我们介绍了通过电穿孔对切向迁移细胞进行荧光标记的方法，以及在平铺培养物中对标记细胞的运动进行延时成像的方法，以可视化观察发育中鸡胚视顶盖中迁移细胞的行为。
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本文内容
摘要
摘要
延时成像是一种用于分析迁移细胞行为的有力方法。在对细胞进行荧光标记后，可通过视频显微镜记录培养物中标记细胞的运动过程。为了研究发育中大脑的细胞迁移，通常采用脑片培养法来观察与切片平面平行的细胞迁移，例如放射状细胞迁移。然而，使用脑片培养方法难以获取与切片平面垂直方向上的细胞迁移信息，例如切向细胞迁移。本文介绍了用于可视化鸡胚视顶盖发育过程中切向细胞迁移的延时成像实验方案。在卵内通过电穿孔实现细胞标记，随后将组织置于细胞培养插件上进行平铺培养，从而能够在水平面上检测迁移细胞的运动。此外，该方法有利于长期观察单个细胞的行为以及细胞群体的协同活动。该技术还可有望用于检测荧光标记的微细结构的动态变化过程，包括神经组织中的轴突延伸或非神经组织中的细胞位移。
引言
随着活体成像技术的进步，细胞迁移的研究也在不断发展。在对细胞进行荧光标记后，可通过视频显微镜记录培养皿中或体内标记细胞随时间推移的运动过程。在神经发育研究中，已利用延时成像技术分析迁移细胞或伸长轴突的形态变化。为了实现有效的成像，必须根据实验和分析目的，选择合适的荧光细胞标记方法和组织制备技术。在研究发育中大脑的细胞迁移时，通常采用脑片培养方法来观察与切片平面平行的细胞迁移过程，例如放射状细胞迁移1,2,3。脑片培养系统也可用于检测切向细胞迁移4,5，但在细胞沿垂直于切片平面方向弥散的情况下，该方法不适用于迁移方向的分析。
视顶盖由多层结构组成，这种结构是在胚胎发育过程中通过细胞的放射状和切向迁移形成的。顶盖分层主要依赖于室带中后有丝分裂的神经前体细胞进行放射状迁移，这些细胞在各层中的最终位置与其在室带中的出生时间相关6。至于切向迁移，我们先前报道过在发育中的鸡视顶盖中层和浅层存在两条迁移路径。在胚胎第6至8天（E6-E8）的中层，具有长的前导突起和细的尾随突起的双极细胞，沿着视顶盖传出轴突的背腹向轴突束进行背侧或腹侧迁移7。在完成这种嗜轴突迁移后，这些细胞分化为位于深层的多极神经元。在胚胎第7至14天（E7-E14）的浅层，迁移细胞通过重构分支状的前导突起在水平方向上分散，并向多个方向散开8。在完成分散迁移后，这些细胞最终分化为具有多种形态的浅层神经元。在这两种情况下，平铺培养法均能有效观察细胞沿软脑膜表面平行方向的移动。
本文介绍了一种用于延时成像的实验方案，以观察发育中鸡胚视顶盖的切向细胞迁移7,8电穿孔法联合细胞标记 在卵内随后在细胞培养插件上进行扁平培养，可检测细胞的迁移运动及迁移方向。该方法旨在促进对单个细胞长期行为以及细胞群体在水平面上集体行为的检测。
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方案
1. 电穿孔 在卵内
- 准备用于荧光标记的高浓度表达质粒DNA。根据制造商的说明（材料表），使用阴离子交换柱通过碱裂解法从200 mL细菌培养物中分离DNA。将pCAGGS-EGFP和pCAGGS-mCherryNuc混合，每种质粒的终浓度为4 µg/µL。
注意：电穿孔实验建议使用无内毒素的质粒DNA纯化方法。 - 将受精鸡卵水平放置，在38 °C、70%相对湿度条件下孵育。
- 孵育2.5天后，使用20 mL注射器配合18号针头，从鸡蛋尖端一侧抽出5 mL蛋清，并用胶带密封针孔。
- 使用弯头剪刀剪开蛋壳顶部，形成一个直径约2 cm的开口，在体视显微镜下检查胚胎发育阶段（Hamburger和Hamilton分期第17期9），然后再次用胶带封闭开口。
注意：此步骤可在E2.5至E3.0期间任意时间进行。步骤1.3和1.4可降低胚胎在蛋内的位置，避免发育中的胚胎及其血管与蛋壳顶部紧密粘连。 - 继续孵育至E5.5阶段。
- 电穿孔前，准备10 µL上述质粒DNA，加入0.5 µL快绿染料（25 mg/mL），另准备含青霉素（100单位/mL）和链霉素（100 μg/mL）的10 mL高压灭菌磷酸盐缓冲液（PBS），以及使用微量移液器拉制仪制备的玻璃毛细管移液尖。根据注射DNA量的多少，剪切微量移液尖的远端，以获得合适大小的孔径。
- 用剪刀剪开已封口的蛋壳顶部，重新打开一个直径约2.5 cm的开口，将鸡蛋稳定置于体视显微镜下。向蛋内滴加数滴PBS。使用两把精细镊子无出血地剥离覆盖在胚胎表面的尿囊膜，并去除胚胎头部的羊膜。
- 用微型刮铲轻轻转动胚胎头部，同时通过连接吸管的微量移液器将0.1–1 μL染色DNA注入左侧视顶盖的脑室腔内。
注意：注射DNA的量取决于实验目的。浓缩的DNA溶液应下沉并附着于脑室壁上。 - 放置一对镊子型电极（电极面积为3 mm²，间距7 mm），使目标视顶盖区域位于两电极之间（图1，步骤1）。
注意：DNA将被电穿孔至阳极侧。 - 使用脉冲发生器施加预脉冲（30 V，1 ms，间隔5 ms），随后施加4次主脉冲（6 V，5 ms，间隔10 ms）。
注意：电脉冲参数取决于电极的尺寸与间距。脉冲强度应足以实现高效转染，但又需足够温和以保证靶组织的正常发育。 - 用胶带封闭开口，继续孵育。将电极浸泡于PBS中，并在塑料培养皿中使用牙缝刷清除残留蛋清。对每个鸡蛋重复步骤1.7至1.11。
2. 细胞插入式培养皿上的扁平培养
- 在进行平铺培养的前一天，准备包被的细胞培养小室。将若干细胞培养小室漂浮于10 cm细胞培养皿中的灭菌蒸馏水上。加入含8 µg/mL 层粘连蛋白（laminin）和80 µg/mL 多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）的溶液，完全覆盖小室，并将漂浮的小室置于37 °C、含CO2的细胞培养孵箱中过夜。
注意：次日，包被后的小室可于4 °C保存。 - 在E7.0胚胎培养当天，从培养小室中移除层粘连蛋白-多聚-L-赖氨酸溶液，并将小室转移至玻璃底培养皿中（图1，步骤2），加入1.1 mL培养基（60%低血清培养基，20% F12，10%胎牛血清，10%鸡血清，50 单位/mL青霉素，50 μg/mL链霉素）。将培养皿置于37 °C、含CO2的细胞培养孵箱中。
注意：该培养基可在三天培养期间持续使用，无需更换。 - 准备培养装置。将加湿培养室安装在倒置共聚焦显微镜上，调节气体控制器使气体环境为40% O2 和5% CO2，温度控制器设定为38 °C。
- 用剪刀剪下胚胎头部，用镊子夹取头部组织，放入盛有冰浴Hanks'平衡盐溶液（HBSS）的6 cm细胞培养皿中。
- 使用两把精细镊子分离电穿孔后的视顶盖（optic tectum）。用塑料移液器将顶盖组织转移至另一盛有冰浴HBSS的培养皿中。使用底部为黑色硅胶的凹形玻璃皿作为切割托盘。
- 在荧光体视显微镜下观察标记位置，使用显微手术刀切除标记区域周围的顶盖组织。确保组织在顶盖中的方向（前-后，背-腹）正确。
- 用塑料移液器将标记的组织转移至培养小室中，使软脑膜（pia）面贴附于小室表面。将顶盖组织按所需方向摆放，并吸除多余的HBSS（图1，步骤2）。
- 重复步骤2.4–2.7，以在同一小室上准备其他组织样本。将培养皿置于倒置共聚焦显微镜的预热培养室中（图1，步骤3）。
3. 时间序列成像
- 在倒置共聚焦显微镜下检查荧光标记，并调节显微视野。启动激光共聚焦单元，进行共聚焦扫描采样，以调整视野中组织在X轴和Y轴方向上的位置和方向。使用10X或20X物镜，无需浸油。
- 选择扫描尺寸（例如， 512x512 dpi）。确定共聚焦扫描在z轴方向上的步进间隔和总扫描范围，对于100 µm的范围，可选择5或10 µm的步进间隔。设定共聚焦成像的时间间隔及总成像持续时间（例如， 48 小时内每 10 分钟间隔
注意：为避免激光光毒性，在长z轴范围内进行短z间隔的高扫描尺寸成像，或在长时间成像过程中采用短时间间隔扫描时，应禁止此类扫描方式。例如，使用高扫描尺寸（例如， 1024x1024 dpi），请减少沿 z 轴的扫描次数。 - 设置3.2节中所述共聚焦成像程序的参数，并开始采集图像。
- 成像后，将不同z轴位置的共聚焦图像进行合并，以获得每个时间点z轴堆叠图像，并实现精细的焦距调整。
- 将不同时间点的z轴层扫图像进行拼接，并以AVI格式构建延时电影。
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结果
图2 显示了在记录开始后不同经过时间（0、9、18、27 小时）的平铺培养中可视化观察到的浅层切向迁移。视频 1 是一段为期 28 小时 50 分钟、每 10 分钟拍摄一帧的延时视频。该视频帧的选择聚焦于从标记的左下角区域向未标记区域迁移的细胞（图3A）。迁移细胞（GFP；左上面板，视频 1）及其细胞核（mCherry-Nuc；右上面板）的大规模运动可在合并视频中观察到（下部面板，视频 1）。通过关注从标记中心向各个方向扩散的细胞，可分析细胞迁移的方向性（视频 2，图3B）。
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讨论
上述方案经过优化，适用于检测表层细胞的迁移6,8。通过调整电穿孔的时间（从E5.5提前至E4.5）以及培养和成像的起始时间（从E7.0提前至E6.0），该方案同样适用于检测中层细胞的迁移流（视频 5）6,7。
所展示的实验步骤包括通过电穿孔对细胞进行标记 在卵内，平铺培养和共聚焦显微镜延时成像（图1首先，必须优化培养条件，以保持组织健康并正常生长 体内确保组织的方向适合检测细胞迁移也至关重要。为此，我们采用细胞小室上的平铺培养法，这有助于观察细胞的水平扩散，同时提供富含氧气的培养基。在确定培养条件和组织方向后，为了实现良好成像，关键在于调节荧光标记效果与尽可能减少电子损伤和光损伤之间的矛盾...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金（Grant Number 15K06740）支持，授予 Y.W.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| NucleoBond Xtra Midi Plus EF | MACHEREY-NAGEL | 740422.5 | 无内毒素质粒DNA纯化试剂盒 |
| 20 ml 注射器 | TERUMO | SS-20ESZ | |
| 18号针头 | TERUMO | NN-1838R | |
| 快绿染料（Fast Green） | Wako | 061-00031 | |
| 100倍青霉素-链霉素溶液 | Gibco | 15140-122 | |
| 玻璃毛细管 | Narishige | G-1 | |
| 细胞培养小室 | Millipore | Millicell CM-ORG | |
| 层粘连蛋白（Laminin） | SIGMA | L2020 | 用于培养小室的包被 |
| 聚-L-赖氨酸（poly-L-Lysine） | Peptide Institute | 3075 | 用于培养小室的包被 |
| 玻璃底培养皿 | Matsunami | D11130H | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985-070 | 培养液 |
| F12培养基 | Gibco | 11765-054 | 培养液 |
| 胎牛血清 | Gibco | 12483 | 培养液 |
| 鸡血清 | Gibco | 16110082 | 培养液 |
| 10倍HBSS溶液 | Gibco | 14065-056 | |
| 显微外科手术刀 | Surgical specialties cooperation | 72-1501 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | |||
| 弯头剪刀 | AS ONE | No.11 | |
| 微量移液器拉制仪 | SUTTER INSTRUMENT | P97/IVF | |
| 镊子型电极 | BEX | LF646P3x3 | |
| 脉冲发生器 | BEX | CUY21EX | 电穿孔仪 |
| 荧光体视显微镜 | Leica | MZ16F | |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX81 | |
| 气体控制器 | Tokken | MIGM/OL-2 | |
| 温度控制器 | Tokai Hit | MI-IBC | |
| 激光共聚焦单元 | Olympus | FV300 |
参考文献
- Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
- Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
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重印与许可
