阶段。
6. 电穿孔前，准备10 µL上述质粒DNA，加入0.5 µL快绿染料（25 mg/mL），另准备含青霉素（100单位/mL）和链霉素（100 μg/mL）的10 mL高压灭菌磷酸盐缓冲液（PBS），以及使用微量移液器拉制仪制备的玻璃毛细管移液尖。根据注射DNA量的多少，剪切微量移液尖的远端....

结果

图2 显示了在记录开始后不同经过时间（0、9、18、27 小时）的平铺培养中可视化观察到的浅层切向迁移。视频 1 是一段为期 28 小时 50 分钟、每 10 分钟拍摄一帧的延时视频。该视频帧的选择聚焦于从标记的左下角区域向未标记区域迁移的细胞（图3A）。迁移细胞（GFP；左上面板，视频 1）及其细胞核（mCherry-Nuc；右上面板）的大规模运动可在合并视频中观察到（下部面板，视频 1）。通过关注从标记中心向各个方向扩散的细胞，可分析细胞迁移的方向性（视频 2，图3B）。

讨论

上述方案经过优化，适用于检测表层细胞的迁移^6,8。通过调整电穿孔的时间（从E5.5提前至E4.5）以及培养和成像的起始时间（从E7.0提前至E6.0），该方案同样适用于检测中层细胞的迁移流（视频 5）^6,7。

所展示的实验步骤包括通过电穿孔对细胞进行标记 在卵内，平铺培养和共聚焦显微镜延时成像（图1首先，必须优化培养条件，以保持组织健康并正常生长 体内确保组织的方向适合检测细胞迁移也至关重要。为此，我们采用细胞小室上的平铺培养法，这有助于观察细胞的水平扩散，同时提供富含氧气的培养基。在确定培养条件和组织方向后，为了实现良好成像，关键在于调节荧光标记效果与尽可能减少电子损伤和光损伤之间的矛盾.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	无内毒素质粒DNA纯化试剂盒
20 ml 注射器	TERUMO	SS-20ESZ
18号针头	TERUMO	NN-1838R
快绿染料（Fast Green）	Wako	061-00031
100倍青霉素-链霉素溶液	Gibco	15140-122
玻璃毛细管	Narishige	G-1
细胞培养小室	Millipore	Millicell CM-ORG
层粘连蛋白（Laminin）	SIGMA	L2020	用于培养小室的包被
聚-L-赖氨酸（poly-L-Lysine）	Peptide Institute	3075	用于培养小室的包被
玻璃底培养皿	Matsunami	D11130H
Opti-MEM培养基	Gibco	31985-070	培养液
F12培养基	Gibco	11765-054	培养液
胎牛血清	Gibco	12483	培养液
鸡血清	Gibco	16110082	培养液
10倍HBSS溶液	Gibco	14065-056
显微外科手术刀	Surgical specialties cooperation	72-1501
名称	公司	目录编号	备注
设备
弯头剪刀	AS ONE	No.11
微量移液器拉制仪	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
镊子型电极	BEX	LF646P3x3
脉冲发生器	BEX	CUY21EX	电穿孔仪
荧光体视显微镜	Leica	MZ16F
倒置荧光显微镜	Olympus	IX81
气体控制器	Tokken	MIGM/OL-2
温度控制器	Tokai Hit	MI-IBC
激光共聚焦单元	Olympus	FV300