Method Article

发展中雏鸡光学顶盖中切向细胞迁移的可视化

DOI:

10.3791/58506

⸱

October 24th, 2018

 ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Embryology, School of Medicine, Fukushima Medical University

In This Article

Summary

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我们描述了通过电穿孔荧光标记切向迁移细胞的方法, 以及在扁平支架培养中标记细胞运动的延时成像, 以可视化发展中的小鸡光学顶盖的迁移细胞行为。.

Abstract

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延时成像是分析迁移细胞行为的有力方法。荧光细胞标记后, 可在影像显微镜下记录培养中标记细胞的运动。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移。但是, 可以从切片区域性方法获得有限信息, 以分析垂直于切片部分的单元迁移, 如切线单元迁移。在这里, 我们提出了延时成像的协议, 用于可视化发展中的小鸡光学顶盖中的切向细胞迁移。通过电穿孔蛋细胞标记的组合以及细胞培养插入物上的随后的扁平安装培养, 可以检测水平平面中的迁移细胞运动。此外, 我们的方法有助于检测单个细胞的行为和一组细胞在长期的集体行动。该方法可用于检测荧光标记微结构的序列变化, 包括非神经组织中神经组织或细胞移位的轴突伸长。

Introduction

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随着实时成像技术的进步, 细胞迁移研究也在不断发展。荧光细胞标记后, 在培养皿或体内标记细胞的时间运动可以记录在视频显微镜下。在神经发育研究中, 采用时移成像技术分析了移植细胞或伸长轴突的形态学变化。为了有效的成像, 在实验和分析的目的基础上, 应用合适的荧光细胞标记和组织制备方法是非常必要的。为了分析发育中大脑中的细胞迁移, 切片培养通常用于观察与切片部分平行的细胞迁移, 如径向细胞迁移1、2、3。切片培养系统也用于检测切向细胞迁移4,5, 但它不适合定向分析的情况下, 细胞分散垂直于切片部分。

光学顶盖由在胚胎发育过程中由径向和切向细胞迁移形成的多层结构组成。顶盖层的形成主要依赖于心室区分裂后神经元前体细胞的径向迁移, 其最终终点与心室区6的出生日期相关。对于切向迁移, 我们以前报告了发展中的小鸡光学顶盖中和表层的两个迁移流。在 E6-E8 期间的中层层中, 具有长前导过程和薄尾随过程的双极性细胞迁移背或腹侧沿顶盖传出轴突束运行手背-腹侧7。在 axophil....

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Protocol

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1。蛋电穿孔

  1. 制备高浓度荧光标记的表达质粒 DNA。根据制造商的协议 (材料表), 使用阴离子交换柱的碱性裂解法分离200毫升细菌培养物中的 DNA。混合 pCAGGS-EGFP 和 pCAGGS-mCherryNuc 在最终浓度为4µg/µL 每个。
    注: 无内毒素质粒 DNA 纯化可能是电穿孔的首选。
  2. 在70% 相对湿度下, 在38摄氏度水平下孵化出肥沃的鸡卵。
  3. 2.5 天后, 使用20毫升注射器与18针, 并用胶带密封针头孔, 从卵子的尖头上消除5毫升蛋白 (蛋清)。
  4. 用弯曲的剪刀切开蛋壳的顶端, 开一个直径2厘米的洞, 检查体视显微镜下胚胎的发育阶段 (汉堡包和汉密尔顿9的阶段 17)。用胶带封住孔。
    注意: 此步骤可在 E2.5 E3.0 期间的任何时间执行。步骤1.3 和1.4 降低卵子中胚胎的水平, 以避免将生长的胚胎和血管紧密附着到顶部壳体上。
  5. 继续孵育直到 E5.5。
  6. 在电穿孔前, 准备10µL 所述质粒 DNA 染色与0.5 µL 的快速绿色 (25 毫克/毫升), 10 毫升蒸压磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 含有青霉素 (100 单位/毫升) 和链霉素 (100 微克/毫升), 和微由使用微量吸管处理器的玻璃毛细管管。切断微量吸管的远端尖端, 根据注射的 DNA 量, 使合适的孔隙大....

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Results

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图 2显示了在记录开始后, 在经过一段时间 (0、9、18、27 h) 的平面安装培养中可视化的表面切向偏移。电影1是一段10分钟的延时电影, 间隔时间为28小时和50分钟。选择该框架的目的是聚焦从帧的左下角到未标记空间的迁移单元格 (图 3A)。迁移细胞 (GFP; 左上面板,电影 1) 及其原子核 (mCherry-Nuc; 右上面板) 的质量运动可以用合并后的影片 (下面板,电影 1) 观察。细胞迁移的方向性可以通过聚焦从标记中心到所有方向的分散细胞来检查 (电影 2,图 3B)。

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Discussion

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上述协议针对浅层6、8中的细胞迁移进行了优化。它适用于检测中间层迁移流 (电影 5)6,7, 只是通过改变电穿孔的时间 (E5.5 到 E4.5) 和文化和成像的起始 (E7.0 到 E6.0)。

所提出的程序由蛋、扁平安装培养和时移共聚焦成像 (图 1)中的电穿孔的细胞标记组成。首先, 必须对培养条件进行优化, 使组织保持健康, 并在体内正常生长。这也是至关重要的, 以确保组织的方向是适合检测细胞迁移。为此, 我们在细胞插入上应用一种扁平的培养, 这有助于观察水平细胞的分散, 并提供富含高氧的培养基。在保证了培养条件和定位的前提下, 利用最小的电子和照片损伤来调整更好的荧光标签的冲突条件.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此工作由 jsp KAKENHI 授予编号15K06740 支持 Y.W。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
材料
NucleoBond Xtra Midi Plus EFMACHEREY-NAGEL740422.5无内毒素质粒 DNA 纯化试剂盒
20 ml 注射器TERUMOSS-20ESZ
18 号针头TERUMONN-1838R
Fast GreenWako061-00031
100x青霉素和链霉素Gibco15140-122
玻璃毛细管NarishigeG-1
细胞培养插入物MilliporeMillicell CM-ORG
层粘连蛋白SIGMAL2020培养插入物涂层
聚-L-赖氨酸肽研究所3075培养插入
玻璃底培养皿MatsunamiD11130H
Opti-MEMGibco31985-070培养基
F12Gibco11765-054培养基
牛血清Gibco12483培养基
血清Gibco16110082培养基
10xHBSSGibco14065-056
显微手术刀外科专业合作72-1501
名称公司目录号评论
设备
弯曲剪刀AS ONENo.11
微量移液器处理器SUTTER INSTRUMENTP97/IVF
镊子式电极BEXLF646P3x3
脉冲发生器BEXCUY21EX电穿孔仪
荧光立体显微镜徕卡MZ16F
倒置荧光显微镜奥林巴斯IX81
气体控制器TokkenMIGM/OL-2
温度控制器Tokai HitMI-IBC
激光共焦装置OlympusFV300
涂层胎鸡

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time ima....

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